冰凍切片切片RNA FISH方法及詳細(xì)步驟

1、冰凍切片切片RNAFISH方法及詳細(xì)步驟1.檢測(cè)理RNA熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization)，簡(jiǎn)稱為RNAFISH，是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。傳統(tǒng)的RNAFISH，直接在oligos上標(biāo)記熒光素，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，與待檢測(cè)的RNA特異結(jié)合，通過(guò)熒光顯微鏡以檢測(cè)熒光信號(hào)，該方法一般需要20個(gè)oligos以上，以便檢測(cè)到較強(qiáng)較多的熒光信號(hào)點(diǎn)。本系統(tǒng)中SA（鏈霉親和素蛋白）是一類四聚體蛋白，大小為66KDa，每一分子SA能夠與四分子生物素進(jìn)行高度特異性的結(jié)合，且兩者之間的親和力較強(qiáng)。應(yīng)用該原理，我們將染料Cy3偶聯(lián)到SA蛋白上，一分子SA能偶聯(lián)上

2、6個(gè)Cy3；同時(shí)在探針上標(biāo)記生物素，將兩者在體外進(jìn)行親和連接，大約每個(gè)SA能與4條oligoBiotin結(jié)合，每個(gè)SA上有6個(gè)Cy3，也就是每一條探針上連接了6個(gè)Cy3，因此該方法具有一定的放大信號(hào)的作用。1. 具體步驟：1）復(fù)水冰凍切片取出，每張切片滴加BufferB100卩，室溫放置15min（使組織細(xì)胞恢復(fù)活性）；2）吸棄BufferB，PBS洗切片兩次，每次5min（建議在染缸中進(jìn)行）。2. 蛋白酶K消化1）蛋白酶K工作液預(yù)熱至37°C；2）每張切片滴加蛋白酶K工作液100卩1，37°C孵育20min（消化時(shí)間請(qǐng)根據(jù)不同樣本進(jìn)行調(diào)整）；3）吸棄蛋白酶K，每張切片滴加

3、100卩1lx封閉液，37度30min；4）吸棄1X封閉液，每張切片滴加100m2xBufferC在室溫下漂洗切片3-3oeHi£°（H91-31MSSWgT3o££尋阜w習(xí)船觀刃馬網(wǎng)至EOOl曲耿巨蠱匹程主導(dǎo)）49121MS3o££7出祁匹程囚削壬畐（9【出卑型出卑田出逆黑丁黑'翌呂國(guó)目旳図馬網(wǎng)歪E001曲耿出酸羽鶯出酸畐訊丞W'尊睡男軟（$【E國(guó)3冋尹日E06業(yè)翌助工目旳E01駁丁坯（V【皤l：8T：1zT：L1：1皿同i鋼祁日£3-VS吐憐旳舌翰軌章誣涮jb）uiui0£L£%HdE

4、8+£3-VST/【ounilEl+sqoid-upoiqq/iouirl【pil脂7麥剌pi01幻）S9dlYtffl鋼每f£X3-VS呂馬逐uiuioi刃夠怒W“71"詢l吏餾翌細(xì)帰輻：型呦工屜晦（£-助蟄曜蚩歐纟笛礙'003-壬馬翱采礙馬慕B馬飛氐蜃翌馬劉申1/1°001電歸哥里劃脂馬E嚮WDdsaBM川厶"YDC出晉儒附士目旳ao鶯丑iM'li巾=09乙ao®owu:皿同'093ao/qoniu:糜摩竺均丁由旱緲華聲專墾摩叵:SS+Bf（3-簞藝豊臬吏出0£3o££

5、;丑咚醉32Jjn日（【彌P°（馬飛出）啻仕申皿'口凹3他'*珊%001、06、08'%0厶星*雖哥謝（£5凹8縣繩DoW1001翌環(huán)歪慚誣聊耿出酸羽鶯（3【型殊!罡晞?wù)_Do8£（I2）輕輕去掉蓋玻片，吸棄雜交溶液，每張切片滴加預(yù)熱的雜交后水洗溶液100卩1洗切片15min；）每張切片滴加2xBufferC100卩1,0口洗3次，每次10min；4）吸棄2xBufferC，每孔加入100卩1的2xBufferC，置于37洗滌10min，洗滌3次。（如果背景深時(shí)，建議適當(dāng)提高洗滌溫度及次數(shù)）6.細(xì)胞核染色1）每張切片加100卩1稀釋好的DAPI工作液，在室溫下避光孵育10-20min（根據(jù)樣本的種類，建議適當(dāng)調(diào)整DAPI的