實(shí)驗(yàn)分析基本技能培訓(xùn)(3)

1、2022-5-12分光光度分析法分光光度分析法分光光度分析法分光光度分析法分光光度分析法分光光度分析法2022-5-12一一一一一一吸光光度法吸光光度法吸光光度法基本原理基本原理基本原理基于物質(zhì)光化學(xué)性質(zhì)而建立起來的分析方法稱之為光化學(xué)分基于物質(zhì)光化學(xué)性質(zhì)而建立起來的分析方法稱之為光化學(xué)分析法。析法。 分為分為: :光譜分析法和非光譜分析法。光譜分析法和非光譜分析法。 光譜分析法是指在光（或其它能量）的作用下，通過測光譜分析法是指在光（或其它能量）的作用下，通過測量物質(zhì)產(chǎn)生的發(fā)射光、吸收光或散射光的波長和強(qiáng)度來進(jìn)行量物質(zhì)產(chǎn)生的發(fā)射光、吸收光或散射光的波長和強(qiáng)度來進(jìn)行分析的方法。分析的方法。 2

2、022-5-12在光譜分析中，依據(jù)物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來的分在光譜分析中，依據(jù)物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法稱為吸光光度法析方法稱為吸光光度法, ,主要有主要有: : 紅外吸收光譜：紅外吸收光譜：分子振動(dòng)光譜，吸收光波長范圍分子振動(dòng)光譜，吸收光波長范圍2.5 1000 m ,主要用于有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)鑒定。主要用于有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)鑒定。 紫外吸收光譜：紫外吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍電子躍遷光譜，吸收光波長范圍200 400 nm（近紫外區(qū)）近紫外區(qū)） ，可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。，可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。 可見吸收光譜：可見吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍電子躍

3、遷光譜，吸收光波長范圍400 750 nm ，主要用于有色物質(zhì)的定量分析。主要用于有色物質(zhì)的定量分析。 2022-5-12一、紫外可見吸光光度法的特點(diǎn)一、紫外可見吸光光度法的特點(diǎn)一、紫外可見吸光光度法的特點(diǎn)一、紫外可見吸光光度法的特點(diǎn)一、紫外可見吸光光度法的特點(diǎn)一、紫外可見吸光光度法的特點(diǎn) (1)具有較高的靈敏度具有較高的靈敏度.一般物質(zhì)可測到一般物質(zhì)可測到10-10-10-6 mol.L-1.適用于微量組分的測定。適用于微量組分的測定。 (2)有一定的準(zhǔn)確度有一定的準(zhǔn)確度 該方法相對誤差為該方法相對誤差為2%-5%。 (3)操作簡便操作簡便,快速快速,選擇性好選擇性好,儀器設(shè)備簡單。儀器設(shè)備

4、簡單。 (4)應(yīng)用廣泛應(yīng)用廣泛 可測定大多數(shù)無機(jī)物質(zhì)及具有共軛可測定大多數(shù)無機(jī)物質(zhì)及具有共軛雙鍵的有機(jī)化合物。雙鍵的有機(jī)化合物。2022-5-12二二二. . . 物質(zhì)對光的選擇性吸收及吸收曲線物質(zhì)對光的選擇性吸收及吸收曲線物質(zhì)對光的選擇性吸收及吸收曲線分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性使其對不同波長光的吸收程度不同；溶液分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性使其對不同波長光的吸收程度不同；溶液之所以呈現(xiàn)不同的顏色之所以呈現(xiàn)不同的顏色.是與它對光的選擇性吸收有關(guān)是與它對光的選擇性吸收有關(guān)溶液的顏色由透過光的波長所決定溶液的顏色由透過光的波長所決定 光的互補(bǔ)光的互補(bǔ)：藍(lán)：藍(lán) 黃黃 綠綠 黃黃 青青 橙橙 白光白光 青藍(lán)青藍(lán) 紅紅 藍(lán)藍(lán)

