GFP功能性包涵體

1、GFP折疊突變體指示功能性包折疊突變體指示功能性包涵體產量涵體產量 研究背景研究背景 研究目的及意義研究目的及意義 結果分析結果分析 結論結論 致謝致謝1.1.研究背景研究背景 大腸桿菌表達系統(tǒng)大腸桿菌表達系統(tǒng)優(yōu)點：優(yōu)點：簡單與經濟簡單與經濟遺傳背景清晰遺傳背景清晰生長周期快生長周期快表達蛋白產量高表達蛋白產量高培養(yǎng)簡單且易于操培養(yǎng)簡單且易于操作作缺陷：缺陷： 缺乏真核細胞蛋白質缺乏真核細胞蛋白質翻譯后修飾翻譯后修飾 缺乏一些真核細胞常缺乏一些真核細胞常用的用的 tRNAtRNA 表達異源蛋白常形成表達異源蛋白常形成包涵體包涵體包涵體包涵體 傳統(tǒng)包涵體傳統(tǒng)包涵體（Inclusion Bodie

2、s，IBs）是是指不可溶、無活性的蛋白聚集體，一般指不可溶、無活性的蛋白聚集體，一般呈桿呈桿狀或卵圓形狀或卵圓形。主要缺點：主要缺點：需經過復雜的蛋白質變復性過需經過復雜的蛋白質變復性過程以恢復其生物活性程以恢復其生物活性。包涵體包涵體溶解性：溶解性：不溶于水，只溶于變性劑不溶于水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等如尿素、鹽酸胍等。功能性包涵體功能性包涵體 近幾年研究表明許多包涵體本身近幾年研究表明許多包涵體本身具具有生有生物活性，人們把這種包涵體命名為功能性包物活性，人們把這種包涵體命名為功能性包涵體（涵體（active inclusion bodies，AIBs）。優(yōu)點：優(yōu)點： 蛋白穩(wěn)定、易純

3、化蛋白穩(wěn)定、易純化產量高、成本低產量高、成本低對宿主細胞毒性小對宿主細胞毒性小無需變復性過程即可發(fā)揮生物活性無需變復性過程即可發(fā)揮生物活性影響功能性包涵體形成的因素影響功能性包涵體形成的因素 1 1、表達量過高表達量過高( (二硫鍵二硫鍵) ) 2 2、重組蛋白重組蛋白的的氨基氨基酸酸組成組成（含（含硫氨基酸硫氨基酸） 3 3、重組蛋白重組蛋白所處的環(huán)境所處的環(huán)境（高溫、（高溫、PHPH） 4 4、重組蛋白重組蛋白是異源蛋白是異源蛋白( (缺乏缺乏真核生真核生物物中中翻譯后翻譯后修修飾飾所需酶所需酶) ) 5 5、宿主選擇宿主選擇（如如選擇選擇DnaKDnaK或或ClpPClpP缺失的突變株缺

4、失的突變株） 6 6、融合融合突變的分子伴侶突變的分子伴侶（VP1,MalE31VP1,MalE31，CBDclosCBDclos） 7 7、疏水性自聚集肽、疏水性自聚集肽（18A18A，ELK16ELK16）自組裝肽自組裝肽ELK16 ELK16優(yōu)點：優(yōu)點： 可有效誘導功能性包涵體的形成可有效誘導功能性包涵體的形成 融合蛋白表達，融合蛋白表達，不會干擾細胞的不會干擾細胞的正常正常生長生長ELK16序列序列: :LELELKLKLELELKLK功能性包涵體的應用功能性包涵體的應用作為作為固定化酶固定化酶應用于應用于生物催化生物催化（ Roessl U et al，Biotechnol Lett

5、, 2010, 32:341-350）作為生物材料應用作為生物材料應用于醫(yī)學領域于醫(yī)學領域（Vzquez E et al， Adv Mater 2012, 24:17421747 ）增強對蛋白折疊增強對蛋白折疊機制機制的理解的理解（Garca-Fruits E et al， Cell Press, 2012, 30( 2) : 65- 70 ） 可以形成功能性包涵體的模式蛋白包括：可以形成功能性包涵體的模式蛋白包括：-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(-galactosidase) )D-氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶( (D-amino acid oxidase) )麥芽糊精磷酸化酶麥芽糊精磷酸化酶( (ma

