藥品微生物限度檢查法教學(xué)內(nèi)容

1、藥品微生物限度檢查法 檢驗(yàn)全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，在環(huán)境潔凈度10000級和局部潔凈度100級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，以防止再污染。單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 1629216294-1996 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。潔凈級別潔凈級別 塵粒數(shù)/m3浮游菌個(gè)/m2沉降菌個(gè)/0.5h微粒直徑0.5um微粒直徑5um1003,50005110000350,000200010031000003,500,00020,00050010檢驗(yàn)量檢驗(yàn)量 檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量（g、ml或 cm2） 一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于

2、檢驗(yàn)用量（兩個(gè)以上最小包裝單位）的3倍量供試品。 除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml；中藥膜劑為50cm2 貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。 要求檢查沙門菌的供試品其檢驗(yàn)量應(yīng)增加10g或10ml 供試液的制備供試液的制備 根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液采取適宜的方法制備供試液。供試液 制備若需用水浴加溫時(shí)，溫度不應(yīng)超過制備若需用水浴加溫時(shí)，溫度不應(yīng)超過45。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培 養(yǎng)基，不得超過養(yǎng)基，不得超過1小時(shí)。小時(shí)。 除另有規(guī)定外，常用的供試品制備方法除另有規(guī)定外

3、，常用的供試品制備方法如下：如下： （1）液體供試品）液體供試品 取供試品取供試品10ml,加稀釋劑至加稀釋劑至100ml中混勻，作為中混勻，作為1:10 供試液。水溶性液供試液。水溶性液體制劑可用混合的供試品原液直接作為供試體制劑可用混合的供試品原液直接作為供試液。液。 （2）固體、半固體或黏稠性供試品）固體、半固體或黏稠性供試品 取供試取供試品品10g加稀釋劑至加稀釋劑至100ml中，用勻漿儀或其它中，用勻漿儀或其它適宜的方法，混勻后，作為適宜的方法，混勻后，作為1:10供試液。供試液。 供試液的制備供試液的制備非水溶性供試品取供試品5g(5ml)，加入司盤80 5g、單硬脂酸甘油酯3g、

4、聚山梨酯80 10g的無菌溶化混合物（溫度低于45）的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團(tuán)后，慢慢加入45左右的稀釋劑至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1:20供試液。特殊供試液制備方法特殊供試液制備方法特殊供試液制備方法特殊供試液制備方法取供試品10g，加至含玻璃珠和20ml的無菌十四烷酸異丙酯的容器中，充分振搖，使供試品溶解，再加入約45的稀釋劑，振搖5-10分鐘，萃取，待油水明顯分層，取其水層作為1:10供試液。十四烷酸異丙酯的滅菌方法：采用薄膜過濾法除菌，選用孔徑為0.22um的脂溶性濾膜，在140干熱滅菌2小時(shí)。 特殊供試液制備方法特殊供試液制備方法 非水溶性膜劑供試品 取50c

5、m2,剪碎，加適量的稀釋劑（通常為每1ml或每2ml含1cm2）,浸泡，振搖，以供試品浸液作為1:10或1:20供試品。特殊供試液制備方法特殊供試液制備方法 腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品 取供試品10g，加至100ml pH6.8磷酸鹽緩沖液（腸溶制劑）中或pH7.6磷酸鹽緩沖液（結(jié)腸制劑），置45水浴中，振搖，使溶解，作為1:10的供試液。特殊供試液制備方法特殊供試液制備方法 具抑菌活性的供試品 當(dāng)供試品有抑菌活性時(shí)，應(yīng)消除其抑菌活性后，再依法檢查。 常用的方法有：培養(yǎng)基稀釋法離心沉淀集菌法 3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，500轉(zhuǎn)/分離心5分薄膜過濾法中和法菌數(shù)報(bào)告規(guī)則菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 細(xì)菌數(shù)酵母菌平均

6、菌落數(shù)在30-300，霉菌平均菌落數(shù)在30-100 之間的稀釋級作為菌數(shù)報(bào)告的依據(jù)。 當(dāng)僅有個(gè)稀釋級的菌落數(shù)符合上述規(guī)定，以該級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則菌數(shù)報(bào)告規(guī)則當(dāng)同時(shí)有2個(gè)稀釋級的菌落數(shù)符合上述規(guī)定時(shí)，視兩者比值（比值為高稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值除以低稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值）而定。若比值不大于2，以兩稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的均值報(bào)告菌數(shù)；若比值大于2但不超過5時(shí)，以低稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。當(dāng)出現(xiàn)比值大于5或高稀釋級的菌落數(shù)大于或等于低稀釋級的菌落數(shù)等異常情況時(shí)，應(yīng)查明原因再行檢查，必要時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法的重新驗(yàn)證。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則菌數(shù)報(bào)

