病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)一

1、病原生物學(xué)教研室病原生物學(xué)教研室郝振華郝振華病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)一病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)一主要內(nèi)容主要內(nèi)容生物安全生物安全培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備消毒滅菌消毒滅菌生物安全生物安全操作在通常情況下不會(huì)引起人類或者動(dòng)物疾病的操作在通常情況下不會(huì)引起人類或者動(dòng)物疾病的微生物微生物操作能夠引起人類或者動(dòng)物疾病，但一般情況操作能夠引起人類或者動(dòng)物疾病，但一般情況下對(duì)人、動(dòng)物或者環(huán)境不構(gòu)成嚴(yán)重危害下對(duì)人、動(dòng)物或者環(huán)境不構(gòu)成嚴(yán)重危害操作能夠引起人類或者動(dòng)物嚴(yán)重疾病，比操作能夠引起人類或者動(dòng)物嚴(yán)重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動(dòng)物與人、較容易直接或者間接在人與人、動(dòng)物與人、動(dòng)物與動(dòng)物間傳播的微生物動(dòng)物與動(dòng)物間傳播的微

2、生物操作能夠引起人類或者動(dòng)物非常嚴(yán)重疾操作能夠引起人類或者動(dòng)物非常嚴(yán)重疾病的微生物，尚無有效預(yù)防或治療方法病的微生物，尚無有效預(yù)防或治療方法P4P4實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室P2P2實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室P1P1實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室P3實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則 學(xué)生進(jìn)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必須穿好工作服，離室需脫下反折，學(xué)生進(jìn)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必須穿好工作服，離室需脫下反折，要經(jīng)常清洗消毒。要經(jīng)常清洗消毒。 進(jìn)實(shí)驗(yàn)室時(shí)隨帶書包、衣物等與實(shí)驗(yàn)無關(guān)物品一律存放指定進(jìn)實(shí)驗(yàn)室時(shí)隨帶書包、衣物等與實(shí)驗(yàn)無關(guān)物品一律存放指定的儲(chǔ)物柜內(nèi)。的儲(chǔ)物柜內(nèi)。 嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)食、飲水和喧嘩打鬧。嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)食、飲水和喧嘩打鬧。

3、手拿培養(yǎng)物后或出實(shí)驗(yàn)室前要洗手，必要時(shí)用消毒液泡手；手拿培養(yǎng)物后或出實(shí)驗(yàn)室前要洗手，必要時(shí)用消毒液泡手；避免有菌材料濺出；破損器材及時(shí)處理并報(bào)告。避免有菌材料濺出；破損器材及時(shí)處理并報(bào)告。 實(shí)驗(yàn)過程中避免一切不良的個(gè)人習(xí)慣；實(shí)驗(yàn)過程中避免一切不良的個(gè)人習(xí)慣；操作中產(chǎn)生的廢料要操作中產(chǎn)生的廢料要扔在指定容器內(nèi)扔在指定容器內(nèi)；實(shí)驗(yàn)完畢清理臺(tái)面，值日生嚴(yán)格認(rèn)真打掃；實(shí)驗(yàn)完畢清理臺(tái)面，值日生嚴(yán)格認(rèn)真打掃衛(wèi)生，關(guān)閉水電，門窗，洗手后離開實(shí)驗(yàn)室。衛(wèi)生，關(guān)閉水電，門窗，洗手后離開實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室意外緊急處理辦法實(shí)驗(yàn)室意外緊急處理辦法 1 1 皮膚破損皮膚破損：去除異物，生理鹽水或蒸餾水洗凈后：去除異物，生理鹽

4、水或蒸餾水洗凈后2%2%碘酊或碘酊或2%2%紅紅汞涂抹。汞涂抹。 2 2 燒傷：局部涂凡士林，燒傷：局部涂凡士林，2%2%鞣酸或鞣酸或2%2%苦味酸。苦味酸。 3 3 化學(xué)藥品腐蝕傷：若強(qiáng)酸則先用大量清水沖洗，再用碳酸氫鈉化學(xué)藥品腐蝕傷：若強(qiáng)酸則先用大量清水沖洗，再用碳酸氫鈉溶液洗滌中和；若強(qiáng)堿則先用大量清水沖洗，再用溶液洗滌中和；若強(qiáng)堿則先用大量清水沖洗，再用2%2%硼酸洗滌中硼酸洗滌中和（若傷處為眼部加用橄欖油或者液體石蠟和（若傷處為眼部加用橄欖油或者液體石蠟1 12 2滴滴眼）。滴滴眼）。 4 4 菌液入口：立即吐入消毒容器內(nèi)，菌液入口：立即吐入消毒容器內(nèi)，1 1：10001000高錳酸

