第四章 動(dòng)物干細(xì)胞

1、第四章 動(dòng)物干細(xì)胞 第一節(jié)第一節(jié) 干細(xì)胞的概念和分類干細(xì)胞的概念和分類 一、概念一、概念干細(xì)胞（干細(xì)胞（Stem cellStem cell）是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞）是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞, ,能產(chǎn)能產(chǎn)生表型和基因型與自己完全相同的子細(xì)胞，并具有不同分化潛能。生表型和基因型與自己完全相同的子細(xì)胞，并具有不同分化潛能。胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞 形態(tài)特征：形態(tài)特征：圓形或橢圓形，體積小，核質(zhì)比大；圓形或橢圓形，體積小，核質(zhì)比大； 生化特征：生化特征：較高的端粒酶活性；一般都有獨(dú)特的表較高的端粒酶活性；一般都有獨(dú)特的表 面標(biāo)志；面標(biāo)志； 增殖特征增殖特征: : 自穩(wěn)定性：自穩(wěn)定性

2、：?jiǎn)渭?xì)胞或無脊椎動(dòng)物單細(xì)胞或無脊椎動(dòng)物不對(duì)稱分裂不對(duì)稱分裂 哺乳動(dòng)物哺乳動(dòng)物種群意義上的不對(duì)稱分裂種群意義上的不對(duì)稱分裂 分化特征：分化特征：是干細(xì)胞最重要的特征。干細(xì)胞本生不是干細(xì)胞最重要的特征。干細(xì)胞本生不 是終末分化細(xì)胞，具有再分化的潛力。是終末分化細(xì)胞，具有再分化的潛力。干細(xì)胞的主要生理特征：干細(xì)胞的主要生理特征： 二、分類二、分類 一）根據(jù)發(fā)生來源分類 胚胎干細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞： 成體干細(xì)胞：成體干細(xì)胞： 來自早期胚胎（來自早期胚胎（ESCESC）、原始生殖細(xì)胞）、原始生殖細(xì)胞（PGCPGC）、或畸胎瘤組織（）、或畸胎瘤組織（ECEC）等）等如骨髓造血干細(xì)胞（如骨髓造血干細(xì)胞（HSCH

3、SC），間質(zhì)干細(xì)胞），間質(zhì)干細(xì)胞（MSCMSC），神經(jīng)干細(xì)胞（），神經(jīng)干細(xì)胞（NSCNSC） ESC什么是畸胎瘤 如果在胚胎不同時(shí)期，某些多能細(xì)胞從整體上分離或脫落下來，使細(xì)胞基因發(fā)生突變，分化異常，則可發(fā)生胚胎異常。 一般認(rèn)為，這種分離或脫落發(fā)生于胚胎早 期，則形成畸胎；而如發(fā)生于胚胎后期，則形成了具有內(nèi)胚層、中胚層和外胚層三個(gè)胚層的異常分化組織，即形成了畸胎瘤。 鼻咽畸胎瘤淋巴管瘤生殖嵴與PGC（原始生殖細(xì)胞）成體干細(xì)胞：神經(jīng)干細(xì)胞 二）根據(jù)分化潛能分類 全能干細(xì)胞：如ESC 多能干細(xì)胞：如造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞 定向祖細(xì)胞：如造血母細(xì)胞等。 專能干細(xì)胞：皮膚干細(xì)胞，成肌細(xì)胞等 三）根據(jù)

4、干細(xì)胞存在的組織器官分類 胚胎干細(xì)胞 造血干細(xì)胞 神經(jīng)干細(xì)胞 肝臟干細(xì)胞 皮膚干細(xì)胞 肌肉干細(xì)胞等第二節(jié) 胚胎干細(xì)胞 通過建立體外培養(yǎng)的方法，獲得保持增殖且不分化的胚胎干細(xì)胞系的技術(shù)稱為胚胎干細(xì)胞的建系。 一、胚胎來源的干細(xì)胞系（p132 圖6-1） 1. 囊胚階段的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（囊胚階段的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM） 2. 來源于生殖嵴部位的原始生殖細(xì)胞（PGC） 3. 來源于畸胎瘤組織（EC）二、胚胎干細(xì)胞的建系 主要步驟包括： 1. 培養(yǎng)體系的選擇和準(zhǔn)備 2. 胚胎采集 3. ICM的獲取 4. ICM的離散 5. ESC的建系1. 培養(yǎng)體系的選擇和準(zhǔn)備 飼養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備： 飼養(yǎng)層細(xì)胞一方面對(duì)ESC細(xì)