7、告規(guī)則當(dāng)各稀釋級的平均菌落數(shù)均小于30，以最低稀釋級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則菌數(shù)報(bào)告規(guī)則各各稀釋級菌落平均數(shù)比值菌落數(shù)報(bào)告1：10 1：102 1：103 不可計(jì)不可計(jì)不可計(jì)39240.51642952714119020466041.62.210.2164003775027100異常240516000380002700024010操作要點(diǎn)操作要點(diǎn) 一個(gè)細(xì)菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一個(gè)或多個(gè)菌細(xì)胞生長繁殖而成，因此供試品中所測得的菌落數(shù)，實(shí)際為菌落形成單

8、位數(shù)（colony forming unity, cfu） 供試品檢驗(yàn)的全過程必須符合無菌技術(shù)要求。 培養(yǎng)基、稀釋劑、實(shí)驗(yàn)器具等的滅菌，按滅菌法（見附錄）的要求采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。操作要點(diǎn)操作要點(diǎn) 作供試品稀釋時(shí)，每一稀釋級都要更換吸管。 細(xì)菌培養(yǎng)48h，真菌培養(yǎng)72h，計(jì)數(shù)。如菌落極小，不易辨認(rèn)可適當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間。再點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。 含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測定霉菌數(shù)，用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基測定酵菌數(shù)，并且合并計(jì)數(shù)。 若同一稀釋級兩個(gè)平板的菌落平均數(shù)不小于15，則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1 倍或以上。 使用滅菌吸管時(shí)，管尖不要接觸可能污染的任何容器或用具。 供

9、試液稀釋及注皿時(shí)應(yīng)振搖后取均勻的供試液，以免造成實(shí)驗(yàn)誤差。操作要點(diǎn)操作要點(diǎn)培養(yǎng)基的分裝量不得超過容器的2/3以免滅菌時(shí)溢出。包裝時(shí)，塞子必須塞緊，以免松動或脫落造成染菌。培養(yǎng)基配制后應(yīng)在2h內(nèi)滅菌，避免細(xì)菌繁殖。滅菌后的培養(yǎng)基應(yīng)保存在2-25 防止被污染，可在三周內(nèi)用畢。已溶化的培養(yǎng)基應(yīng)一次用完，一般開啟后不宜再用，更不要反復(fù)加熱溶化 注皿時(shí)培養(yǎng)基應(yīng)在451，高于45時(shí)易造成細(xì)菌受損或致死，低于45時(shí)易凝固，影響混勻，因此使用前可用水浴保溫效果較好。傾注培養(yǎng)基于平皿中與樣品搖勻時(shí)，切勿濺到皿蓋邊和皿蓋上，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 操作要點(diǎn)操作要點(diǎn)l采用薄膜過濾法時(shí)，水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液

10、過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml，沖洗液、沖洗量及沖洗方法同方法驗(yàn)證試驗(yàn)。每片濾膜的總過濾量不宜過大，以避免濾膜上的微生物受損傷。操作要點(diǎn)操作要點(diǎn)每張濾膜取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液直接過濾或加至適量稀釋劑中混勻，過濾，用適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法及沖洗量同“計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證”，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜，濾膜

11、貼于平板上時(shí)不得有空隙或氣泡，否則影響微生物生長。 操作要點(diǎn)操作要點(diǎn) 異常情況處理異常情況處理 菌落蔓延：培養(yǎng)中由于一些菌落蔓延菌落蔓延：培養(yǎng)中由于一些菌落蔓延生長而影響另一些菌落生長，甚至掩蓋生長而影響另一些菌落生長，甚至掩蓋了另一些菌落，干擾計(jì)數(shù)。了另一些菌落，干擾計(jì)數(shù)。 原因：有動力和培養(yǎng)環(huán)境濕度過大造原因：有動力和培養(yǎng)環(huán)境濕度過大造成，給動力菌造成泳動的條件，促使形成，給動力菌造成泳動的條件，促使形成蔓延菌落機(jī)會增多。成蔓延菌落機(jī)會增多。 加TTC：于傾注培養(yǎng)基前，在每1000ml營養(yǎng)瓊脂內(nèi)加入滅菌1%TTC溶液1ml混勻后傾注平皿。 開蓋干燥：將已凝固的瓊脂平板開蓋，倒置斜放于凈化工

