第7章蛋白質分離純化與表征

1、一種蛋白質的混合物在pH6的DEAE-纖維素柱中被分離，用pH6稀鹽緩沖液可以洗脫C，用pH6的高鹽緩沖液，B和A依次被洗脫，用凝膠過濾測定得A的Mr 是240000，B的Mr是120000，C的Mr是60000。但SDS-PAGE只發(fā)現(xiàn)一條帶。請分析實驗結果 DEAE-纖維素柱層析的結果說明，在pH6的條件下，A帶有較多的負電荷，B次之，C帶負電荷最少。凝膠過濾法測出A的Mr是C的4倍，B的Mr是C的2倍，但SDS-PAGE只發(fā)現(xiàn)一條帶。由于SDS-PAGE測定的亞基的Mr，凝膠過濾法可以測定寡聚體的Mr，可以推斷C是單體，B是以C為亞基的二聚體，A是以C 為亞基的4聚體，由于C在pH6時帶

2、負電荷，隨著亞基數(shù)的增加，帶負電荷的量也會增加，這與DEAE-纖維素層析的結果也是一致的。 蛋白質分離純化是利用其特性的差異蛋白質分離純化是利用其特性的差異 分子的大小和形狀分子的大小和形狀 酸堿性質酸堿性質 溶解度溶解度 吸附性質吸附性質 對配體分子的特異生物學親和力對配體分子的特異生物學親和力蛋白質純化應根據(jù)研究工作和生產的具體目的和要求，蛋白質純化應根據(jù)研究工作和生產的具體目的和要求，制訂分離純化的合理程序。制訂分離純化的合理程序。 蛋白質蛋白質含有酸含有酸/ /堿堿AAAA殘基殘基具有兩性具有兩性 堿堿/ /酸酸越大越大pIpI 越大越大 pI通常在通常在 6.0 左右左右一、蛋白質的

3、酸堿性質 蛋白質的分子量蛋白質的分子量 一般在一萬至一百萬一般在一萬至一百萬道爾頓道爾頓之間之間 1道爾頓道爾頓1C12絕對質量絕對質量/12 1.6610-27千克千克二、蛋白質分子的大小與形狀二、蛋白質分子的大小與形狀測定蛋白質相對分子質量的原理和方法測定蛋白質相對分子質量的原理和方法（一）（一） 根據(jù)化學組成測定最低相對分子質量根據(jù)化學組成測定最低相對分子質量（二）（二） 沉降分析法測定相對分子質量沉降分析法測定相對分子質量（三）（三） 凝膠過濾法測定相對分子質量凝膠過濾法測定相對分子質量（四）（四） SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子質聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子質量量（

4、一）根據(jù)化學組成測定最小分子量（一）根據(jù)化學組成測定最小分子量1 1、測定蛋白質中某一微量元素的含量、測定蛋白質中某一微量元素的含量2 2、假設蛋白質中僅含一個鐵原子、假設蛋白質中僅含一個鐵原子最低相對分子質量最低相對分子質量= 100* 55.8/鐵的百分含量鐵的百分含量例如肌紅蛋白含鐵量為例如肌紅蛋白含鐵量為0.335%，那么其最低相對，那么其最低相對分子質量就是分子質量就是55.8/0.335 100 = 16700（二）（二）沉降分析法沉降分析法 蛋白質分子在溶液中受到強大的離心蛋白質分子在溶液中受到強大的離心作用時，由于比重的關系，蛋白質分子作用時，由于比重的關系，蛋白質分子就會沉降

