第4章DNA的復制突變損傷和修復

1、DNA的復制、的復制、突變、損傷和修復突變、損傷和修復第第4章章第4章 DNA的復制突變損傷和修復本章內容 第一節(jié) DNA復制 第二節(jié) 基因突變 第三節(jié) DNA的修復系統(tǒng) 第4章 DNA的復制突變損傷和修復第一節(jié)第一節(jié) DNA復制復制一、DNA復制的一般特征二、原核生物DNA的復制三、真核生物DNA的復制四、線粒體DNA的復制五、噬菌體和病毒的DNA的復制六、DNA復制忠實性的保證機制第4章 DNA的復制突變損傷和修復由于DNA是遺傳信息的載體，所以生命的遺傳實際上就是染色體DNA的自我復制。而染色體DNA的自我復制主要是通過半保留復制來實現的，是一個以親代DNA分子為模板合成子代DNA鏈的過

2、程。 一、一、DNA復制的一般特征復制的一般特征1 DNA的復制是半保留復制的復制是半保留復制第4章 DNA的復制突變損傷和修復Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結構模型時就對DNA的復制過程進行了探討。 全保留復制？全保留復制？半保留復制？半保留復制？分散復制分散復制 ?第4章 DNA的復制突變損傷和修復Which one is correct ?分散復制分散復制 ?全保留復制？全保留復制？半保留復制？半保留復制？第4章 DNA的復制突變損傷和修復Watson和Crick推測，DNA在復制過程中堿基間的氫鍵首先斷裂，雙螺旋解旋并被分開，每條鏈分別作為模板合成新鏈，產生互補的兩條鏈。這

3、樣新形成的兩個DNA分子與原來DNA分子的堿基順序完全一樣。因此，每個子代分子的一條鏈來自親代DNA，另一條鏈則是新合成的，所以這種復制方式被稱為DNA的半保留復制(semiconservative replication)。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA的半保留復制(semiconservative replication)第4章 DNA的復制突變損傷和修復1958年，Meselson 和 Stahl研究了經15N標記3個世代的大腸桿菌DNA，首次證明了DNA的半保留復制。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復大腸桿菌長期在以15N作氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到15N-DNA。用 含1

4、4N的氮源培養(yǎng)15N標記的大腸桿菌，一代后所有DNA的密度都在14N-DNA和15N-DNA之間。第4章 DNA的復制突變損傷和修復兩代后出現等量的14N分子和15N-14N雜合分子。 若再繼續(xù)培養(yǎng)，可以看到14N-DNA分子增多，說明DNA分子在復制時均可被分成兩個亞單位，分別構成子代分子的一半，這些亞單位經過許多代復制仍然保持著完整性。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復現已發(fā)現，原核生物和真核生物的DNA都是以半保留復制方式半保留復制方式遺傳的。半保留復制保證了DNA在代謝上的穩(wěn)定性代謝上的穩(wěn)定性，經過許多代的復制，DNA多核苷酸鏈仍可完整地存在于后代而不被分解，這種穩(wěn)定性與DNA的遺傳

5、功能相符。第4章 DNA的復制突變損傷和修復2 復制的起點復制的起點復制時，雙鏈DNA要解開成兩股鏈分別進行。這個復制起點呈現叉子的形式，被稱為復制叉復制叉(replication fork)。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復實驗表明，DNA的復制有一個固定的起點。DNA復制時每次復制的DNA片段稱為一個復制單位復制單位，又叫復制子復制子(replicon)。一個復制子只含一個復制起點，但不一定有復制終點。第4章 DNA的復制突變損傷和修復通常，細菌、病毒和線粒體的DNA分子只含有一個復制子，真核生物基因組可以同時在多個復制起點上進行雙向復制，即基因組包含有多個復制子。 第4章 DNA的復

6、制突變損傷和修復第4章 DNA的復制突變損傷和修復許多生物復制起點的DNA序列已經被鑒定并測定，他們比較保守，含有較多的反向反向重復序列重復序列和短的成簇的保守序列短的成簇的保守序列,可以和蛋白質結合。大腸桿菌的復制起點處的重復保守序列大腸桿菌的復制起點處的重復保守序列第4章 DNA的復制突變損傷和修復實驗表明，無論是原核生物還是真核生物，DNA的復制主要是從固定的起始點以雙向等速復制方式雙向等速復制方式進行的。復制叉以DNA分子上某一特定序列為起點，向兩個方向等速生長前進。3 復制的方向復制的方向第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA的雙的雙向復制向復制第4章 DNA的復制突變損傷和修復其

7、他不同的形式復制其他不同的形式復制等速復制，等速復制，不等速復制不等速復制單向復制，單向復制，雙向復制雙向復制多起點復制，多起點復制，單起點復制單起點復制直線雙向單起點直線雙向單起點直線雙向多起點直線雙向多起點眼型復制眼型復制滾動環(huán)復制滾動環(huán)復制D- 環(huán)環(huán) 復制復制2D-環(huán)復制環(huán)復制 第4章 DNA的復制突變損傷和修復單一起點的單向復制單一起點的單向復制(如腺病毒)單一起點的雙向復制單一起點的雙向復制(如T7噬菌體) 多個起始點的雙向復制多個起始點的雙向復制（如染色體）多個起始點的單向復制多個起始點的單向復制線性線性DNA雙鏈的復制雙鏈的復制第4章 DNA的復制突變損傷和修復雙向復制雙向復制第

8、4章 DNA的復制突變損傷和修復型復型復制制 大腸桿菌基因組的復制形成兩個方向相反的復制叉。第4章 DNA的復制突變損傷和修復大腸桿菌環(huán)形DNA復制時產生的復制眼（泡）結構, 單一起點，雙向復制，第4章 DNA的復制突變損傷和修復第4章 DNA的復制突變損傷和修復滾環(huán)型復制滾環(huán)型復制單鏈環(huán)狀單鏈環(huán)狀DNA：如噬菌體X174DNA雙鏈雙鏈DNA：噬菌體復制的后期、非洲爪蟾(Xenopus)卵母細胞中rRNA基因的擴增等。是一種單向復制的特殊形式。某些單鏈環(huán)狀DNA和雙鏈DNA均可以采用這種方式復制。第4章 DNA的復制突變損傷和修復噬菌體X174DNA的復制過程：（1）首先形成共價閉環(huán)的雙鏈分子

