重組體分子選擇與鑒定方法及鑒定

1、重組體分子的選擇與鑒定方法及原理重組體分子的選擇與鑒定方法及原理 重組體分子的選擇與鑒定方法重組體分子的選擇與鑒定方法 我們把外源基因導入受體細胞的目的是獲得帶有目的基因目的是獲得帶有目的基因 陽性重組體陽性重組體，因而重組體的篩選是體外重組技術的一個重 要環(huán)節(jié)。 涂布菌液，觀察平板是無法判斷重組子是否是我們所需的。 因此，我們需要進一步進行篩選。 常用的篩選方法常用的篩選方法概括起來有兩大類：直接篩選法；間 接篩選法。直接篩選法直接篩選法 直接篩選法是借助遺傳學表型遺傳學表型來進行篩選的方法。 重組子轉化宿主細胞后，載體上的一些篩選標志基因表標志基因表 達達，會導致宿主的某些表型的改變，通過

2、瓊脂平板中添加 相應篩選物質，可以直接篩選含重組子的菌落。如果質粒 上有兩種抗性，因為外源基因的插入，導致其中一個不其中一個不能能 表達表達，那么也可以通過抗藥性將重組子篩選出來。間接篩選法間接篩選法 間接篩選法是檢測重組體克隆中是否含有目的基因的核苷 酸序列或是否產生目的基因所編碼的產物。 一般來說，先用直接篩選法進行初步篩選后，再用間接檢 測法進行鑒定，直至獲得我們所需要的陽性重組體。DNA水平RNA水平蛋白質水平遺傳表型直接篩選法遺傳表型直接篩選法核酸分子雜交法核酸分子雜交法PCR法法DNA序列分析法直接凝膠電泳法直接凝膠電泳法酶切片段分析法酶切片段分析法重組子篩選檢測特定外源基因是否轉

3、錄及轉錄的強度（Northern雜交印跡法) 免疫化學檢測法（放射性抗體檢測法、 免疫沉淀檢測法） Westhern印跡雜交法重組子篩選的方法重點介紹的篩選方法重點介紹的篩選方法間接選擇法抗藥性篩選a互補快速裂解菌落鑒定分子大小限制性內切酶酶切法PCR方法篩選鑒定重組子遺傳表型直接選擇法菌落雜交篩選 遺傳學表型篩選的方法之一遺傳學表型篩選的方法之一抗藥性篩選抗藥性篩選 基本原理 抗藥性篩選主要用于重組質粒DNA分子的轉化子的篩選。 因為質粒DNA攜帶有特定的抗藥性選擇標記基因抗藥性選擇標記基因，與目的 基因重組后，轉入受體菌，能使受體菌帶有相應抗藥性， 另一種情況是雖然質粒中原來有相應抗性，但

4、插入外源片 段后重組質粒失去抗藥性，據此我們也可以進行抗藥性篩 選。 常用的抗藥性選擇標記抗藥性溶解劑慮過除菌貯存溫度貯存濃度終濃度氨芐青霉素（Amp）氯霉素（Cm） 水 乙醇 是 否 -20 -2050mg/ml34mg/ml50100g/ml20170g/ml卡那霉素（Ka或Kan）水 是 -2010mg/ml 50g/ml四環(huán)素（Tet或Tc） 乙醇 否 -2012.5mg/ml10g/ml（液） 12.5g/ml （固）鏈霉素（Sm或Str） 水 是 -2020mg/ml25g/mlA 如果外源基因片段外源基因片段插入載體的位點在抗藥性基之外在抗藥性基之外， 不導致抗藥性基因的失活，仍

5、能編碼抗藥性基因產物仍能編碼抗藥性基因產物。 含有這種重組子的轉化細胞可以在含有相應抗生素的瓊 脂平板上生長成菌落，未能接受載體DNA的細胞因不能 生長而被排除。 b：如果外源基因片段外源基因片段插入載體的位點在抗藥性基因中中 間間，導致抗藥性基因失活抗藥性基因失活，這個抗藥性標志就會失活。 檢測外源DNA插入作用的一種通用的方法是插人失活插人失活 效應效應 。 a類篩選 基本原理 抗藥性篩選主要用于重組質粒DNA分子的轉化子的篩選。 因為重組質粒DNA攜帶有特定的抗藥性選擇標記基因抗藥性選擇標記基因，轉 化受體菌后能使后者在含有相應選擇藥物的選擇培養(yǎng)基上 生長，而不含重組質粒DNA分子的受體

6、菌則不能存活。a類篩選的實驗方法 LB固體培養(yǎng)基中加入千分之一的抗性藥物，再倒平板； 將轉化后的菌液均勻涂布在平板上； 放在37培養(yǎng)箱培養(yǎng)1216小時； 觀察菌落生長情況?？顾幮詷擞浄ㄊ疽鈭D b類插入失活篩選 從原理上講，當外源基因(或DNA片段)插入到某一基因內 的位點后, 使這個基因喪失了原有的功能叫插入失活 (insertional inactivation) 。插入失活法是從不同的重組 DNA分子獲得的轉化子中鑒定出含有目的基因的轉化子 （篩選）的主要方法。 例如：例如： 非重組的pBR322質粒DNA上的四環(huán)素和氨芐青霉素四環(huán)素和氨芐青霉素抗性 基因都是正常的, 表型為AprTcr。

