細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn)操作步驟(Transwell)

1、遷移實(shí)驗(yàn)(cellmigrationassay)實(shí)驗(yàn)介紹細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，將研究的細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。實(shí)驗(yàn)步驟：1材料準(zhǔn)備：可拍照顯微鏡，Transwell小室，孔徑8pm，沒包被膠的（Coster和Corning公司的也較常用），Transwell遷移實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)板24孔板。細(xì)胞培養(yǎng)板應(yīng)當(dāng)與購(gòu)買的Transwell小室相配套，BD

2、公司的Matrigel無血清DMEM，（1%胎牛血清）DMEM和1640培養(yǎng)基，DMEM完全培養(yǎng)基，1640完全培養(yǎng)基（也可加到20%血清），無菌PBS，棉簽，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，結(jié)晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS結(jié)晶紫）2步驟和流程2.1基質(zhì)膠鋪板：用BD公司的Matrigel:8（根據(jù)細(xì)胞產(chǎn)生mmp的量來決定）稀釋，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37°C30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進(jìn)行基底膜水化。2.2制備細(xì)胞懸液 制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓1224h，進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。 消化細(xì)胞，終止消化后離心

3、棄去培養(yǎng)液，（用PBS洗12遍），用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至5x105/mlo2.3接種細(xì)胞 取細(xì)胞懸液100l加入Transwell小室。 24孔板下室一般加入600l含20%FBS的培養(yǎng)基，特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會(huì)有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時(shí)候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。 培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)1248h（主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定）。24h較常見，時(shí)間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對(duì)細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。2.4結(jié)果統(tǒng)計(jì)直接計(jì)數(shù)法，“貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù)，這里所謂的

4、“貼壁”是指細(xì)胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會(huì)掉到下室里面去，通過給細(xì)胞染色，可在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，甲醇固定30分鐘，將小室適當(dāng)風(fēng)干。0.1%結(jié)晶紫染色20min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，用PBS洗3遍。400倍顯微鏡下隨即五個(gè)視野觀察細(xì)胞，記數(shù)。實(shí)驗(yàn)材料(1) Transwellchamber:24-well,8.0-umporemembranes(Corning)(2) 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：無血清培養(yǎng)基，10%血清培養(yǎng)基，PBS,0.02%EDTA(3) 固定液：甲醇(4) 染色液：Giemsa染液(5) 封片劑：中性

5、樹膠(6) 其他：小鑷子，棉棒，載玻片，蓋玻片操作步驟(1) 所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑和Transwellchamber放在37°C溫育；(2) 待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化細(xì)胞，用PBS和無血清培養(yǎng)基先后洗滌一次，用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為2X105/ml；(3) 在下室(即24孔板底部)加入600800口l含10%血清的培養(yǎng)基，上室加入100150口l細(xì)胞懸液，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24小時(shí)；(4) 用鑷子小心取出chamber，吸干上室液體，移到預(yù)先加入約800口l甲醇的孔中，室溫固定30分鐘；(5) 取出chamber，吸干上室固定液，移到預(yù)先加入約800ulGiemsa染液

6、的孔中，室溫染色1530分鐘；(6) 輕輕用清水沖洗浸泡數(shù)次，取出chamber，吸去上室液體，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞；(7) 用小鑷子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至載玻片上用中性樹膠封片；(8) 顯微鏡下取9個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。注意事項(xiàng)(1) 根據(jù)待測(cè)細(xì)胞體積大小選擇合適孔徑的chamber。常用的為8.0-um孔徑(如AGS細(xì)胞)，如果細(xì)胞體積較大可以考慮用10-um孔徑；(2) 根據(jù)待測(cè)細(xì)胞的遷移能力強(qiáng)弱調(diào)整細(xì)胞數(shù)和遷移時(shí)間。常規(guī)24-wellchamber接種細(xì)胞數(shù)約為25X104/well，遷移時(shí)間1236小時(shí)；(3) 由于Corning公司的24-Transw