9、(復制型)；（2）正鏈由A蛋白在特定位置切開，游離出一個3OH末端，A蛋白連在5-磷酸基末端；（3）在DNA聚合酶催化下，以環(huán)狀負鏈為模板，從正鏈的3-OH末端加入脫氧核苷酸，使鏈不斷延長，通過滾動而合成出新的正鏈。（4）合成一圈后，露出切口序列，A蛋白再次將其切開，并連在切出的5-磷酸基末端，游離出單位長度噬菌體環(huán)狀單鏈DNA分子。第4章 DNA的復制突變損傷和修復滾環(huán)型復制滾環(huán)型復制第4章 DNA的復制突變損傷和修復第4章 DNA的復制突變損傷和修復第4章 DNA的復制突變損傷和修復第4章 DNA的復制突變損傷和修復D-環(huán)型復制環(huán)型復制這也是一種單向復制的特殊方式。這種方式首先在動物線粒體

10、DNA的復制中被發(fā)現(纖毛蟲的線粒體DNA為線性分子，其復制方式與此不同)。雙鏈環(huán)在固定點解開進行復制。但兩條鏈的合成是高度不對稱的，一條鏈上迅速合成出互補鏈，另一條鏈則成為游離的單鏈環(huán)(即D-環(huán))。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復D-環(huán)型復制環(huán)型復制第4章 DNA的復制突變損傷和修復原來，一條鏈復制到一定程度后，另一鏈的復制起點才暴露出來，另一條鏈才能開始復制。這說明DNA兩條鏈的起點并不總在同一點上，當兩條鏈的起點分開一定距離時就產生D-環(huán)復制。第4章 DNA的復制突變損傷和修復葉綠體DNA的復制也采取D-環(huán)的方式，雙鏈環(huán)兩條鏈的起點不在同一位置，但同時在起點處解開雙鏈，進行D-環(huán)復制

11、，故稱為2D-環(huán)復制環(huán)復制。第4章 DNA的復制突變損傷和修復枯草桿菌(Bacillus subtilis)染色體DNA的復制雖是雙向的，但是兩個復制叉移動的距離不同。一個復制叉僅在染色體上移動五分之一距離，然后停下采等待另一復制叉完成五分之四距離。雙向不對稱復制雙向不對稱復制第4章 DNA的復制突變損傷和修復質粒R6K兩個復制叉的移動也是不對稱的，第1個復制叉到達1/5距離即停下，從反方向開始形成第2個復制叉并完成其余部分的復制。質粒ColEI的復制完全是單向的，復制叉只向一個方向移動。第4章 DNA的復制突變損傷和修復4 復制的速度復制的速度利用放射自顯影的方法測定，細菌DNA的復制叉移動

12、速度大約每分鐘50000bp。大腸桿菌染色體完成復制需要40min。但是在豐富培養(yǎng)基中，大腸桿菌每20min即可分裂一次。第4章 DNA的復制突變損傷和修復復制叉前進的速度是比較恒定的，復制速度實際取決于起始頻率。在豐富培養(yǎng)基中，大腸桿菌染色體一輪復制尚未完成，起點已開始第二輪的復制，因此一個染色體可以不只2個生長點。第4章 DNA的復制突變損傷和修復真核生物染色體DNA的復制叉移動速度比原核生物慢得多，這是由于染色體具有復雜的高級結構，復制時需解開核小體，復制后又需重新形成核小體。它們的復制叉移動速度大約為1 000-3000bpmin。第4章 DNA的復制突變損傷和修復高等真核生物一般復制

13、單位長度是100-200kb，低等真核生物要小一些，每一復制單位在30-60min內復制完畢。由于各復制子發(fā)動復制的時間有先后，一個細胞通常完成染色體復制的時間要用6-8 h。第4章 DNA的復制突變損傷和修復5 復制的終點復制的終點環(huán)狀環(huán)狀DNA復制的終點復制的終點例如大腸桿菌，具有特殊的終止序列和終止蛋白的協助而終止復制；噬菌體則只是通過復制叉的相遇碰撞而終止復制。第4章 DNA的復制突變損傷和修復線形線形DNA的末端復制問題的末端復制問題高等生物的染色體是利用端粒酶來解決末端復制問題；T7噬菌體則是利用形成串聯體的方式解決。第4章 DNA的復制突變損傷和修復6 復制所需的主要酶和蛋白復制

14、所需的主要酶和蛋白DNA 聚合酶聚合酶 DNA 連接酶連接酶拓撲異構酶拓撲異構酶 解旋酶解旋酶引物合成酶引物合成酶 SSB蛋白蛋白第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA 聚合酶聚合酶1956 年最早從大腸桿菌中發(fā)現。目前發(fā)現，大腸桿菌中至少有5種DNA聚合酶，真核細胞中更多。第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA聚合酶催化的反應聚合酶催化的反應第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA聚合酶聚合酶催化的反應催化的反應*第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA聚合酶的基本特點：聚合酶的基本特點：要有DNA為模板才能合成新的DNA；需要Mg2+為輔助離子.以dNTP 為原料合成與模板DNA序列完

15、全一致的DNA, 焦磷酸PPi 釋放出來.合成新的DNA鏈的方向是從5 到3,模板鏈要求是從3到5。不能從頭合成DNA，dNTP 只能加到已有核苷酸的3-OH上。第4章 DNA的復制突變損傷和修復大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶III是一個復合物是一個復合物第4章 DNA的復制突變損傷和修復引物合成酶引物合成酶由于DNA聚合酶合成DNA時必須有引物存在，引物合成酶就負責合成引物。在體內引物合成酶合成的引物是一段RNA。原核和真核細胞內的引物合成酶是由不同的蛋白質擔任的。第4章 DNA的復制突變損傷和修復第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA 連接酶連接酶第4章 DNA的復制突變損傷和修復拓撲異構酶