5、鉀或高錳酸鉀或3%3%雙氧水雙氧水漱口，根據(jù)菌種服用抗菌藥物。漱口，根據(jù)菌種服用抗菌藥物。 5 5 菌液污染臺(tái)面菌液污染臺(tái)面：2%3% %來蘇爾或來蘇爾或0.1%0.1%新潔爾滅覆蓋新潔爾滅覆蓋3030分鐘后抹分鐘后抹去，皮膚手指沾染活菌應(yīng)用上述液體浸泡去，皮膚手指沾染活菌應(yīng)用上述液體浸泡3 3分后肥皂和清水洗凈。分后肥皂和清水洗凈。 6 6 火警：勿慌，立即關(guān)閉電閘和煤氣閘。若酒精乙醇乙醚等有機(jī)火警：勿慌，立即關(guān)閉電閘和煤氣閘。若酒精乙醇乙醚等有機(jī)溶劑起火切不可用水撲救，可用沙土等物撲滅。溶劑起火切不可用水撲救，可用沙土等物撲滅。常用培養(yǎng)基的制備常用培養(yǎng)基的制備 掌握制備常用的培養(yǎng)基的制備方

6、法熟悉培養(yǎng)基制備的基本程序 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理v培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。v人工制備培養(yǎng)基的目的，在于給微生物創(chuàng)造一個(gè)人工制備培養(yǎng)基的目的，在于給微生物創(chuàng)造一個(gè)良好的營養(yǎng)條件。良好的營養(yǎng)條件。培養(yǎng)基配制要素v營養(yǎng)：碳源、氮源、能源、生長因子、水分和無營養(yǎng)：碳源、氮源、能源、生長因子、水分和無機(jī)鹽；機(jī)鹽；v適宜的酸堿度適宜的酸堿度(pH(pH值值) )和一定緩沖能力；和一定緩沖能力；v一定的氧化還原電位；一定的氧化還原電位；v合適的滲透壓。合適的滲透壓。 根據(jù)微生物的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟?/p>

7、同，培養(yǎng)根據(jù)微生物的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?，培養(yǎng)基分類可以按以下方式：基分類可以按以下方式：1.按按成分成分的不同分的不同分2.按培養(yǎng)基的按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)物理狀態(tài)分分3.按培養(yǎng)基的按培養(yǎng)基的用途用途分分培養(yǎng)基的分類培養(yǎng)基的分類按照培養(yǎng)基的成分來分：按照培養(yǎng)基的成分來分：v天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基:主要成分是復(fù)雜的天然有機(jī)物質(zhì)主要成分是復(fù)雜的天然有機(jī)物質(zhì)v合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基:用化學(xué)成分完全了解的純化合物藥用化學(xué)成分完全了解的純化合物藥品配制而成的培養(yǎng)基品配制而成的培養(yǎng)基v半合成培養(yǎng)基半合成培養(yǎng)基:以天然有機(jī)物作為微生物營養(yǎng)來以天然有機(jī)物作為微生物營養(yǎng)來源的同時(shí)，適當(dāng)補(bǔ)充一些成分已知的化學(xué)藥品源的同

8、時(shí)，適當(dāng)補(bǔ)充一些成分已知的化學(xué)藥品所配制的培養(yǎng)基所配制的培養(yǎng)基按照培養(yǎng)基的物理狀態(tài)：v固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基：加入凝固劑，如：加入凝固劑，如1.5% 2.0%瓊脂瓊脂v半固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基：加入少量凝固劑，如：加入少量凝固劑，如 0.2% 0.7%瓊脂瓊脂v液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基：不含任何凝固劑：不含任何凝固劑按照培養(yǎng)基的用途：按照培養(yǎng)基的用途：v 基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基v 營養(yǎng)培養(yǎng)基（加富培養(yǎng)基）營養(yǎng)培養(yǎng)基（加富培養(yǎng)基）v 鑒別培養(yǎng)基：鑒別培養(yǎng)基：含有特定化合物或試劑。某種微生物在這種含有特定化合物或試劑。某種微生物在這種培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，它所產(chǎn)生的某種代謝產(chǎn)物與這種特定的培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，它所產(chǎn)

9、生的某種代謝產(chǎn)物與這種特定的化合物或試劑能發(fā)生某種明顯的特征性反應(yīng)，根據(jù)這一特化合物或試劑能發(fā)生某種明顯的特征性反應(yīng)，根據(jù)這一特征性反應(yīng)可以將某種微生物與他種微生物區(qū)別開來。征性反應(yīng)可以將某種微生物與他種微生物區(qū)別開來。v 選擇培養(yǎng)基：選擇培養(yǎng)基：利用微生物對(duì)某種化學(xué)物質(zhì)的敏感性不同，利用微生物對(duì)某種化學(xué)物質(zhì)的敏感性不同，在培養(yǎng)基中加入這類物質(zhì)，抑制不需要的微生物生長，而在培養(yǎng)基中加入這類物質(zhì)，抑制不需要的微生物生長，而利用所需分離的微生物生長，從而達(dá)到分離或鑒別某種微利用所需分離的微生物生長，從而達(dá)到分離或鑒別某種微生物的目的生物的目的。 高壓蒸氣滅菌器、電熱干燥箱、電爐、高壓蒸氣滅菌器、電

