第三章,細(xì)胞全能性與遺傳變異)

1、l細(xì)胞全能性l形態(tài)建成l遺傳變異l掌握細(xì)胞離體培養(yǎng)的基本理論基礎(chǔ)；l理解培養(yǎng)條件下組織細(xì)胞脫分化和再分化的調(diào)控原理；l了解體細(xì)胞胚形成過(guò)程及其與合子胚的差異；l了解細(xì)胞離體培養(yǎng)遺傳變異。l細(xì)胞全能性概述l細(xì)胞脫分化l細(xì)胞分化l全能性：一個(gè)生活細(xì)胞所具有的產(chǎn)生完整生物個(gè)體的潛在能力稱之為細(xì)胞的全能性l周期細(xì)胞：莖尖、根尖及形成層細(xì)胞始終保持分裂能力l終端分化細(xì)胞：篩管、導(dǎo)管、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞等特化細(xì)胞，永久失去分裂能力lGo細(xì)胞：表皮細(xì)胞及各種薄壁細(xì)胞，受到外界刺激后可重新啟動(dòng)分裂一、細(xì)胞全能性注意：一個(gè)植物細(xì)胞向分生狀態(tài)回復(fù)過(guò)程所能進(jìn)行的程度，取決于它在自然部位上所處的位置和生理狀態(tài)。細(xì)胞脫分化（

2、dedifferentiationdedifferentiation）：培養(yǎng)條件下使一個(gè)已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無(wú)分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀態(tài)的過(guò)程l總體上包括：細(xì)胞質(zhì)顯著變濃，大液泡消失，核體積增加并逐漸移位至細(xì)胞中央，細(xì)胞器增加。l第一階段為啟動(dòng)階段，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)增生，并開(kāi)始向細(xì)胞中央伸出細(xì)胞質(zhì)絲，液泡蛋白體出現(xiàn)；l第二階段為演變階段，此時(shí)細(xì)胞核開(kāi)始向中央移動(dòng)，質(zhì)體演變成原質(zhì)體；l第三階段為脫分化終結(jié)期，細(xì)胞回復(fù)到分生細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞分裂即將開(kāi)始。l細(xì)胞周期調(diào)控l激素的作用lPSK的調(diào)控作用l染色體變化l三類：lCyclin(周期蛋白A，B，C，E)lCDK-cyclin-depended kina

3、se（1，2，4）lCKI- cyclin-depended kinase inhibitorl1996年，首次發(fā)現(xiàn)PSK a, PSKblPSKa在低細(xì)胞密度下促進(jìn)細(xì)胞啟動(dòng)分裂。lPSKa表達(dá)受NAA誘導(dǎo)，lPSKa表達(dá)同時(shí)細(xì)胞起動(dòng)分裂。l水稻細(xì)胞質(zhì)膜上存在PSKa的受體蛋白120kD和160kDl細(xì)胞分化（differentiationdifferentiation）：導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過(guò)程（許智宏，19981998）。l時(shí)間上的分化：一個(gè)細(xì)胞在不同的發(fā)育階段上可以有不同的形態(tài)和機(jī)能l空間上的分化：同一種細(xì)胞后代，由于所處的環(huán)境（如部位）不同而可以有相異

4、的形態(tài)和機(jī)能l單細(xì)胞生物：僅有時(shí)間上的分化l多細(xì)胞生物：時(shí)間上的分化，有空間上的分化，如一個(gè)植物個(gè)體在其頂端、根、莖、葉等不同部位具有不同的細(xì)胞。l染色體重復(fù)復(fù)制lDNA的差異擴(kuò)增l基因重排l極性：指植物的器官、組織、甚至單個(gè)細(xì)胞在不同的軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上的梯度差異l極性無(wú)論在低等植物或高等植物中均普遍存在。l極性一旦建立，在一般情況下不可逆轉(zhuǎn)。l在很多情況下，細(xì)胞的不均等分裂是細(xì)胞極性建立的標(biāo)志。l激素在植物生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用，也是離體培養(yǎng)條件下調(diào)控細(xì)胞脫分化和再分化的主要因素。l生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是兩類主要的培養(yǎng)條件下調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的植物激素。l有些試驗(yàn)中