5、 紫紅紫紅2022-5-12 如果讓一束白光通過三棱鏡，就分解為紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫七如果讓一束白光通過三棱鏡，就分解為紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫七種顏色的光，這種現(xiàn)象稱為種顏色的光，這種現(xiàn)象稱為光的色散光的色散。每種顏色的光具有一定的波長范圍。每種顏色的光具有一定的波長范圍。我們把白光叫做我們把白光叫做復(fù)合光復(fù)合光；把只具有一種顏色的光，叫做；把只具有一種顏色的光，叫做單色光單色光。不僅七種。不僅七種單色光可以混合成白光，如果把適當(dāng)顏色的兩種單色光按一定的強(qiáng)度比例單色光可以混合成白光，如果把適當(dāng)顏色的兩種單色光按一定的強(qiáng)度比例混合，也可以成為白光。這兩種單色光就叫做混合，也可以成為白光

6、。這兩種單色光就叫做互補(bǔ)色互補(bǔ)色。 用不同波長的單色光照射，測吸光度用不同波長的單色光照射，測吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo)以吸光度為縱坐標(biāo),以光的波長為以光的波長為橫坐標(biāo)作圖得到橫坐標(biāo)作圖得到 吸收曲線與最大吸收波長吸收曲線與最大吸收波長 max2022-5-12吸收曲線的討論：吸收曲線的討論：吸收曲線的討論：吸收曲線的討論：吸收曲線的討論：吸收曲線的討論：（1）同一種物質(zhì)對不同波長光的吸光度）同一種物質(zhì)對不同波長光的吸光度不同。吸光度最大處對應(yīng)的波長稱為不同。吸光度最大處對應(yīng)的波長稱為最大最大吸收波長吸收波長max; （2）不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲）不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似

7、線形狀相似max不變。而對于不同物質(zhì)，不變。而對于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和它們的吸收曲線形狀和max則不同則不同。（3）吸收曲線可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)之）吸收曲線可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)之一。一。（4）不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長下吸光度不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長下吸光度 A 有差異，在有差異，在max處吸光度處吸光度A 的差異最大。此特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。的差異最大。此特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。（5）在在max處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測定最靈敏。吸處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測定最靈敏。吸收曲線是定

8、量分析中選擇入射光波長的重要依據(jù)。收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要依據(jù)。2022-5-12三、光的吸收定律三、光的吸收定律三、光的吸收定律 1.1.朗伯朗伯比耳定律比耳定律 布格布格( (BouguerBouguer) )和朗伯和朗伯( (Lambert)Lambert)先后于先后于17291729年和年和17601760年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關(guān)系。年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關(guān)系。A Ab b 18521852年比耳年比耳( (Beer)Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物又提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關(guān)系。濃度之間也具有類似的關(guān)系。A A c c

9、 二者的結(jié)合稱為朗伯二者的結(jié)合稱為朗伯比耳定律，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：比耳定律，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：Alg（I0/It)= b c 或或 Alg（I0/It)= a b c 2022-5-12 Alg（I0/It)= b c 式中式中: A：吸光度；描述溶液對光的吸收程度；吸光度；描述溶液對光的吸收程度； b：液層厚度液層厚度(光程長度光程長度)，通常以，通常以cm為單位；為單位； c：溶液的摩爾濃度，單位溶液的摩爾濃度，單位molL； ：摩爾吸光系數(shù)，單位摩爾吸光系數(shù)，單位Lmolcm；Alg（I0/It)= a b c 式中式中 : c：溶液的濃度，單位溶液的濃度，單位gL a：吸光系數(shù)，單位吸光系

10、數(shù)，單位Lgcm a與與的關(guān)系為：的關(guān)系為： a =/M （M為摩爾質(zhì)量）為摩爾質(zhì)量）2022-5-12透光度透光度透光度( ( (透光率透光率透光率) ) )T T T透過度透過度T : 描述入射光透過溶液的程度描述入射光透過溶液的程度: T = I t / I0吸光度吸光度A與透光度與透光度T的關(guān)系的關(guān)系: A lg T 朗伯朗伯比耳定律是吸光光度法的理論基礎(chǔ)和定量測定的依比耳定律是吸光光度法的理論基礎(chǔ)和定量測定的依據(jù)。應(yīng)用于各種光度法的吸收測量；據(jù)。應(yīng)用于各種光度法的吸收測量； 摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)(L.mol-1.cm-1)在數(shù)值上等于濃度為在數(shù)值上等于濃度為1 mol/L、液層厚