7、帶有這種質粒的受體菌 可以在加有四環(huán)素和氨芐青霉素的雙抗性平板上生長雙抗性平板上生長。但 是, 如果在該質粒的氨芐青霉素抗性基因內插入外源片段外源片段, 就會造成氨芐青霉素抗性基因失活氨芐青霉素抗性基因失活, 變成ApsTcr, 攜帶這種 質粒的宿主菌可以在四環(huán)素的平板上生長在四環(huán)素的平板上生長, 而不能在氨芐不能在氨芐 青霉素抗性平板上生長青霉素抗性平板上生長。 B類插入失活篩選步驟 注意事項： （1）以Amp、Tc等抗生素作為選擇藥物，37培養(yǎng)時間 約1216h，超過時間視為雜菌（假轉化子菌落）。 （2）挑選單菌落作為轉化子以便進一步實驗驗證。挑的 菌落在LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)。遺傳學表型篩

8、選的方法二a互補 基本原理： 這種篩選方法適用于含含b-b-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因的載體。載體在 b-半乳糖苷酶的a-肽編碼區(qū)具有多克隆區(qū)域。重組質粒中 的插入片段使a-a-肽失活肽失活，可在指示平板上通過顏色篩選鑒 別。不帶有插入片段的載體表達有活力的b-半乳糖苷酶， 所用的宿主菌在染色體或附加體上缺失掉在染色體或附加體上缺失掉LacZM15LacZM15基因基因， 導致內源a-肽失活。載體或其他含LacZ基因的a-肽互補 細菌，具有b-半乳糖苷酶的w片段。 所得到的活力b-半乳糖苷酶（ a-肽加w片段）將底物X- Gal轉化為有顏色的產物，得到藍色菌落。在載體多克隆 區(qū)域，克隆上插入

9、片段導致插入片段導致a-a-肽編碼區(qū)的破壞肽編碼區(qū)的破壞，使b-半乳 糖苷酶失活，得到白色菌落。 a-肽編碼區(qū)讀碼框內小的 插入片段產生淺藍色菌落，因b-半乳糖苷酶只是部分失活。 通常藍白篩選是與抗性篩選一同使用的藍白篩選是與抗性篩選一同使用的 。這樣 一次篩選 可以判斷出：未轉化的菌不具有抗性，不生長；轉化了空 載體，即未重組質粒的菌，長成藍色菌落；轉化了重組 質粒的菌，即目的重組菌，長成白色菌落。藍白斑篩選X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)，IPTG (異丙基硫代-D-半乳糖苷) X-gal被沒分解后的產物為5-溴-4-氯-靛藍無質粒的無質粒的 受體菌受體菌質粒轉化質粒轉

10、化的受體菌的受體菌帶外源帶外源DNADNA插插入的質粒轉入的質粒轉化的受體菌化的受體菌b-半乳糖苷酶部分缺失，不能分解Xgal；無抗菌素抗性無菌斑無菌斑生長生長b-半乳糖苷酶的缺失被載體產物a互補，能分解Xgal。且有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有藍有藍色菌色菌斑生斑生長長載體產物失活，不能互補b-半乳糖苷酶的缺失。不能分解Xgal，但有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有白有白色菌色菌斑生斑生長長不能正常生長實驗中的藍白斑篩選 藍白斑篩選 注意事項：（1）菌液涂布量為90mm平皿50100 l;（2）由于被轉化的基因產物作用于X-gal需要較長時間，因 此，觀察和確

11、定轉化子菌落的培養(yǎng)時間可適當延長。 與37溫箱取出后放4 冰箱幾小時后觀察效果更好；（3）為了防止假陽性需挑菌進一步驗證；（4）宿主菌的b-半乳糖苷酶的a-肽編碼區(qū)應在染色體或附 加體上缺失。依賴于重組子結構特征分析的篩選法之一依賴于重組子結構特征分析的篩選法之一快速裂解菌落鑒定分子大小快速裂解菌落鑒定分子大小 基本原理： 由于外源片段插入的重組質粒與載體大小不同，我們可以 利用瓊脂糖凝膠電泳將重組體分離出來。利用此種方法就 需要將用裂解液將菌體懸浮，保溫15min30min，再 12000rmp離心10min,上清中既含我們所需獲得質粒。 此方法直觀快捷，適用于插入片段較大的重組子的篩選。