16、拓撲異構酶在DNA復制過程中負責DNA構象的變化，與解鏈酶共同作用，在復制起點處解開雙鏈。拓撲異構酶II：A2B2，向DNA中引入負超螺旋，主要與復制有關，又叫旋轉酶。第4章 DNA的復制突變損傷和修復2種不同的拓撲異構酶種不同的拓撲異構酶第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA解鏈酶解鏈酶 (DNA helicase) 解鏈酶（helicase）：利用ATP，水解雙鏈堿基之間的氫鍵，打開雙鏈，每解開一對堿基需要2 ATP。第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA解鏈酶解鏈酶 (DNA helicase) DNA的解鏈過程，首先在拓撲異構酶I的作用下解開負超螺旋，并與解鏈酶共同作用，在復制起點

17、處解開雙鏈。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復單鏈結合蛋白單鏈結合蛋白(SSB蛋白蛋白) SSB蛋白的作用是保證被解鏈酶解開的單鏈在復制完成前能保持單鏈結構，它以四聚體形式存在于復制叉處，待單鏈復制后才掉下，重新循環(huán)。所以SSB蛋白只起保持單鏈的作用。第4章 DNA的復制突變損傷和修復第4章 DNA的復制突變損傷和修復7 半不連續(xù)復制半不連續(xù)復制由于DNA雙螺旋的兩條鏈是反向平行的，因此在復制叉附近解開的DNA鏈一條是53方向，另一條是3-5方向，兩個模板極性不同。所有已知DNA聚合酶的合成方向都是5-3而不是3-5，那么如何解釋DNA的兩條鏈能夠同時進行復制的呢？第4章 DNA的復制突變損

18、傷和修復日本學者岡崎日本學者岡崎(Okazaki)等提出了等提出了DNA的半不連的半不連續(xù)復制續(xù)復制(semidiscontinuous replication)模型。模型。 他用3H-脫氧胸苷短時間標記大腸桿菌，提取DNA，變性后用超離心方法得到了許多3H標記的、被后人稱為岡崎片段的小片斷DNA。延長標記時間后，岡崎片段可轉變?yōu)槌墒霥NA鏈，因此這些片段必然是復制過程的中間產物。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復用DNA連接酶溫度敏感突變株進行實驗，在連接酶不起作用的溫度下，便有大量小DNA片段累積，說明DNA復制過程中至少有一條鏈首先合成較短的片段，然后再由連接酶連成大分子DNA。 第4

19、章 DNA的復制突變損傷和修復進一步的試驗證明，不連續(xù)的DNA合成只發(fā)生在一條鏈上（滯后鏈，lagging strand）。另一條鏈的復制是連續(xù)的（前導鏈,leading strand）。進一步研究還證明，這種前導鏈的連續(xù)復制和滯后鏈的不連續(xù)復制在生物界是有普遍性的，因而稱之為DNA的半不連的半不連續(xù)復制。續(xù)復制。第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA的半不連續(xù)復制的半不連續(xù)復制第4章 DNA的復制突變損傷和修復一般來說，大腸桿菌中的岡崎片段長度為10002000bp，相當于一個基因的大??；真核生物的岡崎片段大小為100200bp，相當于一個核小體DNA的大小。事實上，前導鏈的復制也不是完全

20、連續(xù)的，許多因素如模板鏈的損傷，復制因子和底物的供應不足等，都會導致前導鏈復制中斷并重新從另一點開始DNA的復制。第4章 DNA的復制突變損傷和修復(1) 大腸桿菌的大腸桿菌的DNA聚合酶聚合酶二、原核生物二、原核生物DNA的復制的復制1956 年最早由Arthur Kornberg 在E. coli 中發(fā)現。第4章 DNA的復制突變損傷和修復大腸桿菌中至少有大腸桿菌中至少有5種不同的種不同的DNA聚合酶聚合酶第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA聚合酶I由1條多肽鏈組成，主要負責引物的去除和空隙的填補，在DNA的損傷修復中也起到重要的作用。每個細胞的分子數為400左右。DNA聚合酶II由7

21、個亞基組成，也與DNA的損傷修復有關，每個細胞的分子數為100左右。DNA聚合酶IV和V也與DNA的修復有關第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA聚合酶III是DNA復制過程中的主要酶，負責催化鏈的延長。第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA聚合酶III是DNA復制酶的主要原因：(1) 催化效率高，細胞內存在的分子數少；(2) 大腸桿菌的這個酶突變會導致細胞死亡，而聚合酶I和II突變細胞不會死亡；(3) 持續(xù)合成DNA的能力強。(4) 其他結構上的特點。第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA聚合酶是以二聚體的形式發(fā)揮作用的第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA聚合酶的亞基很容易解離，在

22、分離酶的過程中常常得到不同的組分，對每一組分的作用不十分的了解。所以要區(qū)分酶的組成和輔助因子不太容易。 現認為DNA聚合酶的全酶(holoenzyme)由 等10種亞基所組成，含有鋅原子。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復亞基的相對分子質量為132000，具有5到3方向合成DNA的催化活性。 亞基具有3到5核酸外切酶活性，起校對作用，可提高聚合酶復制DNA的保真性。 三種亞基組成全酶的核心酶(core enzyme)。亞基可能起組建的作用。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA聚合酶為異二聚體，它使DNA解開的雙鏈可以同時進行復制.但二聚化的兩個聚合酶亞基種類并不完全相同，在這里亞基起著

23、促使核心酶二聚化的作用。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復亞基的功能猶如夾子、兩個亞基夾住DNA分子并可向前滑動使聚合酶在完成復制前不再脫離DNA，從而提高了酶的持續(xù)合成能力。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復亞基是一種依賴DNA的ATP酶，兩個亞基與另4個亞基(2 )構成復合物.主要功能是幫助亞基夾住DNA，故稱夾子裝置器。第4章 DNA的復制突變損傷和修復各亞基的功能相互協調,DNA聚合酶的復雜亞基結構使其具有更高的忠實性(fidelity)、協同性(cooperativity)和持續(xù)性(processivity)。如無校對功能，DNA聚合酶的核苷酸摻人錯誤率為7X106，具有核對功能