11、度為液層厚度為1cm時(shí)該溶液在某一波長下的吸光度；時(shí)該溶液在某一波長下的吸光度； 吸光系數(shù)吸光系數(shù)a(Lg-1cm-1）相當(dāng)于濃度為相當(dāng)于濃度為1 g/L、液層厚度液層厚度為為1cm時(shí)該溶液在某一波長下的吸光度。時(shí)該溶液在某一波長下的吸光度。2022-5-122.2.2.摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)(比例常數(shù)比例常數(shù)比例常數(shù)) ) )討論討論討論 （1 1）吸收物質(zhì)在一定波長和溶劑條件下的吸收物質(zhì)在一定波長和溶劑條件下的特征常數(shù)特征常數(shù)； （2 2）不隨濃度不隨濃度c c和光程長度和光程長度b b的改變而改變的改變而改變。在溫度和。在溫度和波長等條件一定時(shí)，波長等條件一定時(shí)，僅與吸收物

12、質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān), ,與待測物濃度無關(guān)；與待測物濃度無關(guān)； （3 3）可作為可作為定性鑒定的參數(shù)定性鑒定的參數(shù)； （4）同一吸收物質(zhì)在不同波長下的）同一吸收物質(zhì)在不同波長下的值是不同的。在值是不同的。在最大吸收波長最大吸收波長max處的摩爾吸光系數(shù)，常以處的摩爾吸光系數(shù)，常以max表示。表示。max表明了該表明了該吸收物質(zhì)最大限度的吸光能力吸收物質(zhì)最大限度的吸光能力，也反映了，也反映了光度法測定該物質(zhì)可能達(dá)到的最大靈敏度。光度法測定該物質(zhì)可能達(dá)到的最大靈敏度。 2022-5-12（5 5）max越大表明該物質(zhì)的吸光能力越強(qiáng)，用光度法測定該越大表明該物質(zhì)的吸光能力越強(qiáng)，

13、用光度法測定該物質(zhì)的靈敏度越高。物質(zhì)的靈敏度越高。105：超高靈敏；：超高靈敏；=(610）104 ：高靈敏；：高靈敏；2104 ：不靈敏。：不靈敏。（6）在數(shù)值上等于濃度為在數(shù)值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為液層厚度為1cm時(shí)該溶時(shí)該溶液在某一波長下的吸光度。液在某一波長下的吸光度。（7）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及應(yīng)用）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及應(yīng)用 配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在一定條件下進(jìn)行測定配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在一定條件下進(jìn)行測定。然后以吸光度為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到一條。然后以吸光度為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，也稱做工作曲線。曲線的斜率為標(biāo)準(zhǔn)曲線，也稱做

14、工作曲線。曲線的斜率為b，由此可得到，由此可得到摩爾吸收系數(shù)摩爾吸收系數(shù)；也可根據(jù)未知液的；也可根據(jù)未知液的Ax,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知液的濃度知液的濃度cx。2022-5-12 （7）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及應(yīng)用）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及應(yīng)用 配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在一定條件下進(jìn)行測定。配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在一定條件下進(jìn)行測定。然后以吸光度為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲然后以吸光度為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，也稱做工作曲線。線，也稱做工作曲線。曲線的斜率為曲線的斜率為b，由此可得到摩爾吸收系由此可得到摩爾吸收系數(shù)數(shù)；也可根據(jù)未知液的；也可根

15、據(jù)未知液的Ax,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知液的濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知液的濃度Cx。2022-5-123.3.3.偏離朗伯偏離朗伯偏離朗伯比耳定律的原因比耳定律的原因比耳定律的原因標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定未知溶液的濃度時(shí)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定未知溶液的濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線常發(fā)生彎曲（尤其當(dāng)溶現(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線常發(fā)生彎曲（尤其當(dāng)溶液濃度較高時(shí)），這種現(xiàn)象稱為對朗液濃度較高時(shí)），這種現(xiàn)象稱為對朗伯伯比耳定律的偏離比耳定律的偏離 引起這種偏離的因素（兩大類）引起這種偏離的因素（兩大類）: : （1 1）物理性因素，即儀器的非理想物理性因素，即儀器的非理想引起的；引起的； （2 2）化學(xué)性因素?；瘜W(xué)性因素。2022-5-12（1