6、ltodextrin phosphorylase) )綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白（green fluorescent proteingreen fluorescent protein，GFP)GFP)選擇選擇GFP作為報告蛋白作為報告蛋白的原因的原因自發(fā)熒光、熒光性質穩(wěn)定自發(fā)熒光、熒光性質穩(wěn)定可形成功能性包涵體可形成功能性包涵體存在多種折疊性不同的存在多種折疊性不同的GFP突變體突變體 四種四種GFP折疊突變體折疊突變體 EmGFP: :祖母綠綠色熒光蛋白突變體祖母綠綠色熒光蛋白突變體 sfGFP: :超折疊綠色熒光蛋白突變體超折疊綠色熒光蛋白突變體 SeGFP:新型超折疊綠色熒光突變體新型超折

7、疊綠色熒光突變體 cpGFP: :循環(huán)綠色熒光蛋白突變體循環(huán)綠色熒光蛋白突變體2.2.研究目的及意義研究目的及意義 一、分析四種一、分析四種GFP突變體蛋白的光譜學性質與熒突變體蛋白的光譜學性質與熒光強度；光強度； 二、分析四種二、分析四種GFP突變體蛋白對不同變性劑的耐突變體蛋白對不同變性劑的耐受性，探明不同突變體的折疊穩(wěn)定性；受性，探明不同突變體的折疊穩(wěn)定性； 三、三、GFP折疊折疊突變體與突變體與ELK16融合表達，誘導其融合表達，誘導其形成功能性包涵體；形成功能性包涵體； 四、四、比較比較四種四種GFP突變體所形成的包涵體產量，突變體所形成的包涵體產量，探明蛋白折疊性與包涵體產量的相關

8、性；探明蛋白折疊性與包涵體產量的相關性； 五、五、比較比較形成包涵體的全細胞的熒光強度和體外形成包涵體的全細胞的熒光強度和體外純化包涵體的熒光強度，探明蛋白折疊性與包涵純化包涵體的熒光強度，探明蛋白折疊性與包涵體活性的相關性。體活性的相關性。3.3.結果分析結果分析圖圖1 EmGFP 、SeGFP、sfGFP的氨基酸序列比對的氨基酸序列比對SeGFP與與EmGFP相比有六個氨基酸殘基突變（相比有六個氨基酸殘基突變（S30R、Y39N、N105T、Y145F、I171V和和A206V）SeGFP與與sfGFP相比有六個氨基酸殘基不同（相比有六個氨基酸殘基不同（A72S、Q80R、K149N、V1

9、63A、T167I和和L231H）3.1 四種四種GFP重組基因的氨基酸序列比對重組基因的氨基酸序列比對圖圖2 cpGFP的氨基酸序列的氨基酸序列SeGFP氨基酸序列氨基酸序列C端的端的81個氨基酸裝在個氨基酸裝在cpGFP的的N端端，N端的端的156個氨基酸裝在個氨基酸裝在cpGFP的的C端端，中間用中間用GGGS Linker進行連接進行連接，與與ELK16之間用之間用PT linker連接。連接。3.2 四種四種GFP重組蛋白的表達與純化重組蛋白的表達與純化電泳顯示四種電泳顯示四種GFP均為一主均為一主條帶，純度相對較高。條帶，純度相對較高。 圖圖3 四種重組四種重組GFP在大腸桿在大腸

10、桿菌中的表達與純化菌中的表達與純化3.3四種綠色熒光蛋白的光譜掃描四種綠色熒光蛋白的光譜掃描 EmGFP 、SeGFP、cpGFP、sfGFP分別在分別在485nm、485 nm、483 nm、485 nm有吸收峰有吸收峰,說明四種綠色熒光蛋白突變體的光譜性質未發(fā)生說明四種綠色熒光蛋白突變體的光譜性質未發(fā)生明顯變化。明顯變化。圖圖4 GFP純化蛋白的光譜純化蛋白的光譜掃描掃描 A：紫外光譜；紫外光譜；B：激發(fā)光譜激發(fā)光譜 ；C：發(fā)射光譜：發(fā)射光譜圖圖4-5 純化蛋白純化蛋白EmGFP 、SeGFP、cpGFP、sfGFP的的激發(fā)和發(fā)射光譜激發(fā)和發(fā)射光譜 A：激發(fā)光譜：激發(fā)光譜 ； B：發(fā)射光譜