5、也顯示，GA3、ABA、乙烯等也在細(xì)胞分化中起到一定的調(diào)節(jié)作用。l離體培養(yǎng)中器官發(fā)生的方式l器官分化過(guò)程l起始材料對(duì)器官分化的影響l激素對(duì)器官分化的調(diào)控器官發(fā)生：是指培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成不定根（adventitious adventitious rootsroots）、不定芽（adventitious shootsadventitious shoots）等器官的過(guò)程。l三種方式：l先芽后根l先根后芽l愈傷組織的不同部位形成芽和根，再通過(guò)維管組織的聯(lián)系形成完整植株。l三個(gè)生長(zhǎng)階段：l誘導(dǎo)形成愈傷組織l“生長(zhǎng)中心”形成：若干部位成叢出現(xiàn)類似形成層的細(xì)胞群，擬分生組織，它們是

6、愈傷組織中形成器官的部位。l器官原基及器官形成l在有些情況下，外植體不經(jīng)過(guò)典型的愈傷組織即可形成器官原基。兩種情況：l外植體中已存在器官原基，進(jìn)一步培養(yǎng)即形成相應(yīng)的組織器官進(jìn)而再生植株，如莖尖、根尖分生組織培養(yǎng)；l外植體某些部位的細(xì)胞，在重新分裂后直接形成分生細(xì)胞團(tuán)，然后由分生細(xì)胞團(tuán)形成器官原基。l這種不經(jīng)過(guò)愈傷組織直接發(fā)生器官的途徑在以品種繁殖為目的的離體培養(yǎng)中具有重要的實(shí)踐意義。l母體植株的遺傳基礎(chǔ)：不同基因型器官分化能力不一樣（玉米幼胚340、吉853、444，愈傷組織誘導(dǎo)率均為100%，器官分化率（）78、11、0.4)l外植體的類型：體現(xiàn)在外植體的生理狀態(tài)上。生理狀態(tài)年輕，來(lái)源于生長(zhǎng)

7、活躍或生長(zhǎng)潛力大的組織和器官的細(xì)胞更有利于培養(yǎng)l生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素是兩類主要的植物激素，在離體器官分化調(diào)控中占有主導(dǎo)地位。l生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素比例：l高：生根；低：分化芽；中：愈傷組織l光照時(shí)間、強(qiáng)度以及光質(zhì)對(duì)器官分化均有影響l同源框（homebox）基因：lKn1（KNOTTED1）；STM（Shootmeristemless）lCdc2；ESR1lbZIP（PKSF1）；SRD1、SRD2和SRD3l體細(xì)胞胚概念：離體培養(yǎng)下沒(méi)有經(jīng)過(guò)受精過(guò)程，但經(jīng)過(guò)了胚胎發(fā)育過(guò)程所形成的胚的類似物（不管培養(yǎng)的細(xì)胞是體細(xì)胞還是生殖細(xì)胞），統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。l體細(xì)胞胚是離體培養(yǎng)的產(chǎn)物l起源于非合子細(xì)胞，區(qū)

8、別于合子胚；經(jīng)過(guò)了胚胎發(fā)育過(guò)程，區(qū)別與離體培中器官發(fā)生l體細(xì)胞胚從外植體上直接發(fā)生l經(jīng)過(guò)愈傷組織的體細(xì)胞胚發(fā)生l細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的體細(xì)胞胚胎發(fā)生l葉片為外植體，體細(xì)胞胚兩個(gè)階段：l誘導(dǎo)期：葉片表皮細(xì)胞或亞表皮細(xì)胞感受培養(yǎng)刺激，進(jìn)入分裂狀態(tài)。l胚胎發(fā)育期：形成的瘤狀物繼續(xù)發(fā)育，經(jīng)過(guò)球形胚、心形胚等發(fā)育過(guò)程，最后形成體細(xì)胞胚。l三個(gè)培養(yǎng)階段：l誘導(dǎo)外植體形成愈傷組織；l誘導(dǎo)愈傷組織胚性化；l體細(xì)胞胚形成。l在以幼胚、胚以及子葉為外植體時(shí)，通常可以直接誘導(dǎo)胚性愈傷組織產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)生體細(xì)胞胚。l因此，經(jīng)過(guò)愈傷組織的體細(xì)胞胚胎發(fā)生，胚性愈傷組織的形成是培養(yǎng)的關(guān)鍵。圖1甘薯莖尖分生組織誘導(dǎo)的胚性愈傷組織F i

