生物化學課本課后練習題

1、第一章1.簡述酶與一般催化劑的共性以及作為生物催化劑的特點 共同點：只能催化熱力學所允許的的化學反應，縮短達到化學平衡的時間，而不改變平衡點：反應前后酶本身沒有質和量的改變：很少量就能發(fā)揮較大的催化作用：其作用機理都在于降低了反應的活化能。 酶作為生物催化劑的特點：1.極高的催化率；2.高度專一性；3.酶活的可調節(jié)性；酶的不穩(wěn)定性。2.簡述酶的結構與功能之間的關系 3.簡述米氏方程的概念機意義4.舉例說明抑制反應動力學的特點及實際意義 5.酶失活的因素和機理。 酶失活的因素主要包括物理因素，化學因素和生物因素物理因素1熱失活：熱失活是由于熱伸展作用使酶的反應基團和疏水區(qū)域暴露，促使蛋白質聚合。

2、2冷凍和脫水：很多變構酶在溫度降低是會產生構象變化。在冷凍過程中，溶質（酶和鹽）隨著水分子的結晶而被濃縮，引起酶微環(huán)境中的pH和離子強度的劇烈改變，很容易引起蛋白質的酸變性。3.輻射作用：電離輻射和非電離輻射都會導致多肽鏈的斷裂和酶活性喪失。4.機械力作用：化學因素1.極端pH：極端pH遠離蛋白質的等電點，酶蛋白相同電荷間的靜電斥力會導致蛋白肽鏈伸展，埋藏在酶蛋白內部非電離殘基發(fā)生電離，啟動改變。交聯(lián)或破壞氨基酸的化學反應，結果引起不可逆失活。極端pH也容易導致蛋白質水解。2.氧化作用：酶分子中所含的帶芳香族側鏈的氨基酸以及Met, Cys等，與活性氧有極高的反應性，極易受到氧化攻擊。3.聚合

3、作用：加熱或高濃度電介質課破壞蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性，促使蛋白質結構發(fā)生改變，分子間聚合并沉淀。4.表面活性劑和變性劑：表面活性劑主要改變酶分子正常的折疊，暴露酶分子疏水內核的疏水基團，使之變性；變性劑與酶分子結合，改變其穩(wěn)定性，使之發(fā)生變性。生物因素微生物或蛋白水解酶的作用使酶分子被水解。6.簡述酶活力測定方法的原理 直接測定法：有些酶促反應進行一段時間后，酶底物或產物的變量可直接檢測。 間接測定法：有些酶促反應的底物或產物不易直接檢測，一次必須與特定的化學試劑反應，形成穩(wěn)定的可檢測物。酶偶聯(lián)測定法：與間接測定法相類似，只是使用一指示酶，使第一酶的產物在指示酶的作用下轉變成可測定的新產物。

4、第二章1.在酶制劑工業(yè)生產中為什么以微生物發(fā)酵生產為主？ 應用微生物來開發(fā)酶有下列優(yōu)點：1.微生物生長繁殖快，生活周期短。2.微生物種類繁多。3.當基因工程介入時，動植物細胞中存在的酶，幾乎都能夠利用微生物細胞獲得。2.影響酶制劑發(fā)酵的因子有哪些？ 培養(yǎng)基的成分，發(fā)酵條件，發(fā)酵方法。 3，酶制劑發(fā)酵生產的方法有哪些？各有何優(yōu)勢？ 固體培養(yǎng)法：（轉桶法，厚層通氣法）。優(yōu)點：1.單位體積培養(yǎng)設備中的產酶量高；2節(jié)省動力；3由污染引起的問題少，易于管理；4.酶抽提液的濃度可任意調節(jié)；5.后處理設備小。 液體深層培養(yǎng)法。優(yōu)點：設備占地面積小、生產可以機械化，自動化。4.如何提高酶的產量？ 1.添加產酶

5、促進劑；2.菌種誘變；（生產組成型酶突變株的篩選，抗分解代謝阻遏突變株的選育，抗反饋阻抑突變株的篩選）。第三章1與微生物相比，動植物細胞有什么特點？ 動植物細胞比微生物大；植物細胞的生長速率和代謝速率比微生物低，生長倍增時間，生長周期較微生物長；大多數(shù)植物細胞需要光照；各種細胞用于生產的主要目的產物各不同。 動物細胞無細胞壁，細胞適應環(huán)境能力差；大部分動物細胞在機體內相互粘連以集群形式存在，在細胞培養(yǎng)中大部分細胞具有群體效應、錨地依賴性、接觸抑制性以及功能全能性。2從植物細胞培養(yǎng)產酶的特點分析，為什么與植物體產酶比植物細胞產酶更有優(yōu)勢？1. 次生物質的生產是在可控制的條件下進行的，因此可以通過