5、胞帖壁起支持作用，另一方面其分泌蛋白可抑制ESC分化，維持其增殖特性和多能性。 常用飼養(yǎng)層細(xì)胞為成纖維細(xì)胞（如STO成纖維細(xì)胞系）、子宮內(nèi)皮細(xì)胞、3T3細(xì)胞株等。 為了阻斷飼養(yǎng)層細(xì)胞的分裂，而不影響其分泌蛋白的產(chǎn)生，通常采用射線或絲裂霉素C處理之。 培養(yǎng)基的準(zhǔn)備： 用DMEM（高糖）培養(yǎng)液，其中胎牛血清的濃度和質(zhì)量很重要，還要加非必須氨基酸；-巰基乙醇。 常采用添加LIF等抑制ESC的分化潛能；添加EGF等生長(zhǎng)因子來促進(jìn)ESC的增殖。LIF抑止胚胎干細(xì)胞分化的信號(hào)通路 LIF 干細(xì)胞表面的LIF受體和gp130蛋白形成異二聚體 激活JAK酪氨酸激酶系統(tǒng) 激活MAP激酶ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)和STAT3

6、蛋白 STAT3形成同型二聚體入核 激活核內(nèi)靶基因轉(zhuǎn)錄 表達(dá)相應(yīng)蛋白抑止ESC的分化 2. 胚胎的采集 一般囊胚期胚胎或后桑葚胚。 3. ICM的獲取 1）直接分離法：囊胚于飼養(yǎng)層上自行發(fā)育成孵化囊胚，待ICM擴(kuò)大增殖時(shí)挑取?；蚴褂面溍沟鞍酌柑幚鞿P，獲得裸胚培養(yǎng)。 2）免疫分離法：鏈霉蛋白酶去除囊胚晚期胚泡ZP，依次轉(zhuǎn)移至補(bǔ)體滅活和未滅活的抗血清中，去除滋胚層細(xì)胞后，吸取ICM，移至飼養(yǎng)層培養(yǎng)。 4. ICM的離散 胰蛋白酶消化即可離散ICM。 5. 胚胎干細(xì)胞建系三、胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用 研究意義研究意義 人胚胎發(fā)育機(jī)制及影響因素的研究。人胚胎發(fā)育機(jī)制及影響因素的研究。 用于藥物機(jī)理及毒性實(shí)驗(yàn)

7、的研究，減少人體用于藥物機(jī)理及毒性實(shí)驗(yàn)的研究，減少人體和動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)及臨床研究。和動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)及臨床研究。 將胚胎干細(xì)胞定向分化的細(xì)胞用于制造人體將胚胎干細(xì)胞定向分化的細(xì)胞用于制造人體細(xì)胞、組織和器官。細(xì)胞、組織和器官。 第三節(jié)、胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性與鑒定方法 一、生物學(xué)特性 增殖與分化特征：增殖與分化特征： 永生化(immortal)； 能維持穩(wěn)定的正常的二倍體染色體結(jié)構(gòu)； 有穩(wěn)定的發(fā)育潛能，能被誘導(dǎo)增殖或分化； 能參與胎兒所有組織的發(fā)育過程；形態(tài)特征形態(tài)特征體積小、核大，有一個(gè)或多個(gè)核仁；體積小、核大，有一個(gè)或多個(gè)核仁；胚胎干細(xì)胞克隆緊密堆積，細(xì)胞之間無明顯的胚胎干細(xì)胞克隆緊密堆積，細(xì)胞之間