7、ell內(nèi)含12個(gè)獨(dú)立的chamber，為了避免操作污染，每次實(shí)驗(yàn)可預(yù)先另準(zhǔn)備一塊24孔普通培養(yǎng)板(Corning)；(4) 如果細(xì)胞遷移能力較弱，下室液體可用3T3細(xì)胞無血清培養(yǎng)24小時(shí)獲得的上清加50ug/mlFN(Fibronectin)，具體可查閱相關(guān)文獻(xiàn)；(5) 細(xì)胞懸液加入膜中央，盡量保證液面水平；(6) 固定染色擦洗時(shí)動(dòng)作小心，避免擦去膜底面的細(xì)胞。但一定要充分擦凈膜表面上未遷移的細(xì)胞，以免影響讀數(shù)。尤其是膜周邊上可用細(xì)牙簽或小鑷子纏上濕棉花擦洗，但要小心避免將膜戳破；(7) Chamber和膜上都無法標(biāo)記，操作時(shí)應(yīng)小心避免混淆實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組；(8) 充分晾干，避免殘留水分導(dǎo)致鏡下

8、聚焦不一致。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(cellinvasionassay)實(shí)驗(yàn)材料(1) Matrigel(BD5mg/ml),-20°C保存(2) 其余材料同遷移實(shí)驗(yàn)操作步驟(1) Matrigel在4C過夜融化；(2) 用4C預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至終濃度lmg/ml，冰上操作；(3) 在chamber上室底部中央垂直加入100口l稀釋后的Matrigel,37C溫育45小時(shí)使其干成膠狀；(4) 后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)(1-8)。注意事項(xiàng)(1) Matrigel在過高或過低的溫度均易凝固，因此操作所需槍頭和離心管應(yīng)提前在4C預(yù)冷；(2) 鋪膠時(shí)保證液面水平，膠的厚度均勻一致，切勿

9、產(chǎn)生氣泡；(3) 其他注意事項(xiàng)同遷移試驗(yàn)。其他Transwell做腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)的具體步驟(1)基質(zhì)膠準(zhǔn)備：將凍存于一80度冰箱的BDmatrigel4度過夜(24h),變成液態(tài)；(2)取300ul無血清培養(yǎng)基，加入60ul(或50ug/每室)Matrigel,混勻，(4C操作,最好在冰浴上)，加入上室各100ul(3個(gè)室)；放入37C培養(yǎng)箱中，孵育4-5h(>5h)；此間經(jīng)常觀察，當(dāng)出現(xiàn)“白色層”時(shí)，說明已經(jīng)變?yōu)楣虘B(tài)。注釋：無血清培養(yǎng)基和基質(zhì)膠按1:5稀釋，每孔加50ul，在37C培養(yǎng)箱中1-2h。(3)消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗3次，計(jì)數(shù)，配成細(xì)胞懸液；(4)用無血清培養(yǎng)基洗Matrig

10、el洗1次；每孔加入100ul細(xì)胞懸液；(5)下腔室中加入500ul含有20%FBS條件培養(yǎng)基；(6)37C培養(yǎng)箱中，孵育20-24h；(7) 取出transwel用PBS洗2遍，5%戊二醛固定，4C；(8)加入結(jié)晶紫(0.1%)染色或Giemsa染色(510min)，室溫0.5h，PBS洗2遍,用棉球擦去上表面細(xì)胞，顯微鏡下觀察。遷移實(shí)驗(yàn)transwell在24孔板中浸泡1小時(shí)；消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗2次，計(jì)數(shù)，配成細(xì)胞懸液，每孔加入100ul細(xì)胞懸液；加藥刺激；下腔室中加入條件培養(yǎng)基或其他刺激因子；37°C培養(yǎng)箱中，孵育20-24h；取出transwel用PBS洗2遍，5%戊二醛固定，4°C；PBS洗2遍，加入結(jié)晶紫（0.1%）染色，室溫0.5h,PBS洗2遍，用棉球擦去上表面細(xì)胞，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)10照相，記錄。侵襲實(shí)驗(yàn)取300ul無血清培養(yǎng)基，加入30ul（或50ug/每室）Matrigel，混勻，（4C操作，最好在冰浴上），加入上室各100ul（3個(gè)室）；放入37C培養(yǎng)箱中，孵育4-5h（5h）；消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗3次，計(jì)數(shù)，配成細(xì)胞懸液；用無血清培養(yǎng)基洗Matrigel洗1次；每孔加入100ul細(xì)胞懸液；下腔室中加入600ul無血清條件培養(yǎng)基；37C培養(yǎng)箱中，孵育20-24h；取出transwell用PBS洗2遍，5%戊二醛固定