11、：發(fā)射光譜 激發(fā)圖譜顯示分別在激發(fā)圖譜顯示分別在486 nm、484 nm、484 nm、488 nm有最有最大吸收峰大吸收峰,發(fā)射光譜顯示分別在發(fā)射光譜顯示分別在509 nm、510 nm、510 nm、510 nm有最大吸收峰有最大吸收峰。3.4 四種四種GFP純化蛋白熒光強度與折疊穩(wěn)定性檢測純化蛋白熒光強度與折疊穩(wěn)定性檢測圖圖5 純化蛋白純化蛋白EmGFP 、SeGFP、cpGFP、sfGFP的的熒光強度熒光強度 SeGFP、sfGFP與與EmGFP、cpGFP相比相比沒有發(fā)生明顯的沒有發(fā)生明顯的熒光增強，四種熒光增強，四種GFP水溶性水溶性蛋白蛋白熒光強度無較大差異。熒光強度無較大差異

12、。圖圖6 尿素和鹽酸胍對尿素和鹽酸胍對GFP突變體的穩(wěn)定性分析突變體的穩(wěn)定性分析A：尿素：尿素 ； B：鹽酸胍：鹽酸胍3.5 四種四種GFP功能性包涵體的定性與定量分析功能性包涵體的定性與定量分析圖圖7功能性包涵體的定性與定量分析功能性包涵體的定性與定量分析A:重組蛋白重組蛋白SDS-PAGE電泳和蛋白印跡電泳和蛋白印跡SDS-PAGE電泳顯示，四種重組蛋白的上清電泳顯示，四種重組蛋白的上清、沉淀、沉淀均均存在一條特異主帶存在一條特異主帶。進一步用蛋白印進一步用蛋白印跡驗證該表達條帶為含有跡驗證該表達條帶為含有His-tag的的目的目的蛋白蛋白。圖圖4-9 沉淀與細胞的濕重比值沉淀與細胞的濕重

13、比值 結果顯示包涵體產量結果顯示包涵體產量cpGFPEmGFPSeGFPsfGFP，說明，說明包涵體產量與折疊性成包涵體產量與折疊性成反比關系。反比關系。4.6功能性包涵體的激光共聚焦顯微鏡分析功能性包涵體的激光共聚焦顯微鏡分析圖圖4-10 功能性包涵體在大腸桿菌功能性包涵體在大腸桿菌BL21(DE3)中中的細胞定位的細胞定位A：GFP B：GFP-ELK164.7 FTIR分析功能性包涵體的二級結構分析功能性包涵體的二級結構圖圖4-11 GFP-ELK16 聚集體的傅里葉紅外光譜分析聚集體的傅里葉紅外光譜分析 表明功能性包涵體中表明功能性包涵體中GFP蛋白的蛋白的折疊具備完整性折疊具備完整性

14、，GFP-ELK16聚集體中聚集體中存在存在疏水疏水-折疊的類淀粉結構折疊的類淀粉結構。4.8不同溫度條件下不同溫度條件下GFP-ELK16重組細胞熒光強度的動態(tài)分析重組細胞熒光強度的動態(tài)分析圖圖4-12 不同溫度誘導重組細胞熒光強度不同溫度誘導重組細胞熒光強度圖圖4-13 不同溫度誘導重組細胞的不同溫度誘導重組細胞的OD600 結果顯示重組細胞的結果顯示重組細胞的OD600值無較大差異，值無較大差異，說說明明GFP-ELK16重組重組細胞熒光強度是由于形成功能性包涵體而產生的熒光差異，而不是由細胞熒光強度是由于形成功能性包涵體而產生的熒光差異，而不是由于細胞表達量的影響產生的差異于細胞表達量

15、的影響產生的差異。4.9 功能性包涵體的活性分析功能性包涵體的活性分析圖圖4-14 重組細胞上清和沉淀的熒光分析重組細胞上清和沉淀的熒光分析 重組細胞沉淀的熒光值均高于上清的熒光值重組細胞沉淀的熒光值均高于上清的熒光值，沉淀的熒光值沉淀的熒光值SeGFP sfGFP cpGFP EmGFP。4.10 包涵體的形成對細胞生長的影響分析包涵體的形成對細胞生長的影響分析圖圖4-15 GFP、GFP-ELK16重組細重組細胞相對胞相對OD600 結果顯示結果顯示，四種四種GFP/ GFP-ELK16的值分別為的值分別為99.6%、91.8%、98.2%、99.0%，說明，說明ELK16融合融合蛋白表達形成包涵體不影蛋白表達形成包涵體不影響細胞的正常生長。響細胞的正常生長。4.4.結論結論 1. EmGFP 、SeGFP、cpGFP、sfGFP的光譜學性質沒的光譜學性質沒有較大差異；有較大差異； 2. ELK16可有效誘導可有效誘導GFP功能性包涵體的形成，且不影功能性包涵體的形成，且不影響重組細胞的生長；響重組細