8、無明顯的界限，細(xì)胞克隆有一定形狀規(guī)律。界限，細(xì)胞克隆有一定形狀規(guī)律。生化特征生化特征具有具有堿性磷酸酶堿性磷酸酶和和端粒酶端粒酶活性；活性；表達(dá)表達(dá)SSEA-3SSEA-3、SSEA-4SSEA-4、TRA-1-60TRA-1-60等表面標(biāo)志；等表面標(biāo)志；表達(dá)表達(dá)OCT-4OCT-4蛋白；蛋白；人胚胎干細(xì)胞的表面標(biāo)志Otc4基因 Otc4基因被認(rèn)為在整個(gè)卵子生成和囊胚附殖前以及早期外胚層中都表達(dá)，是受精卵全能性的關(guān)鍵。 Otc4基因只能在胚胎中才能得到完全表達(dá)，而在成體動(dòng)物體細(xì)胞中的表達(dá)基本上被關(guān)閉。這就意味著克隆人技術(shù)的第一步就存在很大問題。所以O(shè)tc4也被稱為克隆人終結(jié)者。二、胚胎干細(xì)胞的

9、鑒定方法 1. 形態(tài)鑒定： 核質(zhì)比大，體積小，細(xì)胞集落小鼠呈鳥巢狀，牛、豬等呈饅頭狀，人呈扁平、松散聚合體。 2. 核型分析： 二倍體核型，染色體受損情況等。 3. ESC特異性表面抗原表達(dá)的鑒定： 小鼠ESC以SSEA-1為主，人以SSEA-3、SSEA-4為主。此外，ALP、Otc-4等都可作為表面標(biāo)志。 4. 端粒酶活性鑒定： 端粒長(zhǎng)度及端粒酶活性檢測(cè)。 5. 體內(nèi)外分化能力鑒定：體內(nèi)外分化能力鑒定：胚胎小體（EB，或稱擬胚體） 改變細(xì)胞的培養(yǎng)條件: 改變細(xì)胞的培養(yǎng)條件是ES細(xì)胞定向分化的基本策略,常用的方法有:與輔助細(xì)胞共培養(yǎng);在半固體培養(yǎng)基中原位生長(zhǎng)分化;添加生長(zhǎng)因子、化學(xué)誘導(dǎo)劑等。

10、 導(dǎo)入外源性基因,使其分化為某一特定類型的細(xì)胞。 體內(nèi)定向分化,使ES 細(xì)胞多數(shù)分化為該組織特異性的細(xì)胞。三、胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的方三、胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的方法法胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化：胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化： 胎牛血清，骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)胎牛血清，骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞造血細(xì)胞造血細(xì)胞 RARA胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞 DMSODMSO胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞肌肉細(xì)胞肌肉細(xì)胞 TGF-B1, VEGF, bFGFTGF-B1, VEGF, bFGF胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞血管和內(nèi)皮細(xì)胞血管和內(nèi)皮細(xì)胞 RA+RA+胰島素胰島素+T3+T3胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞脂肪細(xì)胞脂肪

11、細(xì)胞 BMP-2, BMP-4BMP-2, BMP-4胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞軟骨細(xì)胞軟骨細(xì)胞 地塞米松，磷酸甘油地塞米松，磷酸甘油胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞骨細(xì)胞骨細(xì)胞 基因轉(zhuǎn)染基因轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞胰島素分泌細(xì)胞胰島素分泌細(xì)胞人胚胎干細(xì)胞注射至免疫缺陷小鼠的后腿肌肉中形成的各種組織：（a）腸樣結(jié)構(gòu)；(b)神經(jīng)上皮花結(jié)；(c）骨骼；(d)軟骨 ；(e)橫紋肌；(f)腎。 A.小鼠成纖維飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)8天后的ICM（標(biāo)尺100um）B.ICM中分離出的H9細(xì)胞系（標(biāo)尺100um）C. H9細(xì)胞系（標(biāo)尺50um）D.在無小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，但有LIF（20ng/ml）的條件下培養(yǎng)5d后，H9細(xì)胞發(fā)生