24、后降低至5X 109。第4章 DNA的復制突變損傷和修復組成組成DNA聚合酶聚合酶III的各亞基特點和功能的各亞基特點和功能第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA聚合酶聚合酶III的組裝的組裝1第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA聚合酶聚合酶III的組裝的組裝2第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA聚合酶聚合酶III的組裝的組裝3第4章 DNA的復制突變損傷和修復第4章 DNA的復制突變損傷和修復第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA聚合酶引起的缺刻轉移聚合酶引起的缺刻轉移1第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA聚合酶引起的缺刻轉移聚合酶引起的缺刻轉移2第4章 DNA的復制突變損傷

25、和修復DNA聚合酶的校對功能聚合酶的校對功能1第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA聚合酶的校對功能聚合酶的校對功能2第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA聚合酶的校對功能聚合酶的校對功能3 *第4章 DNA的復制突變損傷和修復(2) 大腸桿菌的復制起始大腸桿菌的復制起始大腸桿菌的復制起點叫做oriC,長度為245bp，其序列特征和控制元件在大腸桿菌中十分保守。關鍵在于2組短的重復序列：3個13bp和4個9 bp的序列。第4章 DNA的復制突變損傷和修復4個9bp的重復序列是與DnaA蛋白結合的地方，大約2040個DnaA蛋白結合在此，聚集在一起，DNA纏繞其上，形成起始復合物。HU蛋白是

26、細胞內的類組蛋白，與DNA結合，使DNA鏈彎曲。導致附近的3個富含AT的13bp序列變性，稱為開鏈復開鏈復合物。合物。第4章 DNA的復制突變損傷和修復解旋酶DnaB六聚體在DnaC協助下，結合在解鏈區(qū)， DnaB借助ATP能量，沿著鏈的5向3方向移動，解開DNA的雙鏈，形成前引發(fā)復合物前引發(fā)復合物(prepriming complex)此外，還需要DNA旋轉酶（拓撲異構酶II）和單鏈結合蛋白SSB。第4章 DNA的復制突變損傷和修復大腸桿菌復大腸桿菌復制起始模型制起始模型4個個9bp的重復序的重復序列是與列是與DnaA蛋白蛋白結合的地方結合的地方第4章 DNA的復制突變損傷和修復導致附近的導

27、致附近的3個富含個富含AT的的13bp序列變性，序列變性，稱為開鏈復合物稱為開鏈復合物HU蛋白是細胞內的蛋白是細胞內的類組蛋白，與類組蛋白，與DNA結結合，使合，使DNA鏈彎曲。鏈彎曲。解旋酶解旋酶DnaB六聚體在六聚體在DnaC協助下，結合在解鏈區(qū)協助下，結合在解鏈區(qū)第4章 DNA的復制突變損傷和修復大腸桿菌復制起始需要的蛋白質大腸桿菌復制起始需要的蛋白質DnaA, DnaB,DnaC,HU,Primase,SSB,RNA polymerase, DNA拓撲異構酶拓撲異構酶II，Dam甲基化酶甲基化酶第4章 DNA的復制突變損傷和修復大腸桿菌上與復制有關的位點大腸桿菌上與復制有關的位點第4章

28、 DNA的復制突變損傷和修復大腸桿菌復制叉上的蛋白質大腸桿菌復制叉上的蛋白質*第4章 DNA的復制突變損傷和修復(3) 大腸桿菌的復制過程大腸桿菌的復制過程當引物合成酶在適當位置合成出RNA引物后，兩個亞基(夾子)即在復合物幫助下將引物與模板的雙鏈夾住。亞基的二聚體形成一個環(huán)，套在雙鏈分子上，并可在其上滑動。 將夾子安裝在引物與模板雙鏈上需要能量，亞基具有ATP酶活性，可分解ATP以提供能量。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復夾子的功能在于將DNA聚合酶III的核心酶束縛在DNA模板上，使其持續(xù)合成DNA。它與復合物的亞基以及核心酶的亞基都有高的親和力，二者的結合位點也相同。第4章 DNA的

29、復制突變損傷和修復但隨著夾子狀態(tài)的改變，親和力大小也發(fā)生改變。當夾子在溶液中時，它趨向于和復合物結合；及至在復合物幫助下夾住引物與模板雙鏈，它發(fā)生構象變化從而使其轉移到核心酶上；一旦岡崎片段合成結束，它又轉移回復合物，并在其幫助下脫落。如此使夾子得以反復循環(huán)使用（夾子循環(huán)）。（夾子循環(huán)）。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復DnaB有兩個功能，一是解螺旋酶，以解開DNA的雙螺旋；另一是活化引物合成酶，促使其合成RNA引物。由DnaB解螺旋酶和DnaG引物合成酶構成了復制體的一個基本功能單位，稱為引發(fā)體(primosome)。 在某些噬菌體DNA的復制過程中，引發(fā)體還包括一些輔助蛋白質，例如X1

30、74，它含有6個前引發(fā)蛋白 。第4章 DNA的復制突變損傷和修復引發(fā)體能依賴ATP沿復制叉運動方向在DNA鏈上移動，并合成岡崎片段的RNA引物。引物的合成方向與復制叉前進的方向正好相反。 DNA聚合酶III在模板鏈上合成岡崎片段，遇到上一個岡崎片時即停止合成，亞基離開DNA鏈?？赡苷谴送ｎD成為合成RNA引物的信號，由引物合成酶沿反方向合成引物，并被夾子帶到核心酶上，開始又一個岡崎片段的合成。第4章 DNA的復制突變損傷和修復復制的引發(fā)復制的引發(fā)1第4章 DNA的復制突變損傷和修復復制的引發(fā)復制的引發(fā)2第4章 DNA的復制突變損傷和修復復制的引發(fā)復制的引發(fā)3第4章 DNA的復制突變損傷和修復復