5、，這就是蛋白質的沉降作用。就會沉降，這就是蛋白質的沉降作用。 沉降的速率與蛋白質分子大小和密度有關，因此利用沉降速率來測定蛋白質的相對分子質量。沉降系數(shù)：沉降系數(shù)：把物質在單位（厘米）離心場的沉降速率稱沉降系數(shù)（把物質在單位（厘米）離心場的沉降速率稱沉降系數(shù)（S）（三）凝膠過濾法測定相對分子質量（三）凝膠過濾法測定相對分子質量蛋白質分子通過凝膠柱的速度并不取決于分子的質量，而是它的斯托克半經。如果某種蛋白質與一理想的非水化球體過柱速度相同，則認為具有與該球體相同的半徑，稱斯托克半徑蛋白質混合樣蛋白質混合樣w 標準蛋白質（已知標準蛋白質（已知Mr和斯托克半徑）和待測和斯托克半徑）和待測蛋白質必須

6、具有相同的分子形狀（接近球形）蛋白質必須具有相同的分子形狀（接近球形）LogMLogMA AB BC CLogMLogM測測V V測測蛋白質通過凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子蛋白質通過凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關：量有關： LogM LogM Ve VeVe洗脫體積，自樣品開始洗洗脫體積，自樣品開始洗脫到該組分的洗脫峰（峰頂）脫到該組分的洗脫峰（峰頂）出現(xiàn)時所流出的體積。出現(xiàn)時所流出的體積。先測得幾種標準蛋白質的先測得幾種標準蛋白質的VeVe，并以其分子量對數(shù)對，并以其分子量對數(shù)對VeVe作圖得一直線，再測出作圖得一直線，再測出待測樣品的待測樣品的VeVe，查標準曲，查標準曲線即可確定

7、分子量。線即可確定分子量。葡葡聚糖凝膠過濾法聚糖凝膠過濾法（四）（四）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法（最常用）（最常用）蛋白質顆粒在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，蛋白質顆粒在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于：它的遷移率取決于：w所帶電荷所帶電荷w分子量分子量w分子形狀分子形狀但是如果在該系統(tǒng)中添加SDS和少量巰基乙醇，則蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于它的相對分子質量。 SDSSDS（十二烷基硫酸鈉）一種陰離子去污劑，（十二烷基硫酸鈉）一種陰離子去污劑，作為變性劑破壞分子內的疏水作用和氫鍵。作為變性劑破壞分子內的疏水作用和氫鍵。 目前測定亞基分子量的最好辦法。目前測定亞基分子

8、量的最好辦法。蛋白質電泳實驗技術郭堯君編著蛋白質電泳實驗技術郭堯君編著 科學出版社科學出版社SDSboiling均勻帶上一層負電荷所有的SDS-蛋白質復合體有相同的荷質比亞基構象改變，SDS-蛋白質復合體為棒狀由于不同的由于不同的SDS-蛋白質復合體具蛋白質復合體具有相同的荷質比和相同的構象，有相同的荷質比和相同的構象，因此因此遷移率不受原有的電荷、分子形狀的遷移率不受原有的電荷、分子形狀的影響，只取決于分子量。影響，只取決于分子量。原態(tài)蛋白質 肽鏈伸展肽鏈伸展且且SDS 以其烴鏈與蛋白質分子的側鏈以其烴鏈與蛋白質分子的側鏈結合，每克蛋白可結合結合，每克蛋白可結合1.4克克SDS，相，相當于每

9、兩個氨基酸殘基結合一個當于每兩個氨基酸殘基結合一個SDS。棒狀三、蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀三、蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀（一）（一）膠體性質膠體性質（colloidal system）膠體溶液的特點：膠體溶液的特點：w分子直徑在分子直徑在1-100 nm1-100 nm內內w溶于水溶于水w不易聚集沉淀不易聚集沉淀大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液如：NH3、COO 、OH、-SH、-CONH-等，它們都具有高度的親水性，當與水接確時，極易等，它們都具有高度的親水性，當與水接確時，極易吸附水分子，使蛋白質顆粒外圍形成一層水化膜，將吸附水分子，使