9、g11Embryogenic callus from ap icalmeristem圖2不同發(fā)育時(shí)期的體細(xì)胞胚F ig12Somatic embryo s at different developmental stages圖3從體細(xì)胞胚分化叢生試管苗F ig13Plantlets from somatic embryosl兩類細(xì)胞：自由分散大而高度液泡化細(xì)胞，不具備胚胎發(fā)生潛力；成簇團(tuán)的體積小而細(xì)胞質(zhì)致密的細(xì)胞，具有成胚能力，稱為胚性細(xì)胞團(tuán)。l胚性細(xì)胞團(tuán)：適宜的胚胎發(fā)生培養(yǎng)基，外圍細(xì)胞開(kāi)始第一次不均等分裂。一個(gè)細(xì)胞較大，以后發(fā)育成類似胚柄的結(jié)構(gòu)；另一個(gè)分裂形成類似原胚的結(jié)構(gòu)，經(jīng)球形期、心形期等

10、發(fā)育階段形成完整的體細(xì)胞胚。l與器官發(fā)生形成個(gè)體的途徑相比，兩個(gè)特點(diǎn)：l一是體細(xì)胞胚具有雙極性（doublepolarity）l二是體細(xì)胞胚形成后與母體的維管束系統(tǒng)連系較少，即出現(xiàn)所謂的生理隔離（physiological isolation）現(xiàn)象。l與合子胚相比，體細(xì)胞胚一般沒(méi)有真正的胚柄只有類似胚柄的結(jié)構(gòu)；子葉常不規(guī)范，有時(shí)具有兩片以上的子葉；體積明顯?。粵](méi)有休眠。l外源激素對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的調(diào)控l培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對(duì)體細(xì)胞胚形成的影響l不同基因型間體細(xì)胞胚形成能力的差異l2，4D是應(yīng)用最為廣泛的生長(zhǎng)素，2，4D的應(yīng)用有著規(guī)律性的變化。l首先是在較高濃度下誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的形成l降低2，4D的濃

11、度下產(chǎn)生早期胚胎，一般在球形胚形成后，除去生長(zhǎng)素則有利于體細(xì)胞胚的繼續(xù)發(fā)育。l體細(xì)胞胚的產(chǎn)生要求培養(yǎng)基中含有一定濃度的還原態(tài)氮。l球形胚形成后，如果降低培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽濃度，可以顯著促進(jìn)體細(xì)胞胚的進(jìn)一步發(fā)育。l在一些試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞胚發(fā)育后期降低蔗糖濃度，也有利于胚的繼續(xù)發(fā)育和提高體細(xì)胞胚的成苗率l不同類型的植物間具有明顯差異不同類型的植物間具有明顯差異：l自然條件下容易產(chǎn)生無(wú)融合生殖胚的植物為多，且培養(yǎng)條件相對(duì)較為簡(jiǎn)單，如咖啡屬植物、蕓香科植物等。l同類植物的不同基因型，在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的難易、形成時(shí)間以及單個(gè)外植體產(chǎn)生體細(xì)胞胚的數(shù)量上也存在明顯差異。l馬鈴薯18個(gè)不同基因型品種的體細(xì)胞胚形