6、改變培養(yǎng)條件和篩選細胞系來提高次生代謝產物的產率2. 培養(yǎng)細胞是在無菌條件下進行的，因此可以排除病菌和蟲害的影響，以及環(huán)境中的有害物質污染，從而提高產品質量。3. 植物細胞的倍增時間一般為1260h，發(fā)酵周期為1030d，與植物生長周期相比，大大縮短了生產周期。4. 可以進行特定的生化轉化反應和探索新的合成路線，以獲得新的有用物質。3用于產酶的植物細胞的來源有哪些？ 1直接從外植體中分離得到；2通過誘導愈傷組織而獲得；3分離原生質體后再經(jīng)過細胞壁再生而獲取所需的植物細胞。4動物細胞培養(yǎng)前都需要做哪些準備工作？ 1基質的準備 2 培養(yǎng)環(huán)境的準備【營養(yǎng)物質，細胞的生產環(huán)境（溫度，氣相，pH，滲透壓

7、）】 3 細胞的準備（原代細胞培養(yǎng)，傳代細胞培養(yǎng)）5根據(jù)細胞在培養(yǎng)基中的位置不同，動物細胞的培養(yǎng)方式有哪些？ 1 貼壁培養(yǎng)，2 懸浮培養(yǎng)，3 微載體培養(yǎng)系統(tǒng)，4 包埋培養(yǎng)，5 微囊化培養(yǎng)。第四章 現(xiàn)代分子技術產酶1 什么是克隆酶？試述克隆酶生產的基本過程。 克隆酶：利用DNA重組技術而大量生產的酶，稱克隆酶。 克隆酶生產的基本過程：1 目的基因的獲得；2 載體的選擇；3 目的基因與載體分子的連接（黏性末端，平末端的連接）；4 重組DNA的轉化；5 克隆酶基因的表達（原核生物，真核生物的表達系統(tǒng)）2 什么是基因的定點誘變技術？目前已建立的定點誘變方法主要有哪些？ 定點誘變技術：通過取代、插入或缺

8、失克隆基因或DNA序列中的任何一個特定的堿基，從而實現(xiàn)心中體外特異性改變某個基因，這種技術稱為定點突變技術。已建立的定點誘變方法主要有盒式誘變、寡核苷酸引物誘變、PCR誘變3 什么是抗體酶？抗體酶的制備的方法主要有哪些？ 抗體酶：抗體酶是一類免疫系統(tǒng)產生的、具有催化活性的抗體?？贵w酶的制備方法：拷貝法；引入法；誘導法；抗體庫法。4 簡述進化酶、核酸酶、雜合酶、超自然的酶新酶，人工合成全酶、人工半合成酶以及印跡酶的概念及研究進展。 進化酶：在體外模擬自然進化過程（隨機突變、基因重組、定向選擇或篩選），使基因發(fā)生多種變異，最后定向選擇或篩選出所需性質或功能的酶，該策略稱為酶分子的非合理設計。把通過

9、此方法得到的酶稱為進化酶。研究進展：核酸酶：具有生物催化功能的核酸分子（RNA,DNA）。研究進展;雜合酶：把來自不同酶分子中的結構單元或是整個酶分子進行組合或交換，可以產生具有所需性質的優(yōu)化酶雜合體。把通過這種途徑產生的酶稱為雜合酶。研究進展：新酶：至用蛋白質工程技術設計新的酶的結構基因，進而生產自然界從未有過的性能穩(wěn)定、活性高的酶。研究進展：人工全合成酶：這類人工酶不是蛋白質，而是有機化合物，通過并入酶的催化基團來控制空間的構象，像自然酶那樣能選擇性地催化化學反應。研究進展：人工半合成酶：以天然蛋白質或酶為母體，用化學或生物方法引進適當?shù)幕钚圆课换虼呋鶊F，或改變其結構，從而形成一種新的人