31、制的引發(fā)復制的引發(fā)4第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA復制過程中一個重要的問題就是兩條鏈的協調問題：如何使用同一個酶來合成2條走向相反的DNA鏈？ANIMATION兩條鏈兩條鏈的協調的協調*第4章 DNA的復制突變損傷和修復復制過程復制過程1第4章 DNA的復制突變損傷和修復復制過程復制過程2第4章 DNA的復制突變損傷和修復復制過程復制過程3第4章 DNA的復制突變損傷和修復復制過程復制過程4第4章 DNA的復制突變損傷和修復復制過程復制過程5第4章 DNA的復制突變損傷和修復滯后鏈的復制滯后鏈的復制第4章 DNA的復制突變損傷和修復滯后鏈的復制滯后鏈的復制第4章 DNA的復制突變損傷

32、和修復滯后鏈最后一步，DNA聚合酶I將RNA引物除去，空隙填補。第4章 DNA的復制突變損傷和修復細菌環(huán)狀染色體的兩個復制叉向前推移，最后在終止區(qū)(terminus region)相遇并停止復制，該區(qū)含有多個約22bp的終止子(terminator)位點。大腸桿菌有6個終止子位點，分別稱為terA-terF。 與ter位點結合的蛋白質稱為Tus(terminus utilization substance)。 (4) 大腸桿菌的復制的終止大腸桿菌的復制的終止第4章 DNA的復制突變損傷和修復第4章 DNA的復制突變損傷和修復復制終止蛋白復制終止蛋白tus第4章 DNA的復制突變損傷和修復Tus

33、-ter復合物只能夠阻止一個方向的復制叉前移，即不讓對側復制叉超過中點后過量復制。 在正常情況下，兩個復制叉前移的速度是相等的，到達終止區(qū)后就都停止復制。然而如果其中一個復制叉前移受阻，另一個復制叉復制過半后，就受到對側tus-ter復合物的阻擋，以便等待前一復制叉的會合。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復大腸桿菌上有若干與復制終止有關的序列大腸桿菌上有若干與復制終止有關的序列第4章 DNA的復制突變損傷和修復兩個復制叉在終止區(qū)相遇而停止復制，復制體解體，其間大約仍有50-100 bp未被復制。其后兩條親代鏈解開，通過修復方式填補空缺。 此時兩環(huán)狀染色體互相纏繞，成為連鎖體(catenane

34、)。此連鎖體在細胞分裂前必須解開，否則將導致細胞分裂失敗，細胞可能因此死亡。大腸桿菌分開連鎖環(huán)需要拓撲異構酶(屬于類型拓撲異構酶)參與作用。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復拓撲異構酶II在復制后將大腸桿菌的2個子代細胞分開第4章 DNA的復制突變損傷和修復該酶兩個亞基分別由基因parC和parE編碼。每次作用可以使DNA兩鏈斷開和再連接，因而使兩個連鎖的閉環(huán)雙鏈DNA彼此解開。其他環(huán)狀染色體，包括某些真核生物病毒，其復制的終止相可能以類似的方式進行。第4章 DNA的復制突變損傷和修復大腸桿菌復制大腸桿菌復制的終止的終止第4章 DNA的復制突變損傷和修復第4章 DNA的復制突變損傷和修復DN

35、A的復制1 2 3 DNA的雙向復制*大腸桿菌DNA的復制*第4章 DNA的復制突變損傷和修復4.1.3 真核生物真核生物DNA的復制的復制(1) 真核細胞的真核細胞的DNA聚合酶聚合酶目前至少在真核細胞中發(fā)現9種DNA聚合酶，分別在DNA復制（染色體或線粒體復制）和DNA修復中起作用。第4章 DNA的復制突變損傷和修復第4章 DNA的復制突變損傷和修復第4章 DNA的復制突變損傷和修復3種核種核DNA聚合酶的功能不同（聚合酶的功能不同（From GeneVIII）：）： DNA聚合酶聚合酶起始新鏈的合成（引物合成酶）起始新鏈的合成（引物合成酶） DNA聚合酶聚合酶合成前導鏈。合成前導鏈。 D

36、NA聚合酶聚合酶可能合成滯后鏈及其他功能可能合成滯后鏈及其他功能第4章 DNA的復制突變損傷和修復真核細胞幾種真核細胞幾種DNA聚合酶性質比聚合酶性質比較較第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA聚合酶為多亞基酶，無校正功能，它的功能只是合成引物，但它在合成一小段RNA鏈后還可聚合45個寡聚脫氧核糖核苷酸。 DNA聚合酶既有持續(xù)合成DNA鏈的能力，又有校正功能，由它完成DNA復制。推測在復制叉上有一個DNA聚合酶，以合成引物；兩個DNA聚合酶，分別合成前導鏈和滯后鏈。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA聚合酶與一種稱為增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear

37、antigen，PCNA)的復制因子相結合，該因子相對分子質量為29 000。PCNA相當于大腸桿菌DNA聚合酶的亞基，它能形成環(huán)狀夾子，極大增加聚合酶的持續(xù)合成能力。第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA聚合酶可能負責合成滯后鏈。同時是一種修復酶，參與DNA的修補合成，RNA引物被RNaseH和MF-1核酸酶水解，然后由DNA聚合酶填補缺口，DNA連接酶I將岡崎片段相連接。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復DNA聚合酶是修復酶。DNA聚合酶是線粒體的DNA合成酶。第4章 DNA的復制突變損傷和修復在真核生物的DNA復制中，另有兩個蛋白質復合物參與作用。RP-A是真核生物的單鏈DNA結合蛋

38、白，相當于大腸桿菌的SSB蛋白。RF-C是夾子裝置器，相當于大腸桿菌的復合物，幫助PCNA因子安裝到雙鏈上以及拆下來，它還促進復制體的裝配。第4章 DNA的復制突變損傷和修復原核核真核復制體的比較原核核真核復制體的比較第4章 DNA的復制突變損傷和修復 (1) 真核生物的DNA合成酶有的沒有3到 5的外切酶活性，錯配堿基的矯正由其他蛋白完成(2)真核生物中 DNA聚合酶相當與原核生物中的DNA聚合酶III。(3)真核生物中 DNA聚合酶具有RNA 引物合成的功能。(4)真核生物中 DNA復制由聚合酶/ /共同完成。 與原核生物的與原核生物的DNA聚合酶相比：聚合酶相比：第4章 DNA的復制突變