12、成能力的比較研究顯示，有7個(gè)品種的體細(xì)胞胚發(fā)生率為100，而頻率最低則只有10。l體細(xì)胞胚形成過(guò)程中內(nèi)源生長(zhǎng)素的變化l體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中的特異蛋白質(zhì)l體細(xì)胞胚形成的基因表達(dá)調(diào)控l外源生長(zhǎng)素對(duì)體細(xì)胞胚產(chǎn)生和發(fā)育的調(diào)控是通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源激素的合成、代謝、極性運(yùn)輸和平衡而起作用的。l外源生長(zhǎng)素的使用模式：在大多數(shù)植物中是相似的，如誘導(dǎo)胚性細(xì)胞產(chǎn)生，或誘導(dǎo)愈傷組織轉(zhuǎn)化為胚性愈傷組織，均需要高濃度的生長(zhǎng)素。當(dāng)球形胚形成后，則需要降低生長(zhǎng)素水平才能完成體細(xì)胞胚的繼續(xù)發(fā)育。l生長(zhǎng)素的這一應(yīng)用規(guī)律與胚胎發(fā)育過(guò)程中內(nèi)源激素的變化是一致的。l有關(guān)體細(xì)胞胚形成中蛋白質(zhì)含量和組分的變化，盡管不同研究在絕對(duì)含量上不盡相同，

13、但總體趨勢(shì)均表現(xiàn)出，體細(xì)胞胚形成過(guò)程中水溶性蛋白明顯增加。l通過(guò)基因表達(dá)的差異顯示和胚胎發(fā)育突變體等技術(shù)，已分離出幾十個(gè)與體細(xì)胞胚發(fā)育相關(guān)的基因。除了一些典型的激素調(diào)控基因外，還有其它類型的基因。表 胡蘿卜體細(xì)胞胚形成相關(guān)的部分基因 基基 因因 表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)產(chǎn)物 表表 達(dá)達(dá) 時(shí)時(shí) 期期 資資 料料 來(lái)來(lái) 源源 DC8 DC8 LEALEA（Grp3Grp3） 心形胚心形胚BorrkirdBorrkird等，等， 1986 1986；FranzFranz等，等， DC59 DC59 Oleosin Oleosin 心形胚心形胚ChoiChoi等，等， 1987 1987；HatzopoulosH

14、atzopoulos等，等， DC3 DC3 LEALEA（Grp3Grp3） 原胚、球形胚、心形胚原胚、球形胚、心形胚 WildeWilde等，等，19881988 EMB-1 EMB-1 LEALEA（Grp1Grp1） 球形胚、心形胚球形胚、心形胚 UlrichUlrich等，等，19901990；19931993 ECP31 ECP31 LEALEA（Grp4Grp4） 原胚原胚 ECP40 ECP40 LEALEA（Grp2Grp2） 原胚原胚 KiyosueKiyosue等，等，19921992，19931993l體細(xì)胞變異的特點(diǎn)和規(guī)律l體細(xì)胞變異的應(yīng)用途徑和選擇方法l細(xì)胞變異細(xì)胞

15、遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)l細(xì)胞組織的離體培養(yǎng)屬于無(wú)性繁殖范疇l再生的個(gè)體均承傳了母體的遺傳基礎(chǔ)，植物快速繁殖應(yīng)用的基礎(chǔ)。l離體培養(yǎng)的細(xì)胞、愈傷組織以及再生植株均普遍存在著變異（培育過(guò)程的影響）。l體細(xì)胞無(wú)性系（somaclonessomaclones）：由任何形式的細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的植株， Larkin和Scowcroft（1981）l體細(xì)胞無(wú)性系變異（somaclonal variationsomaclonal variation）：這些植株所表現(xiàn)出來(lái)的變異l普遍性：l局限性：l嵌合性：l變異可發(fā)生在各種培養(yǎng)類型中；l變異發(fā)生在各種植物的培養(yǎng)中；植物種類 再生植株來(lái)源 變異頻率（）煙 草 體細(xì)胞