10、工酶。研究進展：印跡酶：指通過分子印跡技術產生類似于酶的活性中心的空腔，對底物產生有效的結合與催化作用的人工模擬酶。研究進展：第五章 酶的分離純化1簡述酶分離純化方法及工藝程序的選擇策略。（1）先選用非特異的、低分辨的技術，去除主要的雜質并使酶溶液濃縮；如沉淀、超濾和吸附等。（2）隨后采用高效分離的手段；如離子交換層析、親和層析。（3）將最昂貴、最費時的分離單元放在最后階段。如凝膠過濾層析。2如何對酶分離純化方法及工藝程序的優(yōu)劣進行評價？ 一個完整的酶制備方案包括酶測定方法的建立、材料的選擇、預處理對酶性質的初步探索、制定酶的純化程序、酶成品的保存。評價分離純化方法及工藝程序優(yōu)劣的指標：1總活

11、力的回收率2純化倍數(shù)：比活力提高的倍數(shù)因此在酶的分離純化過程中必需測定每一步的酶液體積（mL）、蛋白含量（mg/mL）、酶活（U/mL).3破碎細胞有哪些方法？試述它們的優(yōu)，缺點及適用對象。 （一）機械破碎：通過機械運動產生的剪切力，使組織、細胞破碎。 1.搗碎法 利用搗碎機高速旋轉葉片所產生的剪切力將組織破碎。 適用于動物內臟、植物葉芽等比較脆嫩的組織 及微生物，特別是細菌的破碎。 在實驗室和規(guī)模生產均可采用。2.研磨法 利用研磨產生的剪切力將細胞破碎。 此法適用于微生物和植物組織細胞的破碎。 研缽、細菌磨用于實驗室使用，石磨、球磨用于工業(yè)化生產。 研磨法設備簡單，但效率較低3.勻漿法 利用

12、勻漿器、高壓勻漿機產生的剪切力將組織 破碎。 通常用來破碎那些易于分散、比較柔軟、顆粒細小的組織細胞。非常適合細菌、真菌的破碎。 適用于實驗室，但難于在工業(yè)生產上應用。 此法破碎程度高，對酶的破壞較少。（二）溫度差破碎法 通過溫度的突然變化使細胞破碎。 該方法對那些較為脆弱、易于破碎的細胞有較好 的破碎效果。 此法適用于實驗室，但難于工業(yè)化生產。 不能在過高溫度下操作，以免引起酶的變性失活。該法簡單易行，但效率不高，常需反復幾次才能達到預期目標。（三）壓力差破碎法：通過壓力的突然變化使細胞破碎。 1.高壓沖擊法 在容器中再裝入細胞和冰晶、石英砂，用活塞或沖擊錘施以高壓沖擊，從而使細胞破碎。 2

13、.突然降壓法 將細胞懸浮液裝進高壓容器中，加壓至30MPa以上，打開出口閥門，使細胞懸浮液經(jīng)閥門迅速流出。從而使細胞迅速膨脹而破碎。也可采用N2或CO2加壓到550MPa，然后突然排除氣體，壓力驟減，使細胞破碎。 3.滲透壓差法 利用滲透壓的變化使細胞破碎。不適用于具有堅韌的多糖細胞壁的細胞。（四）超聲波破碎法 在高于20kHz的超聲波的作用下，使細胞膜產生空穴作用而使細胞破碎。該法適用于微生物細胞的破碎。 該法適用于實驗室使用，具有簡便、快捷、效果好等優(yōu)點。 此方法的主要問題是會引起局部過熱而使酶活性喪失。所以處理時間應盡量短，或在容器周圍加冰浴處理。（五）化學破碎法 應用各種化學試劑與細胞

14、膜作用，使細胞膜結構改變而使細胞破碎。 常用的化學實際有：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有機溶劑；還有非離子型的Triton、吐溫等表面活性劑。 表面活性劑處理適用于膜蛋白的提取。六）酶促破碎法 通過外加酶或細胞本身存在酶的催化作用，使細胞破碎。 應根據(jù)細胞外層的特點，選用適當?shù)拿浮?革蘭氏陽性細菌：溶菌酶； 革蘭氏陰性細菌：溶菌酶+EDTA 霉菌：幾丁質酶； 酵母：蛋白酶+-1，3-葡聚糖酶 植物細胞：纖維素酶+半纖維素酶+果膠酶 由于上述酶價格較高，所以不適于規(guī)?；墓I(yè)生產。所以可將細胞在一定的pH和溫度下保溫，通過細胞本身的酶系將細胞破壞，使胞內物質釋放，此方法稱為自溶法。 4簡述影響酶提取