39、損傷和修復 真核生物染色體有多個復制起點。酵母的復制起點已被克隆。它們稱為自主復制序列(autonomously replicating sequence，ARS)，或復制基因(replicator)。酵母的ARS元件大約為150bp，含有幾個基本的保守序列。(2) 真核細胞真核細胞DNA復制的特點復制的特點真核生物染色體有多個復制起點真核生物染色體有多個復制起點第4章 DNA的復制突變損傷和修復單倍體酵母有17個染色體，基因組約有400個復制基因。有一由6個蛋白質組成的復合物，相對分子質量約為400 000，可結合其上，稱為起點識別復合物(origin recognition complex

40、，ORC), 它的結合要求ATP。一些蛋白質與ORC作用，并調節(jié)其功能，從而影響著細胞周期。第4章 DNA的復制突變損傷和修復酵母的復制酵母的復制起點結構起點結構第4章 DNA的復制突變損傷和修復真核細胞復制是多復制子復制真核細胞復制是多復制子復制真核細胞染色體的復制是多起點的雙向復制第4章 DNA的復制突變損傷和修復哺乳動物的復制子大多在100-200 kb之間。人的細胞有23對染色體，單倍體基因組大約有3x109bp，平均每個染色體有1 000個復制子。果蠅或酵母的復制子比較小，平均為40kb。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復基因組比原核生物大，然而真核生物染色體DNA上有許多復制起點

41、，它們可以分段進行復制。例如，細菌DNA復制叉的移動速度為50000bpmin，哺乳類動物復制又移動速度實際僅1 000-3 000bpmin，相差約2050倍，然而哺乳類動物的復制子只有細菌的幾十分之一，所以從每個復制單位而言，復制所需時間在同一數量級。 真核生物真核生物DNA的復制速度比原核生物慢的復制速度比原核生物慢第4章 DNA的復制突變損傷和修復真核生物與原核生物染色體DNA復制還有一個明顯的區(qū)別是：真核生物染真核生物染色體在全部復制完成之前起點不再從色體在全部復制完成之前起點不再從新開始復制；而在快速生長的原核生新開始復制；而在快速生長的原核生物中，起點可以連續(xù)發(fā)動復制。物中，起點

42、可以連續(xù)發(fā)動復制。真核生物在快速生長時，往往采用更多的復制起點。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復黑腹果蠅的早期胚胎細胞中相鄰兩復制起點的平均距離為7.9 kb，培養(yǎng)的成體細胞中復制起點的平均距離為40kb，說明成體細胞只利用一部分復制起點。幼年細胞生長較快，DNA復制也必須較快，在復制速度不變的情況下利用更多復制起點便可以加速復制的進行。第4章 DNA的復制突變損傷和修復真核生物復制真核生物復制叉上的組成叉上的組成第4章 DNA的復制突變損傷和修復原核生物的染色體是環(huán)狀的，其5最末端岡崎片段的RNA引物被除去后可借助另半圈DNA鏈向前延伸來填補。但是真核生物線性染色體在復制后，不能像原核生

43、物那樣填補5末端的空缺，從而會使5末端序列因此而縮短。真核生物通過形成端粒結構來解決這個問題。 (3) 真核細胞線形染色體的末端復制問題真核細胞線形染色體的末端復制問題第4章 DNA的復制突變損傷和修復真核生物線性染色體的兩個末端具有特殊的結構，稱為端粒(telomere)，它是由許多成串短的重復序列所組成。該重復序列通常一條鏈上富含G(G-rich)，而其互補鏈上富含C(C-rich)。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復例如，原生動物四膜蟲端粒的重復單位為TTGGGG(僅列一條鏈的序列)；人的端粒為TTAGGG。TG鏈常比AC鏈更長些，形成3單鏈末端。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復線

44、性線性DNA染色體的末段復制問題染色體的末段復制問題第4章 DNA的復制突變損傷和修復端粒的功能為穩(wěn)定染色體末端結構，防止染色體間末端連接，并可補償滯后鏈5末端在消除RNA引物后造成的空缺。 復制使端粒5末端縮短，而端粒酶(telomerase)可外加重復單位到5末端上，結果維持端粒一定長度。第4章 DNA的復制突變損傷和修復端粒酶端粒酶是一種含有RNA鏈的逆轉錄酶，它以所含RNA為模板來合成DNA端粒結構。通常端粒酶含有約150個堿基的RNA鏈，其中含1個半拷貝的端粒重復單位的模板。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復如四膜蟲端粒酶的RNA為159個堿基的分子，含有CAACCCCAA序列。端

45、粒酶可結合到端粒的3末端上，RNA模板的5末端識別DNA的3末端堿基并相互配對，以RNA鏈為模板使DNA鏈延伸，合成一個重復單位后酶再向前移動一個單位。端粒的3單鏈末端又可回折作為引物，合成其互補鏈。第4章 DNA的復制突變損傷和修復第4章 DNA的復制突變損傷和修復在動物的生殖細胞中，由于端粒酶的存在，端粒一直保持著一定的長度。體細胞隨著分化而失去端粒酶活性，主要是因為編碼該催化亞基的基因表達受到了阻遏。在缺乏端粒酶活性時，細胞連續(xù)分裂將使端粒不斷縮短，短到一定程序即引起細胞生長停止或凋亡。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復組織培養(yǎng)的細胞證明，端粒在決定細胞的壽命中起重要作用，經過多代培養(yǎng)

46、老化的細胞端粒變短，染色體也變得不穩(wěn)定。 然而，主要的腫瘤細胞中均發(fā)現存在端粒酶活性，因此設想端粒酶可作為抗癌治療的靶位點。端粒酶端粒酶 端粒端粒 染色體的末端復制染色體的末端復制第4章 DNA的復制突變損傷和修復端粒酶活性丟失引起過早衰老（端粒酶活性丟失引起過早衰老（progeria）Progeria，又叫Hutchinson-Gilford 綜合癥，嚴重的從出生起就開始衰老出現皺紋，禿頂等。一般10多歲死亡。比較輕一些的，叫Werner 綜合癥，從10多歲開始衰老，一般在40歲之前死亡。這些個體細胞中的端粒都較短，細胞的分裂能力下降。第4章 DNA的復制突變損傷和修復ProgeriaDo