12、作臺上，開機(jī)1-2h后合蓋，再放培養(yǎng)箱中 換陶瓦蓋：將已凝固的瓊脂平板蓋換上新近干熱滅菌的陶瓦蓋。異常菌數(shù)報(bào)告異常菌數(shù)報(bào)告 在特殊情況下，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長的霉菌、酵母菌多于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上菌落數(shù)則以營養(yǎng)瓊脂平板的霉菌、酵母菌菌落數(shù)報(bào)告，反之如玫瑰紅鈉瓊脂平板生長了細(xì)菌，且多于營養(yǎng)瓊脂平板的菌落數(shù)，則以玫瑰紅鈉瓊脂平板的細(xì)菌數(shù)報(bào)告 控制菌的檢查控制菌的檢查 大腸埃希菌檢驗(yàn)程序大腸埃希菌檢驗(yàn)程序 供試品 供試液 不少于100ml的 膽鹽乳糖增菌液 35371824h 取 0.2ml 5mlMUG培養(yǎng)基中 35375、24h 366nm紫外光下觀察 加靛基質(zhì)試劑 MUG陽性，靛基質(zhì) 陽性 M

13、UG陰性，靛基質(zhì) 陽性MUG陰性，靛基質(zhì) 陰性 MUG陽性，靛基質(zhì) 陰性 取膽鹽乳糖培養(yǎng)液劃線 報(bào)告 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板 3611824h 陽性 陰性 鏡檢、適宜的生化試驗(yàn) 報(bào)告 大腸埃希菌檢驗(yàn)程序大腸埃希菌檢驗(yàn)程序 供試品 供試液 不少于100ml的 膽鹽乳糖增菌液 35371824h 取 0.2ml 5mlMUG培養(yǎng)基中 35375、24h 366nm紫外光下觀察 加靛基質(zhì)試劑 MUG陽性，靛基質(zhì) 陽性 MUG陰性，靛基質(zhì) 陽性MUG陰性，靛基質(zhì) 陰性 MUG陽性，靛基質(zhì) 陰性 取膽鹽乳糖培養(yǎng)液劃線 報(bào)告 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板 3611824h 陽性 陰性 鏡

14、檢、適宜的生化試驗(yàn) 報(bào)告 報(bào)告注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 配制MUG培養(yǎng)基時(shí)，務(wù)必校正pH值 ，滅菌后pH不得過7.4否則pH值偏高，MUG分解本身則顯熒光。 供試品培養(yǎng)液接種于MUG培養(yǎng)基中，培養(yǎng)時(shí)間一般在4h、24h觀察是否產(chǎn)生熒光，如熒光很微弱，不能準(zhǔn)確判斷時(shí)，可延長培養(yǎng)時(shí)間至48h再觀察結(jié)果。由于大腸埃希菌各菌株間的GUD的活性不完全相同，對底物和底物的濃度反應(yīng)的差異；培養(yǎng)基中選擇因子的影響；培養(yǎng)時(shí)間、溫度；pH的改變；大量競爭菌和樣品本身物質(zhì)成分的干擾等，對結(jié)果的判斷亦有影響。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 觀察供試品MUG管時(shí)，可與陽性對照管、陰性對照管同時(shí)在366nm紫外燈下觀察。 在曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥

15、康凱瓊脂平板上生長的可疑菌落，務(wù)必挑選2-3個(gè)以上菌落分別做IMViC試驗(yàn)鑒別。 在IMViC試驗(yàn)中，以滅菌接種環(huán)沾取菌苔，首先接種于枸椽酸鹽瓊脂斜面上，然后再接種于蛋白胨水等其它培養(yǎng)基上，切務(wù)將培養(yǎng)基帶入枸椽酸鹽瓊脂斜面上，以免產(chǎn)生假陽性結(jié)果。大腸菌群大腸菌群大腸菌群作為水質(zhì)糞便污染的指示菌已有大腸菌群作為水質(zhì)糞便污染的指示菌已有80多年歷史。大腸菌群的定多年歷史。大腸菌群的定義：是指義：是指37生長時(shí)能發(fā)酵乳糖，在生長時(shí)能發(fā)酵乳糖，在24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性無內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性無芽孢桿菌，符合上述定義的細(xì)菌除大腸埃希氏桿菌屬外，還包括腸芽孢桿菌，符合上述定義的細(xì)菌除大腸埃希氏桿菌屬外，