15、的主要因素及影響規(guī)律。（1） 抽提溶質的性質 （酸性酶宜用堿性溶劑抽提，堿性酶宜用酸性溶液抽提，極性大的酶宜用極性溶劑抽提，含有較多非極性基團的酶宜用有機溶劑抽提。）。（2） 抽提溶劑的用量 （增加用量可以提高酶的提取率。但是過量的抽提溶劑，會使酶的濃度降低，對酶的進一步分離純化不利。用量一般為原料體積的35倍，最好分次抽提）（3） 溫度 （提取時溫度對酶的提前效果有明顯影響。一般來說，適當提高溫度，可以提高酶的溶解度，增大酶分子的擴散速度。但溫度過高易引起酶變性失活，所以提取溫度不宜過高。要根據(jù)被抽提酶的酶學性質選擇適宜溫度）（4） pH 對酶的溶解度和穩(wěn)定性有顯著影響。（為了提高酶的溶解度

16、，提取酶時應該遠離酶的等電點，但是溶液pH值不宜過高或過低，否則容易引起酶變性失活。（5） 其他因素 （在酶的提取過程中，含酶原料的顆粒越小，則擴散面積越大，越有利于提高酶想溶液中擴散的速度。適當?shù)臄嚢栌欣谔岣邤U散速度。適當延長提取時間，可以使更多的酶溶解出來，從而提高酶的提取效果）5簡述粗酶液凈化、脫色及濃縮的原理與方法。粗酶液的凈化與脫色a. 細胞、細胞碎片 離心、過濾 b. 核酸 核酸酶或魚精蛋白 c. 黏多糖 乙醇、單寧酸、離子表面活性劑 d. 黏度過大 加絮凝劑處理（2）粗酶液的脫色 a. 活性炭 0.1%-1.5% b. 離子交換樹脂 Duolite S-30、通用1號粗酶液的濃

17、縮（1）沉淀法 用鹽析法或有機溶劑將蛋白質沉淀，在將沉淀容分解在小體積溶液中。（2）超濾法 利用不同的超濾膜來濃縮，此方法簡便、迅速、溫和、處理樣品量可達可小。（3）凝膠吸水法 向蛋白質溶液中加入固體Sephadex-25等吸水劑。蛋白質收率較低。（4）離子交換法 吸附到離子交換劑上，然后用少量鹽溶液洗脫下來。（5）透析法 將聚乙二醇（PEG）涂于裝有蛋白質溶液的透析袋上，置于4ºC。為防止PEG進入蛋白質溶液，最好用分子量大的PEG（如PEG20000）。（6）真空濃縮（7）冷凍濃縮（8）蒸發(fā)濃縮 6比較各種沉淀分離方法的優(yōu)、缺點，并說明是適用于實驗室研究還是適用于規(guī)模化的酶的提純

18、。用的沉淀分離方法為：鹽常析法、有機溶劑沉淀法、等電點沉淀法、復合沉淀法選擇性沉淀法、變性沉淀法鹽析法優(yōu)點：安全、操作簡便、使用范圍廣泛、重復性好、費用低等。缺點：分辨率低、純化倍數(shù)較小（一般可使純度提高約5倍）、 硫酸銨易腐蝕離心機、固液較難分離、常需要脫鹽因此，該方法不適用于大規(guī)模純化。有機溶劑沉淀法優(yōu)點：分辨率高；析出的酶沉淀一般易于離心或過濾分離，且無需脫鹽處理；有機溶劑易被除去或回收。缺點：有機溶劑易燃；有機溶劑易引起酶變性失活。因此，該方法不適用于規(guī)模化的酶的提純。等電點沉淀法優(yōu)點：操作簡單 缺點：分級效果和回收率均不理想此方法只用在粗分離階段 各種沉淀分離法的比較沉淀方法 分離原

19、理 優(yōu)點缺點常用試劑鹽析法沉淀法等電點沉淀法有機溶劑沉淀法復合沉淀 法變性沉淀法不同蛋白質在不同的鹽濃度條件下溶解度不同 兩性電解質在等電點時溶 解度最低，以及不同的兩性電解質有不同的等電點 酶與其它雜質在有機溶劑中的溶解度不同在酶液中加入某些物 質，使它與酶形成復合物而沉淀下來 選擇一定的條件使酶液中的某些雜質變性沉淀安全、簡便、重復性好、費用低簡便、費用低 分辨率高、易于離心或過 濾分離、有機溶劑易被除去或回收 分辨率低、純化倍數(shù)低、易腐蝕離心機、固液難分離沉淀不完全、純化倍數(shù)和回收率均不理想有機溶劑易燃、易引起酶的變性失活需對酶及酶液中雜蛋白的理化性質了解 硫酸銨 丙酮、乙醇 PEG、P