10、蛋白質顆粒外圍形成一層水化膜，將顆粒彼此隔開，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。顆粒彼此隔開，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。蛋白質的水溶液能形成穩(wěn)定的親水膠體的原因：蛋白質的水溶液能形成穩(wěn)定的親水膠體的原因：、蛋白質多肽鏈上含有許多極性基團。、蛋白質多肽鏈上含有許多極性基團。 2、蛋白質是兩性電解質，在非等電狀態(tài)時，相、蛋白質是兩性電解質，在非等電狀態(tài)時，相同蛋白質顆粒帶有同性電荷，同蛋白質顆粒帶有同性電荷，與周圍的反離子構成與周圍的反離子構成穩(wěn)定的穩(wěn)定的雙電層雙電層。使蛋白質顆粒之間相互排斥，保持使蛋白質顆粒之間相互排斥，保持一定距離，不致互相凝聚而沉淀。一定距離，不致互相凝聚而沉淀。 +帶正電荷的蛋白

11、質帶正電荷的蛋白質蛋白質溶液由于具有蛋白質溶液由于具有水化層水化層與與雙電層雙電層兩方面的穩(wěn)定因素，所兩方面的穩(wěn)定因素，所以作為膠體系統(tǒng)是相對穩(wěn)定的。以作為膠體系統(tǒng)是相對穩(wěn)定的。蛋白質膠體性質的應用蛋白質膠體性質的應用 由于膠體溶液中的蛋白質不能通由于膠體溶液中的蛋白質不能通過過半透膜半透膜，因此可以應用透析法將，因此可以應用透析法將非蛋白的小分子雜質除去。非蛋白的小分子雜質除去。透析法：透析法：以半透膜提純蛋白質的方以半透膜提純蛋白質的方法叫透析法法叫透析法半透膜：半透膜：只允許溶劑小分子通過，只允許溶劑小分子通過，而溶質大分子不能通過，如羊皮紙、而溶質大分子不能通過，如羊皮紙、火棉膠、玻璃

12、紙等火棉膠、玻璃紙等 如果破壞這如果破壞這兩個因素，蛋兩個因素，蛋白質溶液會出白質溶液會出現(xiàn)什么現(xiàn)象？現(xiàn)什么現(xiàn)象？+帶正電荷的蛋白質帶正電荷的蛋白質（二）蛋白質的（二）蛋白質的沉淀沉淀 Pr從膠體溶液中析出從膠體溶液中析出任何破壞穩(wěn)定蛋白質溶液的因素都可能使蛋白質沉淀任何破壞穩(wěn)定蛋白質溶液的因素都可能使蛋白質沉淀I I 可逆沉淀可逆沉淀溫和溫和條件，改變溶液條件，改變溶液pH或或Pr所所帶電荷帶電荷 Pr結構和性質沒有變化結構和性質沒有變化適當條件下可適當條件下可重新溶解重新溶解 非變性沉淀非變性沉淀 可逆沉淀是分離和純化蛋白質的基本方法，可逆沉淀是分離和純化蛋白質的基本方法，如如等電點沉淀法

13、、鹽析法和有機溶劑沉淀法等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。等。 不可逆沉淀不可逆沉淀 強烈強烈沉淀條件沉淀條件 破壞破壞Pr膠體溶液膠體溶液穩(wěn)定性穩(wěn)定性 也破壞也破壞Pr結構和性質結構和性質 沉淀沉淀不能再重新溶解不能再重新溶解變性沉淀變性沉淀 如如加熱沉淀、強酸加熱沉淀、強酸/ /堿沉淀、重金屬鹽堿沉淀、重金屬鹽 和生物堿沉淀和生物堿沉淀等等1. 鹽析 在蛋白質的水溶液中，加入大量在蛋白質的水溶液中，加入大量高濃度的高濃度的強電解強電解質鹽質鹽如硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，如硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，可破壞蛋白質可破壞蛋白質分子表面的水化層，中和它們的電荷分子表面的水化層，中和它們的電荷