12、分化（標(biāo)尺100um）第四節(jié)、成體干細(xì)胞 一、概念和生物學(xué)特征 概念： 指一群分布在成體組織中尚未分化的、具有自我更新、并負(fù)有構(gòu)建和補(bǔ)充某種組織的各種類型細(xì)胞潛能的干細(xì)胞。 生物學(xué)特征： 1、慢周期性 2、自我更新和再生能力的有限性 3、不對(duì)稱分裂 4、細(xì)胞鑒定標(biāo)志 造血干細(xì)胞是體內(nèi)各種血細(xì)胞的唯一來源，它主要存在于骨髓、外周血、臍帶血中。 造血干細(xì)胞的移植是治療血液系統(tǒng)疾病、先天性遺傳疾病以及多發(fā)性轉(zhuǎn)移性腫瘤疾病的最有效方法。 與骨髓移植和外周血干細(xì)胞移植相比，臍血干細(xì)胞移植的長(zhǎng)處在于無來源的限制，對(duì)HLA配型要求不高，不易受病毒或腫瘤的污染。 骨髓；1/400 外周血；1/100000 臍

13、帶血；1/10000 胎兒造血系統(tǒng)； 胚胎干細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)胞。 二、成體干細(xì)胞的分離與鑒定（以HSC為例） 無菌采集骨髓 低滲處理 密度梯度離 心 獲單核細(xì)胞 CD34抗體標(biāo)記 流式細(xì)胞儀分離結(jié)合免疫吸附分離 鑒定。Culturing Hematopoietic Stem Cell如造血干細(xì)胞的鑒定：如造血干細(xì)胞的鑒定： 細(xì)胞形態(tài) ：集落呈非貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)較小 細(xì)胞表面標(biāo)志：flk-1（Fetal Liver Kinase 1); L/TAL-1； CD34；GATA-1； 基因表達(dá)：TAL-1；GATA-2 ；H1；主要珠蛋白 體外移植：漿細(xì)胞移植給患者能恢復(fù)造血功能，并且二次移植仍可

14、重建造血系統(tǒng)。 移植前處理:超大劑量的放療、化療盡量消滅腫瘤細(xì)胞，同時(shí)抑制患者的免疫系統(tǒng)，使供體者的造血干細(xì)胞可以順利植入。 采集供體者的造血干細(xì)胞（骨髓、外周血、臍帶血），并與受體進(jìn)行HLA配型； 將造血干細(xì)胞輸入到受體者體內(nèi)，造血干細(xì)胞會(huì)自動(dòng)定居到脊髓。三、成體干細(xì)胞的應(yīng)用：細(xì)胞移植技術(shù) 細(xì)胞類型細(xì)胞類型 治療的疾病治療的疾病神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞 中風(fēng)、帕金森氏病、老年癡呆癥、中風(fēng)、帕金森氏病、老年癡呆癥、 脊髓損傷、多發(fā)性硬化病脊髓損傷、多發(fā)性硬化病心肌細(xì)胞心肌細(xì)胞 心臟病發(fā)作、充血性心臟病心臟病發(fā)作、充血性心臟病產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞 糖尿病糖尿病軟骨細(xì)胞軟骨細(xì)胞 骨性關(guān)節(jié)炎骨性

15、關(guān)節(jié)炎血細(xì)胞血細(xì)胞 癌癥、免疫缺乏癥、遺傳學(xué)血液癌癥、免疫缺乏癥、遺傳學(xué)血液 病、白血病病、白血病肝細(xì)胞肝細(xì)胞肝炎、肝硬化肝炎、肝硬化皮膚細(xì)胞皮膚細(xì)胞燒傷燒傷骨細(xì)胞骨細(xì)胞骨質(zhì)疏松癥骨質(zhì)疏松癥視網(wǎng)視網(wǎng)(眼眼)細(xì)胞細(xì)胞黃斑癥黃斑癥骨骼肌細(xì)胞骨骼肌細(xì)胞 肌肉萎縮癥肌肉萎縮癥四、干細(xì)胞技術(shù)研究面臨的問題四、干細(xì)胞技術(shù)研究面臨的問題 用于干細(xì)胞研究的胚胎來源困難用于干細(xì)胞研究的胚胎來源困難; ; 如何保持干細(xì)胞的全能性，并控制向特別類型細(xì)胞如何保持干細(xì)胞的全能性，并控制向特別類型細(xì)胞轉(zhuǎn)化？轉(zhuǎn)化？ 如何分離、純化干細(xì)胞？如何分離、純化干細(xì)胞？ 分化后的細(xì)胞是否有致瘤性？分化后的細(xì)胞是否有致瘤性？ 干細(xì)胞在