20、EI 金屬離子、有機溶劑、加熱、調pH7簡述各種層析分離方法的原理。層析分離: 亦稱色譜分離，是利用混合物中各組分的物理化學性質及生物學特性的不同，使各組分以不同程度分布在兩個相中，其中一個相為固定的(稱為固定相)，另一個相則流過此固定相(稱為流動相)并使各組分以不同速度移動，從而使不同的組分分離。 常用層析方法及其分離原理層析方法 分離依據(jù)凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質量不同而達到物質分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的疏水層析利用生物分子的疏水性進行分離。親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一

21、而又可逆的親和力，使生物分子分離純化聚焦層析將酶等兩性物質的等電點特性與離子交換層析的特性結合在一起，實現(xiàn)組分分離8酶溶液濃縮的方法有哪些？簡述這些方法的原理。方法：沉淀法，透析法，超濾法，離心法，離子交換吸附法，凝膠吸附法，用各種吸水劑吸去水分也能達到濃縮效果。這里主要介紹蒸發(fā)濃縮。蒸發(fā)縮是通過加熱或者減壓方法使溶液中的部分溶劑汽化蒸發(fā)，使溶液得以濃縮的過程。由于酶在高溫條件下不穩(wěn)定，容易變性失活，故酶液的濃縮通常采用真空濃縮。第六章 酶分子的化學修飾1 什么是酶分子的化學修飾？有何作用？酶分子的化學修飾：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學基團（物質），特別是具有生物相容性的物質，進行共

22、價連接，從而改變酶的結構和性質。作用：通過修飾可以使酶分子結構發(fā)生某些變化，提高酶的活力，增強酶的穩(wěn)定性，降低或是消除酶的抗原性等。 2 舉例說明酶主鏈切斷修飾。利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學結構及其空間結構發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法。胃蛋白酶原HCLPH1.5至2-à胃蛋白酶（從N端失去44個氨基酸殘基）3 什么是大分子結合修飾？有何作用？非共價修飾：使用一些能與酶非共價地相互作用而又能有效地保護酶的一些大分子添加物，它們通過氫鍵固定在酶分子表面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，從而保護酶的活力。大分子共價修飾：采

23、用水溶性大分子與酶的側鏈基團共價結合，使酶分子的空間構象發(fā)生改變，從而改變酶的活性與功能的方法。作用：如聚乙二醇、右旋糖苷、多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調節(jié)酶的微環(huán)境來保護酶的活力。另一類是蛋白質，如常用的BSA。蛋白質分子之間相互作用時，其表面區(qū)域內排除了水分子，因而增加了相互作用力，其穩(wěn)定性也就增加了。4定點突變技術在酶分子修飾中有什么作用？簡述其主要技術過程。作用：通過定點突變技術或是化學方法，將酶蛋白分子中的某個氨基酸殘基置換為另一個氨基酸殘基，觀察其對酶催化反應的影響和變化，分析了解該氨基酸殘基在酶催化過程中的作用。技術過程：A、基因序列分析 B、蛋白質結構分析 C、酶活性

24、中心分析 D、引物設計進行基因定點突變 E、酶基因克隆表達 F、變異特性分析5簡述金屬離子置換修飾過程和作用。a 酶的分離純化：首先將欲進行修飾的酶經(jīng)過分離純化，除去雜質，獲得具有一定純度的酶液。b. 除去原有的金屬離子：在經(jīng)過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時，酶往往成為無活性狀態(tài)。c. 加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結合，除去多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。只適用于那些在分

25、子結構中本來含有金屬離子的酶。 用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價金屬離子。作用：1.闡明金屬離子對酶催化作用的影響：A.顯著提高酶活力：如含Mg2+ Zn2+等雜離子-淀粉酶置換為Ca2+活性提高3倍，而且穩(wěn)定性也大大增強。B.穩(wěn)定性顯著增強：如Fe-SOD變?yōu)镸n-SOD,提高了對H2O2 、NaN3的穩(wěn)定性2.改變酶的動力學特性：?；被崴饷竄n2+置換為Co2+后催化N-氯-乙酰丙氨酸的最適pH從8.5降為7.0，同時對N-氯-乙酰蛋氨酸Km增大6 酶分子的物理修飾有什么作用？酶分子的物理修飾：通過修飾分子非共價地與酶分子相互作用來改變酶的應用性能。第七章 固定化酶與固