47、you know how old they are ？Hutchinson-Gilford syndrome第4章 DNA的復制突變損傷和修復(4) 真核細胞核小體的復制問題真核細胞核小體的復制問題第4章 DNA的復制突變損傷和修復第4章 DNA的復制突變損傷和修復但是有的實驗表明，組蛋白是以“全保留”的方式復制的，即老的組蛋白保留在前導鏈中，滯后鏈中的組蛋白是新合成的。真核細胞染色體的復制真核細胞染色體的復制*第4章 DNA的復制突變損傷和修復4.1.4 DNA復制調控復制調控原核細胞的生長和增殖速度取決于培養(yǎng)條件，但在生長、增殖速度不同的細胞中DNA鏈延伸的速度幾乎是恒定的，只是復制叉的數

48、量不同。迅速分裂的細胞具較多復制叉，而分裂緩慢的細胞復制叉較少并出現復制的間隙。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復細胞內復制叉的多少決定了復制起始頻率的高低，這可能是原核細胞復制的調控機制。復制起始頻率的直接調控因子是蛋白質和RNA。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復(1) 大腸桿菌的大腸桿菌的DNA復制的調控復制的調控DNA復制的調節(jié)發(fā)生在起始階段，一旦開始復制，如無意外受組，就能一直進行到完成。 現在知道，DNA復制的發(fā)動與DNA甲基化以及與細菌質膜的相互作用有關。在245bp的oriC位點中總共有11個4bp回文序列GATC， 第4章 DNA的復制突變損傷和修復Dam甲基化酶可使該序

49、列中腺嘌呤第6位N上甲基化。當DNA完成復制后，oriC的親代鏈保持甲基化，新合成的鏈則未甲基化，因此是半甲基化的DNA。 半甲基化的起點不能發(fā)生復制的起始，直到Dam甲基化酶使起點全甲基化。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復但起點處GATC位點在復制后一直保持半甲基化狀態(tài)，約經過13min才再甲基化。而基因組其余部位的GATC在復制后通常很快(小于1.5min)就能再甲基化。只有與oriC靠近的dnaA基因啟動子的再甲基化需要同樣的延遲期。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復當dnaA啟動子處于半甲基化時，轉錄被阻遏從而降低了Dna A蛋白的水平。此時起點本身是無活性的，并且關鍵性起始蛋白

50、DnaA的產生也受到阻遏。第4章 DNA的復制突變損傷和修復第4章 DNA的復制突變損傷和修復只有甲基化的復制起點才有活性只有甲基化的復制起點才有活性第4章 DNA的復制突變損傷和修復為什么為什么oriC和和dna A位點再甲基化會延遲位點再甲基化會延遲? 實驗表明，半甲基化的oriC DNA (dnaA基因位于起點附近)可與細胞膜結合，但全甲基化就不能結合。推測有可能因oriC與膜結合而阻礙了Dam甲基化酶對其GATC位點的甲基化，也抑制了Dna A蛋白與起點的結合。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復這種結合使得正在復制中的DNA可隨著細胞膜的生長而被移向細胞的兩半部分。只在此過程完成后，

51、DNA的起點才從膜上脫落下來，并被甲基化，于是又開始新一輪的復制起始。在延遲期內細胞得以完成有關的功能。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復復制起始的調節(jié)還涉及Dna A蛋白活性的循環(huán)變化；它與ATP結合為活性形式，隨之結合到起點上，ATP被緩慢水解；它與ADP結為無活性的形式。膜磷脂可以促進Dna A的ADP被ATP置換。調節(jié)的許多細節(jié)還不清楚，但上述實驗結果為了解調節(jié)機制提供了線索。第4章 DNA的復制突變損傷和修復ColEl質粒質粒DNA的復制調控的復制調控 ColE1是一個6646bp的小質粒，在宿主細胞內拷貝數為20-30。ColE1DNA復制不依賴于其本身編碼的蛋白質，而完全依靠宿

52、主DNA聚合酶。質粒DNA編碼兩個負調控因子Rop蛋白和反義RNA(RNAi)，它們控制了起始DNA復制所必需的引物合成。質粒ColE1的復制完全是單向的。第4章 DNA的復制突變損傷和修復引物RNA前體的轉錄起始于復制起點上游555個核苷酸處，需經RNaseH加工后產生有555個核苷酸的引物，然后由DNA聚合酶I在引物的3末端起始DNA合成。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復RNAi的編碼區(qū)在引物RNA編碼區(qū)的5末端，轉錄方向與引物RNA相反，因此與引物RNA的5末端互補。RNAi通過氫鍵配對與引物RNA前體相互作用，阻止了RNaseH加工引物前體，使其不能轉化為有活性的引物而對復制起負調

53、控作用。第4章 DNA的復制突變損傷和修復RNAi不僅控制質粒的拷貝數而且也決定了質粒的不相容性。RNAi與引物RNA分子的相互作用是可逆的，因此細胞內RNAi的濃度決定了ColE1質粒的復制起始頻率。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復另一個負調控因子Rop蛋白能提高RNAi與引物前體的相互作用，從而加強了RNAi的負調控作用。第4章 DNA的復制突變損傷和修復(2) 真核細胞真核細胞DNA復制的調控復制的調控真核細胞的生活周期可分為4個時期：G1、S、G2和M期。G1是復制預備期，S為復制期，G2為有絲分裂準備期，M為有絲分裂期。DNA復制只發(fā)生在S期。真核細胞中DNA復制有3個水平的調控