10、熱干燥箱、電爐、天平、量筒、漏斗、試管、培養(yǎng)皿、燒杯、天平、量筒、漏斗、試管、培養(yǎng)皿、燒杯、三角燒瓶、三角燒瓶、 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、SSSS瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、瓊脂等肉湯培養(yǎng)基、瓊脂等儀器材料方法步驟方法步驟（一）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（二）SS瓊脂培養(yǎng)基（三）液體培養(yǎng)基（四）半固體培養(yǎng)基（一）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（一）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 計(jì)算稱量溶化倒平板或倒試管滅菌無菌檢驗(yàn)備用 1計(jì)算：計(jì)算： 根據(jù)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的說明書了解營養(yǎng)瓊脂粉與水的比例，一般是1000 ml蒸餾水中應(yīng)加營養(yǎng)瓊脂粉32g，再根據(jù)培養(yǎng)基的需要量確定營養(yǎng)瓊脂粉的用量。 營養(yǎng)瓊脂粉的量=31.315n/

11、1000 （g） 其中： 15代表一個(gè)平板需要營養(yǎng)瓊脂約15 ml； n代表要做的培養(yǎng)基平板的數(shù)量 2稱量：稱量： 用普通天平準(zhǔn)確稱量出營養(yǎng)瓊脂粉的量，用量筒量出相應(yīng)的 蒸餾水的量，要盡量準(zhǔn)確。 3溶化： 將營養(yǎng)瓊脂粉和蒸餾水倒入搪瓷缸中，于電爐上加熱溶化，邊加熱邊攪拌，沸騰時(shí)立即從電爐上拿下，等泡沫消失后再放在電爐上加熱，注意不能讓瓊脂溢出，煮沸23次。 4試管分裝：試管分裝：若做斜面培養(yǎng)基應(yīng)倒入試管若做斜面培養(yǎng)基應(yīng)倒入試管中，量為試管的中，量為試管的1/31/3。分裝過程中，注意不要使培分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上以免養(yǎng)基沾在管（瓶）口上以免污染棉塞而引起污染。污染棉塞而引

12、起污染。5滅菌：用高壓滅菌器滅菌滅菌：用高壓滅菌器滅菌 將三角瓶、試管口蓋上將三角瓶、試管口蓋上棉塞或橡膠塞，用紙包扎好，棉塞或橡膠塞，用紙包扎好，直 立 放 入 內(nèi) 筒 中 ， 在直 立 放 入 內(nèi) 筒 中 ， 在121.3121.3滅菌滅菌20-3020-30minmin。 滅菌完畢后，將三角瓶滅菌完畢后，將三角瓶中的培養(yǎng)基無菌倒入平皿內(nèi)中的培養(yǎng)基無菌倒入平皿內(nèi)制成平板，凝固前勿動(dòng)；將制成平板，凝固前勿動(dòng)；將試管培養(yǎng)基擺成斜面，凝固試管培養(yǎng)基擺成斜面，凝固前勿動(dòng)。前勿動(dòng)。 倒倒平平板板操操作作示示意意圖圖12346無菌檢驗(yàn)：無菌檢驗(yàn)： 隨機(jī)抽取幾個(gè)平板或試管培養(yǎng)基于溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)，若無

13、菌 生長則為合格。7備用：備用： 將合格的平板培養(yǎng)基和試管培養(yǎng)基放入冰箱，在0-4中保存?zhèn)溆?。（二）（二）SS瓊脂培養(yǎng)基瓊脂培養(yǎng)基 按比例稱取SS瓊脂粉，溶解后滅菌，無菌傾注平皿制成平板。 常用于沙門氏及志賀氏菌的分離。 （三）肉湯培養(yǎng)基（三）肉湯培養(yǎng)基1成分 牛肉膏35g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水1000ml。2制法 將牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉加蒸餾水后，加熱溶解。矯正pH至7.47.6，過濾分裝。置高壓蒸氣滅菌器內(nèi)，121.3滅菌20min即成。3用途 可供一般細(xì)菌生長，同時(shí)也是制作一般培養(yǎng)基的基礎(chǔ)原料。供營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌分離培養(yǎng)，亦可供溶血性的觀察和保存菌種。（四）半固體培養(yǎng)基（