26、定化細胞1.什么是固定化酶和固定化細胞？其產生的背景是什么？固定化酶的概念： 是指固定在載體上或被限制在一定的空間范圍內，能連續(xù)進行催化反應，且反應后能回收并重復利用的酶。固定化細胞是指固定在載體上并在一定的空間范圍內進行生命活動的細胞。也稱為固定化活細胞或固定化增殖細胞。 背景：為什么要進行酶的固定化？（1）游離酶的穩(wěn)定性較差：在溫度、pH值和無機離子等外界因素的影響下，容易變性失活。(2)游離酶難于連續(xù)化生產：酶與底物和產物混在一起，反應結束后，即使酶仍有較高的活力，也難于回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅使成本較高，而且難于連續(xù)化生產。(3)游離酶給下游的純化工作帶來了難度：酶反應后

27、成為雜質與產物混在一起，無疑給進一步的分離純化帶來一定的困難。2.與游離酶相比，固定化酶優(yōu)缺點各在哪里？固定化酶優(yōu)點：A.容易將固定化酶與底物、產物分開B.可以在較長時間內進行反復分批反應和裝柱連續(xù)反應C.在多數(shù)情況下，提高了酶的穩(wěn)定性D.酶反應過程能夠加以嚴格控制E.產物中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝F.比游離酶更適合多酶反應G.可以增加產物的收率并提高產品質量H.提高酶的使用效率，降低成本固定化酶的不足之處：A.酶在固定化過程中難免造成酶活性的損失B.增加了載體成本和固定化操作費用C.固定化酶的擴散阻力會降低反應速度D.比較適用于可溶性底物和小分子底物，對大分子底物不適用E.與完整菌體相比

28、，不適宜于多酶反應，特別是需要輔助因子的反應3.酶固定化后其性質會發(fā)生什么變化？1.酶結構的改變:固定化導致導致酶的活性中心或調節(jié)中心的構象發(fā)生變化。2.微環(huán)境的改變:微環(huán)境是指在固定化酶附近的局部環(huán)境，而把主體溶液稱為宏觀環(huán)境。3.位阻效應：指載體的遮蔽作用。4.分配效應：由于載體的親水和疏水性質使酶的底物、產物或其它效應物在載體和溶液間發(fā)生不等分配，改變酶反應系統(tǒng)的組成平衡，從而影響酶反應速度：A.如果載體與底物帶相同電荷，則酶的Km值將因固定化而增大；如果帶相反電荷，則Km值減??；B.當載體帶正電荷時，酶活性-pH曲線向酸性方向偏移;當載體帶負電荷時，酶活性-pH曲線向堿性方向偏移；C.

29、如載體是疏水性，底物為極性物質或電荷物質，則酶的Km值將因固定化而降低。5.擴散限制效應：是指底物或其它效應物的遷移和運轉受到限制。（1）外擴散限制：指底物或其它效應物從溶液穿過包圍在固定化酶周圍近于停滯的液膜層到固定化酶表面所受到的限制?？赏ㄟ^充分攪拌或混合予以減輕或消除。（2）內擴散限制：指底物或其它效應物從固定化酶顆粒表面進入顆粒內部酶活性位點的限制。4.固定化方法有哪幾類？各類的優(yōu)缺點及適合范圍是什么？酶固定化的方法很多，主要可分為載體結合法、交聯(lián)法、包埋法和熱處理法等?，F(xiàn)分述如下；1.載體結合法：根據(jù)酶與載體之間相互作用力的不同，有可細分為物理吸附法、離子交換吸附法和共價結合法1.1

30、物理吸附法：通過氫鍵、疏水作用力和電子親和力等物理作用，將酶固定于水不溶載體上的方法。優(yōu)點：操作簡便，條件溫和，不會引起酶變性失活，載體廉價易得，而且可反復使用。缺點：結合力較弱，酶與載體結合不牢固而容易脫落，所以使用受到限制。1.2 離子鍵交換吸附法：酶通過離子鍵與含有離子交換基團的水不溶載體相結合的固定化方法。優(yōu)點：操作簡便，條件溫和、酶的高級結構和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞、酶活回收率高。缺點：結合強度受pH值和離子強度等條件影響。所以用離子 結合法制備的固定化酶，在使用時一定要嚴格控制好 pH值、離子強度和溫度等操作條件。1.3 共價健結合法：通過酶的活性非必需側鏈基團和載體的功能