54、：第4章 DNA的復制突變損傷和修復也稱為限制點調控，即決定細胞停留在G1期還是進入S期。許多外部因素和細胞因子參與限制點調控。促細胞分裂劑、致癌劑、外科切除等都可誘發(fā)細胞由G1期進入S期。一些細胞質因子如四磷酸二腺苷和聚ADP核糖也可誘導DNA的復制。 (a)細胞生活周期水平調控 第4章 DNA的復制突變損傷和修復決定不同染色體或同一染色體不同部位的復制子按一定順序在S期起始復制，這種有序復制的機理還不清楚。 (b)染色體水平調控第4章 DNA的復制突變損傷和修復決定復制的起始與否，這種調控從單細胞生物到高等生物是高度保守的。 (c)復制子水平調控第4章 DNA的復制突變損傷和修復此外，真核

55、生物復制起始還包括轉錄活化、復制起始復合物的合成和引物合成等階段，許多參與復制起始蛋白的功能與原核生物中相類似。 第4章 DNA的復制突變損傷和修復4.1.5 線粒體線粒體DNA的復制的復制線粒體的DNA復制是D-環(huán)方式復制。第4章 DNA的復制突變損傷和修復這是一種單向復制的特殊方式。復制時雙鏈環(huán)在固定點解開進行復制。但兩條鏈的合成是高度不對稱的，一條鏈上迅速合成出互補鏈，另一條鏈則成為游離的單鏈環(huán)(即D-環(huán))。 發(fā)生這種情況的原因是由于兩條鏈的復制起點不在一起，而是隔了一段距離。第4章 DNA的復制突變損傷和修復兩條鏈的起點并不總在同一點上，當兩條鏈的起點分開一定距離時就產生D-環(huán)復制。第

56、4章 DNA的復制突變損傷和修復線粒體線粒體DNA復制過程分為四個階段復制過程分為四個階段在復制起點處以L鏈為模板，合成RNA引物，然后由DNA聚合酶催化合成一個500-600bp長的H鏈片段。該片段與L鏈以氫鍵結合，將親代的H鏈置換出來，產生D環(huán)復制中間物。Step 1 H鏈首先合成鏈首先合成第4章 DNA的復制突變損傷和修復這個新的H鏈DNA片段由于分子3端終止的位置不定而長短不一;也有一些3端位置是固定的，而由于5端被降解而使整個DNA片段長短不一。合成這樣500-600bp長的DNA片段不會引起線粒體DNA超螺旋結構的明顯改變。第4章 DNA的復制突變損傷和修復上述產生的H鏈片段由于太

57、短而很容易被擠出去恢復線粒體DNA完整的雙螺旋結構。但有時這個片段會繼續(xù)合成，這需要依靠拓撲異構酶和螺旋酶的作用將雙鏈打開。Step 2 H鏈片段的繼續(xù)合成鏈片段的繼續(xù)合成第4章 DNA的復制突變損傷和修復以被置換下來的親代H鏈為模板，離H鏈合成起點60%基因組的位置開始合成L鏈DNA，合成需要RNA引物。Step 3 L鏈合成開始鏈合成開始第4章 DNA的復制突變損傷和修復H鏈的合成提前完成，L鏈的合成隨后結束。線粒體DNA合成速度相當緩慢，約每秒10個核苷酸，整個復制過程需要1個小時。剛剛合成的線粒體DNA是松弛型的，需要40分鐘將其變成超螺旋型。Step 4 復制的完成復制的完成第4章

58、DNA的復制突變損傷和修復葉綠體葉綠體DNA的復制也采取的復制也采取D-環(huán)的方式，雙鏈環(huán)的方式，雙鏈環(huán)兩條鏈的起點不在同一位置，但同時在起點環(huán)兩條鏈的起點不在同一位置，但同時在起點處解開雙鏈進行處解開雙鏈進行D-環(huán)復制，故稱為環(huán)復制，故稱為2D-環(huán)復制環(huán)復制第4章 DNA的復制突變損傷和修復4.1.6 某些病毒的某些病毒的DNA復制方式復制方式一些病毒的DNA復制方式比較特殊。常見的類型有滾環(huán)復制滾環(huán)復制單鏈環(huán)狀單鏈環(huán)狀DNA復制復制單鏈置換單鏈置換290噬菌體和噬菌體和腺病毒腺病毒DNA等的復制等的復制串聯體復制串聯體復制T4 T7噬菌體的復制噬菌體的復制模板轉換模板轉換逆轉錄病毒的復制逆轉

59、錄病毒的復制第4章 DNA的復制突變損傷和修復滾環(huán)復制滾環(huán)復制單鏈環(huán)狀單鏈環(huán)狀DNA復制復制噬菌體X174DNA的復制過程：（1）首先形成共價閉環(huán)的雙鏈分子(復制型)；（2）正鏈由A蛋白在特定位置切開，游離出一個3OH末端，A蛋白連在5-磷酸基末端；第4章 DNA的復制突變損傷和修復（3）在DNA聚合酶催化下，以環(huán)狀負鏈為模板，從正鏈的3-OH末端加入脫氧核苷酸，使鏈不斷延長，通過滾動而合成出新的正鏈。（4）合成一圈后，露出切口序列，A蛋白再次將其切開，并連在切出的5-磷酸基末端，游離出單位長度噬菌體環(huán)狀單鏈DNA分子。第4章 DNA的復制突變損傷和修復滾環(huán)型復制示意圖滾環(huán)型復制示意圖第4章

60、DNA的復制突變損傷和修復滾環(huán)型復制示意圖滾環(huán)型復制示意圖第4章 DNA的復制突變損傷和修復第4章 DNA的復制突變損傷和修復第4章 DNA的復制突變損傷和修復滾環(huán)型復制示意圖滾環(huán)型復制示意圖第4章 DNA的復制突變損傷和修復串聯體復制串聯體復制T4 T7噬菌體的復制噬菌體的復制T7噬菌體含有雙鏈線狀噬菌體含有雙鏈線狀DNA，線性DNA復制中RNA引物被切除后，留下5端部分單鏈DNA，不能為DNA聚合酶所作用，使子鏈短于母鏈。T4和T7噬菌體DNA通過其末端的簡并性使不同鏈的3端因互補而結合，其缺口被聚合酶作用填滿，再經DNA連接酶作用生成二聯體或多聯體。再由限制性內切酶切割成單拷貝。 第4章