16、 1 1）物理性因素物理性因素物理性因素 a.a.難以獲得真正的純單色光難以獲得真正的純單色光 b.介質(zhì)不均勻性引起的偏離介質(zhì)不均勻性引起的偏離(2) (2) (2) 化學(xué)性因素化學(xué)性因素化學(xué)性因素( ( (溶液的化學(xué)變化而引起的偏溶液的化學(xué)變化而引起的偏溶液的化學(xué)變化而引起的偏離離離) ) ) 2022-5-12儀器儀器儀器 可見分光光度計(jì)2022-5-12儀器儀器儀器 紫外-可見分光光度計(jì)2022-5-12一、基本組成一、基本組成一、基本組成光源單色器樣品室檢測器顯示1. 1. 光源光源 在整個(gè)紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具在整個(gè)紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻

17、射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。 可見光區(qū)：鎢燈作為可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在光源，其輻射波長范圍在400400800 nm800 nm。 紫外區(qū)：氫、氘燈。紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射發(fā)射185185400400(200-400) (200-400) nmnm的連續(xù)光譜。的連續(xù)光譜。2022-5-12 2.2.2.單色器單色器單色器 將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任波長單色光的光學(xué)系統(tǒng)。波長單色光的光學(xué)系統(tǒng)。 入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器；入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單

18、色器； 準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束； 色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵棱鏡或光柵； 聚焦裝置：透鏡或聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至后所得單色光聚焦至出射狹縫；出射狹縫； 出射狹縫。出射狹縫。2022-5-123. 3. 3. 樣品室樣品室樣品室（比色皿）（比色皿）（比色皿） 樣品室放置各種類型的吸收池樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須

19、采用石英池，可見區(qū)一在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。般用玻璃池。4. 4. 檢測器檢測器 利用光電效應(yīng)將透過吸收池的利用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號(hào)變成可測的電信號(hào)，常用的光信號(hào)變成可測的電信號(hào)，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。有光電池、光電管或光電倍增管。5. 5. 結(jié)果顯示記錄系統(tǒng)結(jié)果顯示記錄系統(tǒng) 檢流計(jì)、數(shù)字顯示、微機(jī)進(jìn)行檢流計(jì)、數(shù)字顯示、微機(jī)進(jìn)行儀器自動(dòng)控制和結(jié)果處理儀器自動(dòng)控制和結(jié)果處理2022-5-12分光光度計(jì)儀器的校準(zhǔn)分光光度計(jì)儀器的校準(zhǔn)分光光度計(jì)儀器的校準(zhǔn)分光光度計(jì)儀器的校準(zhǔn)分光光度計(jì)儀器的校準(zhǔn)分光光度計(jì)儀器的校準(zhǔn) 1、波長的校準(zhǔn) 2、吸光度的校正 3、雜散光的

20、校正 4、比色皿的校正2022-5-12可見分光光度計(jì)使用的注意事項(xiàng)可見分光光度計(jì)使用的注意事項(xiàng)可見分光光度計(jì)使用的注意事項(xiàng)可見分光光度計(jì)使用的注意事項(xiàng)可見分光光度計(jì)使用的注意事項(xiàng)可見分光光度計(jì)使用的注意事項(xiàng)（1）每臺(tái)儀器所配套的比色皿，不能與其他儀器的比色皿單個(gè)調(diào)換。（2）為確保儀器穩(wěn)定，在電壓波動(dòng)較大時(shí)，應(yīng)將220V電源預(yù)先穩(wěn)定。（3）當(dāng)儀器工作不正常時(shí)，如數(shù)字顯示無亮光、光源燈不亮?xí)r，應(yīng)檢查儀器后蓋保險(xiǎn)絲是否損壞，然后檢查電源是否接通，再查電路。（4）每次使用結(jié)束后，應(yīng)仔細(xì)檢查樣品室內(nèi)是否有溶液溢出，若有溢出隨時(shí)用濾紙吸干，否則會(huì)引起測量誤差或影響儀器使用壽命。（5）每周要檢查一次儀器內(nèi)