16、愈傷組織 10水 稻 胚愈傷組織 71.9甘 蔗 幼葉愈傷組織 18玉 米 體細(xì)胞愈傷組織 14大 麥 花粉植株 10-15部分植物離體培養(yǎng)再生植株的表型變異頻率l表型上：在不同植物類型中經(jīng)常發(fā)生的體細(xì)胞變異主要是植株形態(tài)（株高、葉形、葉色等）、生長(zhǎng)勢(shì)、育性、某些抗性等性狀的變異。l生理生化特性上：容易出現(xiàn)同功酶譜、次生代謝的消長(zhǎng)等變異。l一些單基因控制的性狀不僅發(fā)生隱性突變，也發(fā)生顯性突變。l嵌合性是指同一有機(jī)體中同時(shí)存在有遺l傳組成不同的細(xì)胞，它是組織培養(yǎng)中常l見(jiàn)的現(xiàn)象l供體植物：倍性水平；基因型；外植體細(xì)胞分化程度l培養(yǎng)基：不同的激素濃度可以有選擇地誘導(dǎo)不同倍性的細(xì)胞的分裂（倍性增加或減

17、?。培養(yǎng)方式：懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞較半固體培養(yǎng)的細(xì)胞易產(chǎn)生變異l繼代培養(yǎng)的次數(shù)：繼代時(shí)間或越長(zhǎng)，繼代次數(shù)越多，細(xì)胞變異的幾率就越高。培養(yǎng)時(shí)間（月）觀察細(xì)胞數(shù)亞二倍體細(xì)胞數(shù)亞二倍體百分率二倍體細(xì)胞數(shù)二倍體百分率多倍體和非整倍細(xì)胞數(shù)多倍體和非整倍百分率1921415.26570.799.8351611.83976.5611.812501530.02754.0714.018832934.93339.81922.9培養(yǎng)時(shí)間對(duì)掌葉半夏愈傷組織染色體變異的影響l染色體組數(shù)：增加，形成同源多倍體l染色體結(jié)構(gòu)變異：l染色體易位、缺失、倒位等l堿基突變：結(jié)構(gòu)基因的位置或調(diào)控序列的位置lDNADNA序列的選擇性擴(kuò)增

18、與丟失：DNA序列丟失多發(fā)生在rDNA及其間隔序列l(wèi)轉(zhuǎn)座子（transposon）活化，McClintock在玉米中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)環(huán)境中首先被激活而轉(zhuǎn)座，從而造成染色體的結(jié)構(gòu)變異。lDNA甲基化（methylation）在基因表達(dá)調(diào)控中具有重要作用。2003.09遺傳學(xué)2. 基因的移動(dòng)跳躍基因（轉(zhuǎn)座子）概念 20世紀(jì)40年代中期，美國(guó)女遺傳學(xué)家McClintock研究了玉米的Ac-Ds系統(tǒng)后提出了轉(zhuǎn)座子（跳躍基因）的概念。（1） 現(xiàn)象：玉米籽粒有色（紅、紫），但有一些籽粒出現(xiàn)花斑及條紋，花斑有大有小。早期有顏色者，花斑大，后期有色者，花斑很小。2003.09遺傳學(xué)紫斑玉米2003.09遺傳學(xué)（2

19、） Ac-Ds及作用方式： McClintock認(rèn)為，已知有色基因C （第九染色體上，是顯性）可使籽粒有色，但在C旁有一個(gè)基因叫Ds，它能抑制了基因C的作用，使籽粒無(wú)色； 當(dāng)Ds從C上移走后，C作用恢復(fù)，出現(xiàn)顏色； Ds從C上移走的早，花斑就大，反之就小；因此花斑的大小是Ds從C上移走的早晚引起的。 Ds的移動(dòng)還受另一個(gè)因子（Ac）的控制，當(dāng)Ac存在時(shí)，Ds可移動(dòng)，Ac丟失，則Ds不能移動(dòng)。lDNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一,可能存在于所有高等生物中。lDNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。l甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鳥(niǎo)嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶。lDNA的甲基化是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNAMTs）的作用下使CpG二核苷酸5端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?甲基胞嘧啶。l哺乳動(dòng)物中，CpG序列在基因組中出