16、體外發(fā)育成完整的器官尚難以做到干細(xì)胞在體外發(fā)育成完整的器官尚難以做到; ; 分化細(xì)胞移植仍有可能發(fā)生免疫排斥分化細(xì)胞移植仍有可能發(fā)生免疫排斥; ; 倫理問題倫理問題 作業(yè)題 1、什么是干細(xì)胞？如何分類？ 2、干細(xì)胞有什么生物學(xué)特性？ 3、簡(jiǎn)述來源于ICM的胚胎干細(xì)胞分離方法。 4、ESC培養(yǎng)時(shí)常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞有哪些？其作用是是什么？ 5、什么是成體干細(xì)胞？有哪些種類？補(bǔ)充知識(shí)：組織工程.組織工程的概念應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)的原理和方法，研究細(xì)胞、組織誘導(dǎo)因子和生物材料間相互作用的關(guān)系，研制生物性替代物用以修復(fù)或重建組織器官的結(jié)構(gòu)，維持、恢復(fù)和改善病損組織或器官的功能。 1993年Langer及V

17、acanti兩位學(xué)者在著名的”Science”學(xué)術(shù)期刊上提出組織工程(tissue engineering)的構(gòu)想，隨後根據(jù)此構(gòu)想將軟骨細(xì)胞培養(yǎng)於人耳形狀的生醫(yī)材料上，再植入老鼠背部(上圖)，形成具有耳朵外觀的組織，此一前瞻性技術(shù)成為組織工程研究的先驅(qū)。 2.組織工程的方法 活體組織細(xì)胞分離 與胞外基質(zhì)分子混合 細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增形成組織 移植到體內(nèi).組織工程的三要素細(xì)胞、支架、信號(hào)細(xì)胞、支架、信號(hào)（1 1）種子細(xì)胞）種子細(xì)胞 細(xì)胞必須能不斷進(jìn)行細(xì)胞分裂，且必須能被調(diào)控分化成特定的組織細(xì)胞 干細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞(如MSC) 組織來源細(xì)胞：自體或異體組織細(xì)胞Growth factor s

18、timulation（2 2）組織生長(zhǎng)支架需求：）組織生長(zhǎng)支架需求： 符合生物安全性要求符合生物安全性要求 合適的可生物降解吸收性合適的可生物降解吸收性 合適的孔尺寸、高孔隙率和相連的孔形態(tài)合適的孔尺寸、高孔隙率和相連的孔形態(tài) 特定的三維外形特定的三維外形 高表面積和合適的表面理化性質(zhì)高表面積和合適的表面理化性質(zhì) 與植入部位組織力學(xué)性能相匹配的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度與植入部位組織力學(xué)性能相匹配的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度組織工程支架的來源組織工程支架的來源支架材料支架材料天然高分子材料天然高分子材料合成降解聚合物合成降解聚合物生物陶瓷生物陶瓷生物復(fù)合材料生物復(fù)合材料不同形態(tài)結(jié)構(gòu)的組織工程生物材料天然高分子材料天然高分子材料蛋白質(zhì)支架蛋白質(zhì)支架 膠原膠原 明膠明膠多糖支架多糖支架 海藻酸鹽海藻酸鹽 殼聚糖殼聚糖 透明質(zhì)酸透明質(zhì)酸蛋白質(zhì)多糖支架蛋白質(zhì)多糖支架合成聚合物材料合成聚合物材料聚丙烯酸及其衍生物聚丙烯酸及其衍生物聚乙二醇及其共聚物聚乙二醇及其共聚物 聚乙烯醇聚乙烯醇聚交酯聚交酯聚乳酸（聚乳酸（PLAPLA）聚（聚（D,L-D,L-乳酸乳酸-co-co-乙醇酸）（乙醇酸）（PLGAPLGA）聚乙交酯（聚乙交酯（PGAPGA）等）等支架設(shè)計(jì)及制備技術(shù)支架設(shè)計(jì)及制備技術(shù)生物陶瓷生物陶瓷磷酸鈣陶瓷磷酸鈣陶瓷聚磷酸鈣聚磷酸鈣羥基磷灰石羥基磷灰石珊瑚（碳酸鈣）珊瑚（碳酸鈣）支架設(shè)計(jì)及制備技術(shù)支架設(shè)計(jì)及制備