31、基團之間形成共價鍵而固定的方法。對載體的要求：良好的親水膨潤性、結構疏松、表面積大、有一定的機械強度、帶有在溫和條件下與酶共價結合的功能基團、沒有或很少有非專一性吸附。優(yōu)點：酶與載體結合牢固，不易脫落，連續(xù)使用和操作性能好。缺點：反應條件比較劇烈，容易導致酶失活，酶回收率在30%左右甚至底物專一性、Km、最適pH等均有變化。（二）交聯(lián)法：借助雙功能或多功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結構的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法。交聯(lián)法也可用于含酶菌體或菌體碎片的固定化優(yōu)點：交聯(lián)法制備的固定化酶或固定化菌體結合牢固，可以長時間使用。缺點：但由于交聯(lián)反應條件較激烈，酶分子的多個基團被交聯(lián)，致使酶活力損

32、失較大，而且制備成的固定化酶或固定化菌體的顆粒較小，給使用帶來不便。（三）包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，稱為包埋法。優(yōu)點：包埋法一般不需要酶分子的基團參予，很少改變酶的高級結構，酶活回收率高。缺點：化學聚合法反應也比較劇烈，易導致酶的失活；高分子凝膠網(wǎng)格限制了大分子的擴散，因此不適用于涉及大分子底物、產物的酶；聚合強度不高，容易破損。（四）熱處理法 將含酶細胞在一定溫度下加熱處理一段時間，使酶固定在菌體內，而制備得到固定化菌體。熱處理法只適用于那些熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化，在加熱處理時，要嚴格控制好加熱溫度和時間，以免引起酶的變性失活。例如，將培養(yǎng)好的含葡萄糖異構酶的鏈霉菌細胞在

33、6065的溫度下處理15min，葡萄糖異構酶全部同定在菌體內。熱處理法也可與交聯(lián)法或其他固定化法聯(lián)合使用，進行雙重固定化。項目吸附法包埋法共價結合法交聯(lián)法制備易易難難結合力弱強強強酶活力高高中低底物專一性無變化無變化變化變化再生可能不可能不可能不可能固定化費用低中中高5.如何評價一個酶固定化過程的優(yōu)劣？固定化酶的評價指標1.固定化酶的活力：基本與游離酶相似，但固定化酶一般用重量或單位表面積來表示，如mol/(min.mg)或mol/(min.cm2)A. 振蕩測定法：稱取一定量的固定化酶 ，加入一定量的底物溶液，一邊振蕩或攪拌，一邊進行催化反應，取出一定量的反應液進行酶活力測定。B. 酶柱測定

34、法：將一定量的固定化酶裝進具有恒溫裝置的反應柱中，讓底物溶液以一定的流速流過酶柱 ，收集流出的反應液，測定其中產物的生成量或底物的消耗量C. 連續(xù)測定法:利用連續(xù)分光光度法等測定方法可以對固定化酶反應液進行連續(xù)測定，從而測定固定化酶的酶活力。 2.偶聯(lián)效率：以載體結合蛋白量（或酶活）占總蛋白量（或總酶活）的百分比。3.活力回收：固定化酶所顯示活力占總溶液酶活力的百分數(shù)。4.相對活力：經(jīng)固定化后固定化酶所顯示活力占被固定的等蛋白量溶液酶活力的 百分比。5.固定化酶的半衰期：在連續(xù)測定條件下，固定化酶的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的時間?？梢杂脤崪y法或公式推算法。6.舉例說明固定化酶或是（細胞）的

35、實際應用？酵母細胞帶有負電荷，在pH35的條件下能夠吸附在多孔陶瓷或多孔塑料等載體的表面，制成固定化細胞，用于酒精和啤酒等的發(fā)酵生產；在環(huán)境保護領域廣泛使用的活性污泥中含有各種各樣的微生物，這些微生物可以沉積吸附在硅藻土、多孔玻璃、多孔陶瓷、多孔塑料等載體的表面，用于各種有機物廢水處理，以降低廢水中的化學需氧量(COD)和生化需氧量(BOD)；各種霉菌會長出菌絲體，這些菌絲體吸附纏繞在多孔塑料、金屬絲網(wǎng)等載體上，用以生產某些有機酸和酶等；植物細胞可吸附在中空纖維外壁，用于生產色素、香精、藥物和酶等次級代謝物；動物細胞大多數(shù)屬于附著細胞，必須依附在固體表面才能正常生長，故可吸附在容器壁、微載體和