12、電泳法能篩選出有插入片段的陽性重組體，但不能鑒別插入 片段大小相近的非目的基因片段。依賴于重組子結構特征分析的篩選方法二依賴于重組子結構特征分析的篩選方法二限制性內切酶酶切方法鑒定重組子限制性內切酶酶切方法鑒定重組子 基本原理： 根據已知的外源DNA序列的限制酶切圖譜，選擇一兩種 內切酶切割質粒，電泳后比較電泳結果（DNA的帶數和 長度）?；蛴煤线m的內切酶酶切插入片段，再用其它酶 酶切這個片段，電泳后比較電泳結果是否符合預計的結 果。電泳后的圖譜挑三個菌落鑒定，圖顯示的是三個菌落中的質粒雙酶切的結果依賴于重組子結構特征分析的篩選方法三依賴于重組子結構特征分析的篩選方法三PCR方法篩選鑒定重組子

13、方法篩選鑒定重組子 基本原理： 在載體DNA分子中，外源DNA插入位點兩側的序列多為已知，通過與插入位點兩側已知序列互補的引物，從單 克隆中提取少量質粒DNA作為模板進行PCR擴增，瓊脂 糖凝膠電泳分析確定是否為重組子。 注意事項： 如需檢測插入片段及其方向，使用載體特異引物和方向 插入特異引物或互換。如只需確認是否存在插入片段， 可用2個插入片段特異引物。擴增反應前在94變性兩 分鐘，有利于細菌的裂解，提高PCR產物擴增的成功。 1 主要原理主要原理 用體外標記目的基因DNA或相應的RNA為探針同轉化后的菌落進行原位雜交原位雜交，篩選含重組DNA的克隆。這個方法可以快速地從數百個菌落中挑選出

14、含有重組DNA的克隆。 該方法的優(yōu)點是通用性比較強優(yōu)點是通用性比較強，可以用來檢測任何一種插入的DNA序列。這種方法依據的是核酸分子雜交的原理核酸分子雜交的原理，而不以插入的DNA序列能否實現基因表達為前提，因此，只要有可利用的標記探針就可檢測出重組質粒DNA。 重組質粒重組質粒DNA的菌落雜交篩選的菌落雜交篩選 方法： 1 硝酸纖維素膜的準備硝酸纖維素膜的準備：將硝酸纖維素膜剪成直徑為8cm 的圓形，放人一個干凈的平皿內，高壓滅菌，待用。 2 將無菌的作有標記的硝酸纖維素膜鋪在含有相應抗生素鋪在含有相應抗生素 的瓊脂糖培養(yǎng)基平皿上的瓊脂糖培養(yǎng)基平皿上，用無菌的L型玻璃棒去除膜與培 養(yǎng)基間的氣

15、泡，約12min，培養(yǎng)基即可將濾膜浸濕。 3 用無菌牙簽將轉化平皿中選擇的菌落接種到濾膜上菌落接種到濾膜上，同 時接種到另一含有相應抗生素的瓊脂糖平皿的對應位置， 并作為標記菌落參照。每個90mm的平皿上大約可接種 100個菌落。 4 將平皿置于 37培養(yǎng) 23h，菌落長到1mm時，把濾把濾 膜轉移到另一塊含有氯霉素（膜轉移到另一塊含有氯霉素（170ugml）的瓊脂糖平皿）的瓊脂糖平皿 上上，菌落面向上，37培養(yǎng)1520h，擴增質粒。另一個 菌落對照平皿 37培養(yǎng)過夜后，密封，4保存。 5 把濾膜從平皿中取出，菌落面朝上，置于有一薄層變性置于有一薄層變性 液的塑料膜上液的塑料膜上，變性處理10

16、min，然后用干濾紙吸干變性 液；再將菌落面朝上置于有一薄層中和溶液的塑料膜上有一薄層中和溶液的塑料膜上， 中和兩次，每次15min。室溫晾干后，再置于80真空干 燥12h。 6 雜交：把濾膜浸入預雜交液濾膜浸入預雜交液中，在60下放置6h；把同同 位素標記的位素標記的DNA探針探針于100變性后加入雜交溶液中，然 后放入濾膜，60雜交1624h。探針的用量一般為105 106cpm/ml。用2SSC洗脫3次，每次30min。 7 放射自顯影放射自顯影：將洗好的濾膜用吸水紙吸干，夾于兩層保 鮮膜中，在暗室內放進暗盒，放好X線片，并于X線片上 作好標記，置于70冰箱暴光4872h。 8 洗片：在

17、暗室內取出X線片，進行顯影和定影，分析雜 交結果。 注意事項注意事項： (1) 菌落雜交與DNA的吸印轉膜雜交與斑點雜交不同，后者 一般只有DNA，而菌落雜交時，許多菌體成分與DNA一起 形成斑點，即使經過固定步驟之后，DNA與膜的結合很不 牢固。因此，菌落雜交菌落雜交與純核酸的雜交最適溫度最適溫度不同，一 般溫度略低略低一些可防止DNA從膜上脫落。 (2) 為防止防止濾膜上菌落脫落或移位落脫落或移位，可采用抽吸方法進行采用抽吸方法進行 DNA變性變性：即將濾膜菌落面向上，置于4層用變性液浸透的 Whatman 3MM濾紙上，放置5min，然后把濾液放到一 合適的抽濾器上，用水泵或負壓抽至菌落接