14、，因而使蛋白，因而使蛋白質沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為質沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析鹽析。 而而低濃度低濃度的鹽溶液加入蛋白質溶液中，會導致蛋的鹽溶液加入蛋白質溶液中，會導致蛋白質的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為白質的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶鹽溶。鹽析的機理鹽析的機理： 破壞蛋白質的水化膜，中和表面的凈電荷破壞蛋白質的水化膜，中和表面的凈電荷。鹽析法是最常用的蛋白質沉淀方法，該方法不會使鹽析法是最常用的蛋白質沉淀方法，該方法不會使蛋白質產生變性蛋白質產生變性。如：微生物發(fā)酵酶制劑如：微生物發(fā)酵酶制劑 各種蛋白質的親水性及荷電性均有差別，因此不各種蛋白質的親水性及荷電性均有差別，因此不同蛋白質所需中性鹽濃度也

15、有不同，只要調節(jié)中性同蛋白質所需中性鹽濃度也有不同，只要調節(jié)中性鹽濃度，就可使混合蛋白質溶液中的幾種蛋白質分鹽濃度，就可使混合蛋白質溶液中的幾種蛋白質分散沉淀析出，這種方法稱為散沉淀析出，這種方法稱為分段鹽析分段鹽析。 等電點沉淀的蛋白質溶液中等電點沉淀的蛋白質溶液中加入加入NaCl后沉后沉淀溶解淀溶解鹽溶鹽溶 原因？原因？鹽溶鹽溶分子在等電點時，相互吸引，聚合沉淀，分子在等電點時，相互吸引，聚合沉淀，加入少加入少量鹽離子量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中溶于水中鹽溶2. 有機溶劑沉淀法： 在蛋白質溶液中，加入能與水互溶的在蛋白質溶液中，加入能與水

16、互溶的有機溶劑如有機溶劑如乙醇、丙酮乙醇、丙酮等，蛋白質產生等，蛋白質產生沉淀。沉淀。有機溶劑沉淀法的機理有機溶劑沉淀法的機理： 破壞蛋白質的水化膜以及降低介電常數(shù)而增破壞蛋白質的水化膜以及降低介電常數(shù)而增加帶電質點間的相互作用加帶電質點間的相互作用。注意：注意：有機溶液沉淀蛋白質通常在有機溶液沉淀蛋白質通常在低溫低溫條件下進行，否則有機溶劑與水互溶產條件下進行，否則有機溶劑與水互溶產生的溶解熱會使蛋白質產生變性。生的溶解熱會使蛋白質產生變性。3.弱酸或弱堿沉淀法(等電點沉淀） 用弱酸或弱堿調節(jié)蛋白質溶液的用弱酸或弱堿調節(jié)蛋白質溶液的pH處處于等電點處于等電點處，使蛋白質沉淀。使蛋白質沉淀。弱

17、酸或弱堿沉淀法機理弱酸或弱堿沉淀法機理： 破壞蛋白質表面凈電荷，蛋白質分子帶有相破壞蛋白質表面凈電荷，蛋白質分子帶有相同數(shù)量的正負電荷，因此，蛋白質分子相互吸同數(shù)量的正負電荷，因此，蛋白質分子相互吸引，從而聚集沉淀。引，從而聚集沉淀。酸酸酸酸堿堿堿堿堿堿酸酸溶液中蛋白質的聚沉溶液中蛋白質的聚沉4.重金屬鹽沉淀(條件：pH 稍大于pI為宜) 當當pH 稍大于稍大于pI時，時，蛋白質顆粒帶負電荷這蛋白質顆粒帶負電荷這樣就容易與重金屬離子結合成不溶性鹽而樣就容易與重金屬離子結合成不溶性鹽而沉沉淀。淀。重金屬沉淀法的機理重金屬沉淀法的機理：重金屬鹽加入之后，與帶負電的羧基結合重金屬鹽加入之后，與帶負電