36、中空纖維外壁等載體上，制成固定化動物細胞，用于各種功能蛋白質的生產。第八章酶在有機介質中的催化作用1.有機相中的水對酶的催化有什么作用？用非極性有機溶劑取代所有的大量水，使固體酶懸浮在有機相中。但仍然含有必需的結合水以保持酶的催化活性(含水量一般小于2%)。酶都溶于水，只有在一定量的水存在的條件下，酶分子才能進行催化反應。所以酶在有機介質中進行催化反應時，水是不可缺少的成分之一。有機介質中的水含量多少對酶的空間構象、酶的催化活性、酶的穩(wěn)定性、酶的催化反應速度等都有密切關系，水還與酶催化作用的底物和反應產物的溶解度有關。 酶分子只有在空間構象完整的狀態(tài)下，才具有催化功能。在無水的條件下，酶的空間

37、構象被破壞，酶將變性失活。故此，酶分子需要一層水化層，以維持其完整的空間構象。維持酶分子完整的空間構象所必需的最低水量稱為必需水2.有機溶劑對有機相中的酶的催化又什么影響？1.有機溶劑對酶結構與功能的影響：在水溶液中，酶分子均一地溶解于水溶液中，可以較好地保持其完整的空間結構。在有機溶劑中，酶分子不能直接溶解，而是懸浮在溶劑中進行催化反應。根據(jù)酶分子的特性和有機溶劑的特性的不同，保持其空間結構完整性的情況也有所差別。 （1）有機溶劑對酶分子表面結構的影響（2）有機溶劑對酶活性中心結合位點的影響2.有機溶劑對酶活性的影響：極性較強的有機溶劑，如甲醇、乙醇等，會奪取酶分子的結合水，影響酶分子微環(huán)境

38、的水化層，從而降低酶的催化活性,甚至引起酶的變性失活。因此應選擇好所使用的溶劑，控制好介質中的含水量，或者經(jīng)過酶分子修飾提高酶分子的親水性，避免酶在有機介質中因脫水作用而影響其催化活性。有機溶劑的極性強弱可以用極性系數(shù)lgP表示。 lgP為化合物在標準正辛烷-水兩相體系中分配系數(shù)的對數(shù)。 lgP越大表明其極性越?。?lgP越小表明其極性越大3.有機溶劑對底物和產物分配的影響：有機溶劑與水之間的極性不同，在反應過程中會影響底物和產物的分配，從而影響酶的催化反應。應該選擇極性適中的有機溶劑：2lgP53.酶的有機相催化有什么優(yōu)點？1提高脂溶性底物的溶解度，有利于高濃度底物連續(xù)生物轉化2水解酶能摧花

39、合成反應，如脂的合成和肽的合成3可以控制由水引起的副反應 4酶不溶性有機介質，易于回收再利用 5酶的固定化簡單，可以只沉淀在載體表面6從低沸點的溶劑中分離純化產物比水容易 7酶的熱穩(wěn)定性比水高，且沒有微生物污染4.影響酶的有機相催化因素有哪些？酶的種類和濃度：不僅要看酶催化反應速度、還要注意酶的穩(wěn)定性、底物專一性、對映體選擇性、區(qū)域選擇性、鍵選擇性等。同一種酶，由于來源不同和處理方法（如純度、凍干條件、固定化載體、固定化方法、修飾方法和修飾劑等）的不同，其特性也會有差別。底物的種類和濃度:底物最適濃度和在有機相-必需水相間的分配問題有機溶劑的種類： 2lgP5水含量：最適水含量與溶劑的極性有關

40、，溶劑極性越大，最適水含量也越大；而達到最大反應速度的水活度一般在0.5-0.6之間。溫度：在微水有機介質中，酶的熱穩(wěn)定性增強，其最適溫度高于水溶液中的催化最適溫度；但溫度升高，立體選擇性將降低。pH和離子強度：在有機介質中催化最適pH與水溶液中的接近。在冷凍干燥過程中，緩沖液對會嚴重影響pH和酶活力，應選擇合適的緩沖液對，并添加蔗糖、甘露醇和冠醚等保護劑；有機相緩沖液。5.舉例說明酶的有機相催化的應用實例？手性藥物的拆分手性化合物是指化學組成相同，而其立體結構互為對映體的兩種異構體化合物。豬胰脂肪酶PPL在有機介質體系對2，3-環(huán)氧丙醇丁酸酯；脂肪酶在有機介質體系中進行2-芳基丙酸酯、苯甘氨酸甲酯拆分第九章酶反應器和酶傳感器1.酶反應器有哪些種類？各有什么