14、四）半固體培養(yǎng)基 肉湯培養(yǎng)基中加入0.3%0.5%瓊脂粉制成，用于菌種的保存或觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性。 實(shí)驗(yàn)操作內(nèi)容實(shí)驗(yàn)操作內(nèi)容 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 600ml（營養(yǎng)瓊脂（營養(yǎng)瓊脂19.2g），分裝），分裝2個(gè)三角個(gè)三角 瓶每瓶瓶每瓶300ml，其中其中1瓶加熱融化后分裝瓶加熱融化后分裝 10支斜面支斜面，每管，每管6ml 。 半固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基 100ml（肉湯粉（肉湯粉3g+瓊脂粉瓊脂粉0.5g），）， 加熱融化后加熱融化后分裝至分裝至10支試管，每管支試管，每管6ml 。 液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基 100ml（肉湯粉（肉湯粉3g），）， 混勻后直接混勻后直接分裝至分裝至10支試管，

15、每管支試管，每管6ml。 SS培養(yǎng)基培養(yǎng)基 200ml（SS瓊脂瓊脂12.4g） 混勻后直接滅菌?；靹蚝笾苯訙缇?。消毒與滅菌消毒與滅菌v 消毒消毒是一般指采用物理、化學(xué)和生物的方法消除物體的是一般指采用物理、化學(xué)和生物的方法消除物體的表面病原菌和有害微生物營養(yǎng)體的過程。表面病原菌和有害微生物營養(yǎng)體的過程。v 滅菌滅菌則是指采用物理、化學(xué)和生物的方法殺滅一切微生則是指采用物理、化學(xué)和生物的方法殺滅一切微生物的營養(yǎng)體、芽孢和孢子的過程物的營養(yǎng)體、芽孢和孢子的過程。v 在微生物實(shí)驗(yàn)中，需要進(jìn)行純培養(yǎng)，不能有任何雜菌污在微生物實(shí)驗(yàn)中，需要進(jìn)行純培養(yǎng)，不能有任何雜菌污染，因此對(duì)所用器材、培養(yǎng)基和工作場所

16、都要進(jìn)行嚴(yán)格染，因此對(duì)所用器材、培養(yǎng)基和工作場所都要進(jìn)行嚴(yán)格的消毒和滅菌。的消毒和滅菌。消毒與滅菌方法消毒與滅菌方法v加熱滅菌加熱滅菌干熱滅菌干熱滅菌濕熱滅菌濕熱滅菌v過濾除菌過濾除菌v輻射滅菌輻射滅菌放射線輻照滅菌放射線輻照滅菌紫外線滅菌紫外線滅菌v化學(xué)消毒劑化學(xué)消毒劑干熱滅菌干熱滅菌v 干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。性而達(dá)到滅菌的目的。v 干熱滅菌有火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌兩種。干熱滅菌有火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌兩種。v 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的凝固性與其含水量有關(guān)。在菌體受熱細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的凝固性與其含水量有關(guān)。在菌體

17、受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白蛋凝固就越時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白蛋凝固就越快，反之凝固緩慢?？欤粗叹徛?。v 因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度要高因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度要高（160160170170），時(shí)間要長（），時(shí)間要長（1 12h2h），但干熱滅菌溫），但干熱滅菌溫度不能超過度不能超過180180，否則，包器皿的紙或棉塞就會(huì)燒焦，否則，包器皿的紙或棉塞就會(huì)燒焦，甚至引起燃燒。甚至引起燃燒。高壓蒸汽滅菌法高壓蒸汽滅菌法壓力：壓力：1.05kg/cm2 或或103.425KPa溫度溫度: : 121.3時(shí)間：時(shí)間：15-20min完全殺滅細(xì)菌的

18、繁殖體和芽孢完全殺滅細(xì)菌的繁殖體和芽孢注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 鍋內(nèi)物品不宜過緊。鍋內(nèi)物品不宜過緊。 注意排出冷氣，否則氣壓表雖已達(dá)注意排出冷氣，否則氣壓表雖已達(dá)1515磅，溫度磅，溫度 達(dá)不到達(dá)不到121.3121.3，不能保證滅菌效果。，不能保證滅菌效果。 滅菌后排氣不能過急，以免容器內(nèi)液體外溢或滅菌后排氣不能過急，以免容器內(nèi)液體外溢或 引起破裂。引起破裂。 不耐高熱高壓之物品，不能用此法。不耐高熱高壓之物品，不能用此法。過濾除菌過濾除菌過濾除菌是通過機(jī)械作用濾去液體或氣體中細(xì)菌的過濾除菌是通過機(jī)械作用濾去液體或氣體中細(xì)菌的方法。根據(jù)不同的需要選用不同的濾器和濾板材料。方法。根據(jù)不同的需要選用不同的濾器和濾板材料。此法除菌的最大優(yōu)點(diǎn)是可以不破壞溶液中各種物質(zhì)此法除菌的最大優(yōu)點(diǎn)是可以不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分，但由于濾量有限，所以一般只適用于的化學(xué)成分，但由于濾量有限，所以