21、部干燥筒內(nèi)防潮硅膠是否已經(jīng)變色，如發(fā)現(xiàn)已變?yōu)榧t色，應(yīng)及時(shí)取出調(diào)換或烘干至藍(lán)色，待冷卻后再放入。2022-5-12比色皿使用的注意事項(xiàng)比色皿使用的注意事項(xiàng)比色皿使用的注意事項(xiàng)比色皿使用的注意事項(xiàng)比色皿使用的注意事項(xiàng)比色皿使用的注意事項(xiàng)（1）取拿比色皿時(shí)，應(yīng)用手捏住比色皿的毛面，切勿觸及透光面，以免透光面被玷污或磨損。（2）被測液以倒至比色皿的約3/4高度處為宜。（3）在測定一系列溶液的吸光度時(shí)，通常都是按從稀到濃的順序進(jìn)行。使用的比色皿必須先用待測溶液潤洗2-3次。（4）比色皿外壁的液體應(yīng)用吸水紙吸干。（5）清洗比色皿時(shí)，一般用水沖洗。如比色皿被有機(jī)物沾污，宜用鹽酸-乙醇混合液浸泡片刻，再用水沖

22、洗，不能用堿液或強(qiáng)氧化性洗滌液清洗，也不能用毛刷刷洗，以免拐傷比色皿。2022-5-12顯色反應(yīng)的顯色反應(yīng)的顯色反應(yīng)的要求要求要求選擇顯色反應(yīng)時(shí)，應(yīng)考慮的因素選擇顯色反應(yīng)時(shí)，應(yīng)考慮的因素 靈敏度高、選擇性高、生成物穩(wěn)定、所形成的有色化靈敏度高、選擇性高、生成物穩(wěn)定、所形成的有色化合物與顯色劑之間的差別要大。合物與顯色劑之間的差別要大。2022-5-12顯色反應(yīng)條件的選擇顯色反應(yīng)條件的選擇顯色反應(yīng)條件的選擇1.1.顯色劑用量顯色劑用量 2.2.反應(yīng)體系的酸度反應(yīng)體系的酸度3.3.顯色時(shí)間與溫度顯色時(shí)間與溫度4.4.溶劑溶劑 2022-5-12共存離子干擾的消除共存離子干擾的消除共存離子干擾的消除

23、1、盡可能選用選擇性高、靈敏度也高的試劑2、控制酸度，使干擾離子不產(chǎn)生顯色反應(yīng)3 、加入掩蔽劑 選擇掩蔽劑的原則是：掩蔽劑不與待測組分反應(yīng)；掩蔽選擇掩蔽劑的原則是：掩蔽劑不與待測組分反應(yīng)；掩蔽劑本身及掩蔽劑與干擾組分的反應(yīng)產(chǎn)物不干擾待測組分的劑本身及掩蔽劑與干擾組分的反應(yīng)產(chǎn)物不干擾待測組分的測定。測定。4、加入氧化劑或還原劑，改變干擾離子的價(jià)態(tài)以消除干擾5、選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL以消除干擾6、萃取法消除干擾7、選用其他能將被測組分與雜質(zhì)分離的步驟，如：交換離子、蒸餾等8、利用參比溶液消除顯色劑和某些有色共存離子的干擾9、利用校正系數(shù)從測定結(jié)果中扣除干擾離子影響2022-5-12測定條件的選擇測定條件的選擇測定條件的選擇1.1.選擇適當(dāng)?shù)娜肷洳ㄩL選擇適當(dāng)?shù)娜肷洳ㄩL 一般應(yīng)該選擇一般應(yīng)該選擇maxmax為入射光波長。為入射光波長。 如果如果maxmax處有共存組分干擾時(shí)，則應(yīng)考慮選擇靈敏度處有共存組分干擾時(shí)，則應(yīng)考慮選擇靈敏度稍低但能避免干擾