PRDX5基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建-最新資料

1、PRDX盅因啟動(dòng)子的熒光素幅報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建ConstructionofLuciferaseReporterPlasmidPRDXSGenePromoterHULe-lin(SchoolofMedicine,TheAnhuiUniversityofScienceandTechnology,Huainan232001,Anhui,China):ObjectiveToconstructapGL3-PRDX5-promoter-Lucplasmidandtovertifyingitsluciferaseactivity.Methods®searchthenucleicacidsequence

2、ofthepromoterPRDX5bybioinformaticsanalysis.MethodsofPCRwasperformedtoamplifythepromoterPRDX5.thepromoterPRDX5wasinsertedintopGL3-BasiccloningvectortoconstructluciferasereporterplasmidwiththepromoterPRDX5DpGL3-PRDX5-promoter-Lucplasmidwasverifiedbydouble-enzymecleavageandsequencingmethod.ResultspGL3-

3、PRDX5-promoter-Lucplasmidwasidentifiedtobecorrectbydouble-enzymecleavageandsequencingmethod.ConclusionApGL3-PRDX5-promoter-Lucplasmidwassuccessfullyconstructed.PRDX斃Peroxiredoxins(PRDXs過氧化物酶家族蛋白的一種，研究顯示在它廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物的各種細(xì)胞，定位于細(xì)胞質(zhì)、過氧化物酶體和線粒體中，但在許多細(xì)胞中PRDX庭要定位于線粒體，它與組織過氧化物、過氧化亞硝基陰離子有高的親和力1。Masakishiota2等人發(fā)

4、現(xiàn)在外源過氧化氫處理或組織缺氧情況下人類前列腺癌PC3細(xì)胞PRDX費(fèi)達(dá)增高。研究還顯示人類定位于線粒體的PRDX5保護(hù)線粒體DN隱受過氧化氫的損傷。并且PRDX3夠抑制p53誘導(dǎo)的活性氧簇的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡3。1材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料1.1.1 菌種、質(zhì)粒和細(xì)胞系大腸桿菌tans-5a購自Trans-Gene（全式金）公司；載體質(zhì)粒pGL3-Basic,由本室保存。1.1.2 DNA重組所用工具酶及試劑BglII、MluI等限制性內(nèi)切酶，TaqDNAPolymerase,T4DNALigase購自NewEnglandLab和Promega公司。大提質(zhì)粒試劑盒購自威格拉斯儀器XX公司。其它常規(guī)

5、試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。1.2 方法1.2.1 用PCRF口酶切的方法得到目的片段利用DNAI取試劑盒在U2OSM胞中提取全基因組細(xì)胞作為模板，根據(jù)已知PRDX5cDNA列，由生物信息學(xué)方法自UCS噴據(jù)庫分析其可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，選擇TSS上游約1200bp下游約200bp范圍作為其可能的啟動(dòng)子序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度為1400bp。我們使用軟件DNAMA附析其上可能存在的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，結(jié)合載體質(zhì)粒pGL3-Basic上的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，選擇分別在上、下游引物末端，添加Bglll、MluI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)序列。見表1。1.2.2 目的片段與相應(yīng)載體的連接將擴(kuò)增好的目的片段

6、和PGL3-basic-Luc進(jìn)行同樣的雙酶切鑒定，回收酶切產(chǎn)物，并進(jìn)行質(zhì)粒連接反應(yīng)。在10"的反應(yīng)體系中加入載體、插入片段、T4DNAligase、T4DNAligasebuffer。載體與插入片段的摩爾數(shù)之比控制在1:3,且二者的總量控制在300ng500ng之間，置于4c冰箱連接16h。目的片段和PGL3-basic-Luc通過BglII、MluI酶切位點(diǎn)連接重組質(zhì)粒PGL3-PRDX5-promoter-Luc。1.2.3 篩選陽性質(zhì)粒并測序?qū)⑦B接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5?感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒酶切鑒定，酶切正確的質(zhì)粒送至公司測序確定。2結(jié)果2.1 生物信息學(xué)方法預(yù)測PRDX

7、砧動(dòng)子序列根據(jù)已知的PRDX5cDNAf歹U,在UCSCGenomeBioinformatics(/)數(shù)據(jù)庫中，預(yù)測其可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。根據(jù)預(yù)測的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，將其上游約1200bp下游約200bp范圍作為可能的啟動(dòng)子序列。2.2 PCR方法擴(kuò)增預(yù)測序列根據(jù)預(yù)測啟動(dòng)子的序列設(shè)計(jì)引物，利用DNAfg取試劑盒在U2OSM胞中提取全基因組細(xì)胞作為模板，用PCR式劑盒擴(kuò)增出約1.4kb的目的條帶。見圖1。圖1PCRT增PRDX5promoter結(jié)果2.3 構(gòu)建pGL3-PRDX5-promoter-Luc熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒將擴(kuò)增好的目的片段和PGL3-basic-Lu

8、c進(jìn)行同樣的雙酶切鑒定，回收酶切產(chǎn)物，并進(jìn)行質(zhì)粒連接反應(yīng)。再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，接種在帶氨芾西林的LB固體培養(yǎng)基中，37C孵育過夜后。挑出陽性克隆，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。圖2為0.8%的瓊脂糖凝膠結(jié)果，可看出在相應(yīng)的大小條帶上出現(xiàn)陽性結(jié)果。圖2PRDX痘動(dòng)子片段連接入熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-Basic酶切鑒定。挑選的克隆擴(kuò)增后所提質(zhì)粒進(jìn)行KpnI、NheI限制性內(nèi)切酶雙酶切。2.4 篩選陽性質(zhì)粒并測序?qū)⑦B接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5?感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒酶切鑒定，酶切正確的質(zhì)粒送至公司測序確定。3討論P(yáng)RDX斃Peroxiredoxins過氧化物酶家族蛋白的一種，但在許多細(xì)胞中PRDX駐要定位于線粒體。在氧化應(yīng)激情況下PRDX球族蛋白能將H2O2轉(zhuǎn)化為水，清除ROS抵抗ROS寸細(xì)胞的損害4。YuanZhou等在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中首次證實(shí)PRDX5發(fā)揮抗氧化劑功能，抑制p53誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)ROSPRDX5勺晶體結(jié)構(gòu)研究顯示，與PRDX琮族的其它成員相比，PRDX瞑