18、的羧基結合。 例如：例如：“牛奶解毒，汞消毒牛奶解毒，汞消毒”5.生物堿試劑沉淀法（條件：pH稍小于pI） 生物堿生物堿是植物組織中具有顯著生理作用的一類是植物組織中具有顯著生理作用的一類含氮含氮的堿性物質。的堿性物質。 能夠沉淀生物堿的試劑稱為能夠沉淀生物堿的試劑稱為生物堿試劑生物堿試劑。生物生物堿試劑一般為堿試劑一般為弱酸性物質弱酸性物質，如單寧酸、苦味酸、三，如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等。氯乙酸等。 生物堿試劑沉淀蛋白質的機理生物堿試劑沉淀蛋白質的機理： 在酸性條件下，蛋白質帶正電，可以與生物堿試在酸性條件下，蛋白質帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結合而產生沉淀劑的酸根離子結合而產生沉

19、淀。 例如：例如：“柿石癥，啤酒澄清柿石癥，啤酒澄清”6.加熱變性沉淀法 幾乎所有的蛋白質都因加熱變性而凝幾乎所有的蛋白質都因加熱變性而凝固固。少量鹽促進蛋白質加熱凝固少量鹽促進蛋白質加熱凝固。 當?shù)鞍踪|處于等電點時，加熱凝固最當?shù)鞍踪|處于等電點時，加熱凝固最完全和最迅速完全和最迅速. 如：如：煮雞蛋煮雞蛋 酶的制備：酶的制備：超氧化物歧化酶的提取超氧化物歧化酶的提取原因：天然結構解體，疏水基外露，原因：天然結構解體，疏水基外露， 破壞水化層及帶電狀態(tài)破壞水化層及帶電狀態(tài)四、蛋白質分離純化的一般原則總目標：增加制品純度或比活總目標：增加制品純度或比活1.1.前處理：因動前處理：因動/ /植物植

20、物/ /細菌而異細菌而異2.2.粗分級分離：采用鹽析粗分級分離：采用鹽析/ /等電點沉淀等電點沉淀/ /有機溶劑分級分離等方法有機溶劑分級分離等方法3.3.細分級分離：采用凝膠過濾、離子交細分級分離：采用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等換層析、吸附層析以及親和層析等4.4.結晶是最后步驟結晶是最后步驟五、蛋白質的分離純化方法（一）根據(jù)根據(jù)分子大小不同分子大小不同的純化方法的純化方法 1、透析和超過濾、透析和超過濾w利用蛋白質分子不能透過半透膜將其利用蛋白質分子不能透過半透膜將其 與小分子物質分開與小分子物質分開w半透膜為玻璃紙或纖維素材料半透膜為玻璃紙或纖維素材料血液透析血液透析

21、小分子溶出小分子被帶出小分子被帶出透析機透析機透析液透析液加加壓壓血液血液2 2、密度梯度（區(qū)帶）離心、密度梯度（區(qū)帶）離心用一定的介質（如蔗糖）在離心管內形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將蛋白質混合液置于介質的頂部，通過重力或離心力場的作用使蛋白質分層、分離。 3、凝膠過濾、凝膠過濾3. 凝膠過濾（二）利用溶解度差別的純化方法（二）利用溶解度差別的純化方法 1. 1.等電點沉淀等電點沉淀 調整溶液調整溶液pH 不同蛋白在各自不同蛋白在各自 pI處依次沉淀處依次沉淀 2.2.鹽溶和鹽析鹽溶和鹽析3.3.有機溶劑分級分離法有機溶劑分級分離法w降低介電常數(shù)降低介電常數(shù)w爭奪水化膜爭奪水化膜影響溶解度的外部因素有：pH值、離子強度、介電常數(shù)和溫度。4. 溫度對蛋白質溶劑度的影響溫度對蛋白質溶劑度的影響（三（三) )根據(jù)電荷不同的分離方法根據(jù)電荷不同的分離方法1.1.電泳電泳原理：原理： 蛋白質在非等電點時所帶總電荷不為蛋白質在非等電點時所帶總電荷不為0 0 分子大小不同，電場中移動速度也不同分子大小不同，電場中移動速度也不同平板電泳平板電泳等電聚焦電泳等電聚焦電泳雙向電泳雙向電泳離子交換層析離子交換層析（四）利用蛋白質選擇性吸附的性質（四）利用蛋白質選擇性吸附