16、還包括腸桿菌科的腸桿菌屬、枸椽酸菌屬、克雷伯菌屬等，實(shí)際上基本包括桿菌科的腸桿菌屬、枸椽酸菌屬、克雷伯菌屬等，實(shí)際上基本包括人和了正常家畜腸道內(nèi)的全部需氧的革蘭陰性桿菌，較大腸埃希菌人和了正常家畜腸道內(nèi)的全部需氧的革蘭陰性桿菌，較大腸埃希菌更具代表性，且存活時(shí)間較長。故檢出大腸埃希菌，一般認(rèn)為藥品更具代表性，且存活時(shí)間較長。故檢出大腸埃希菌，一般認(rèn)為藥品受糞便的近期污染；而檢出大腸菌群，則表示藥品受糞便的近期或受糞便的近期污染；而檢出大腸菌群，則表示藥品受糞便的近期或遠(yuǎn)期污染。以大腸菌群作為口服藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的控制菌，具遠(yuǎn)期污染。以大腸菌群作為口服藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的控制菌，具有廣泛的衛(wèi)生

17、學(xué)意義，更能反映藥品的衛(wèi)生質(zhì)量。有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義，更能反映藥品的衛(wèi)生質(zhì)量。操作方法操作方法取乳糖膽鹽發(fā)酵管取乳糖膽鹽發(fā)酵管3支，分別加入支，分別加入1:10供試液供試液1ml (供試品量供試品量0.1g或或0.1ml), 1:100供試液供試液1ml(供試供試品量品量0.01g或或0.01ml),1:1000供試液供試液1ml（供試品（供試品量量0.001g或或0.001ml），同時(shí)作陰性對照，各管），同時(shí)作陰性對照，各管置置361培養(yǎng)培養(yǎng)18-24h, 陰性對照應(yīng)無菌生長。陰性對照應(yīng)無菌生長。結(jié)果判斷結(jié)果判斷 乳糖膽鹽發(fā)酵管若無菌生長，或有菌生長但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣（或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣）報(bào)告 未檢出大腸

18、菌群；如有產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應(yīng)做確證試驗(yàn)，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管劃線接種于EMB或麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)18-24h，如平板上無菌落生長可判該管未檢出大腸菌群。如平板上有菌落生長并與藥典所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，鏡檢為革蘭陰性無芽孢桿菌的菌落，應(yīng)取上述平板上的可疑菌落4-5個(gè)各接種1支乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)2448h,凡產(chǎn)酸產(chǎn)氣，革蘭陰性無芽孢桿菌，判該管檢出大腸菌群，反之判該管未檢出大腸菌群。沙門菌檢驗(yàn)程序沙門菌檢驗(yàn)程序 供試品供試品10g(10ml) 200ml的營養(yǎng)肉湯中的營養(yǎng)肉湯中 35371824h 四硫磺酸鹽增菌液四硫磺酸鹽增菌液 35371824h DHL，EMB或或MacC 35371824h

19、 無典型菌落無典型菌落 三糖鐵瓊脂（三糖鐵瓊脂（TSI） 35371824h 報(bào)告報(bào)告 斜面未見紅色（斜面黃色）斜面未見紅色（斜面黃色） 斜面紅色（黃色）斜面紅色（黃色） 底層未見黃色（底層無黑色）底層未見黃色（底層無黑色） 底層黃色（黑色）底層黃色（黑色） 血清凝集、生化試驗(yàn)血清凝集、生化試驗(yàn) 報(bào)告報(bào)告注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 在作氰化鉀試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)注意密封管口，夏天分裝在作氰化鉀試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)注意密封管口，夏天分裝培養(yǎng)基宜在冰浴中進(jìn)行，防止氰化鉀分解，產(chǎn)生氫培養(yǎng)基宜在冰浴中進(jìn)行，防止氰化鉀分解，產(chǎn)生氫氰酸逸出，致使培養(yǎng)基內(nèi)氰化鉀濃度降低，不能抑氰酸逸出，致使培養(yǎng)基內(nèi)氰化鉀濃度降低，不能抑制細(xì)菌生長制細(xì)菌

20、生長 ，造成假陽性。，造成假陽性。 氰化鉀為劇毒品，操作時(shí)須謹(jǐn)慎，用后培養(yǎng)基每氰化鉀為劇毒品，操作時(shí)須謹(jǐn)慎，用后培養(yǎng)基每管加數(shù)粒硫酸亞鐵和管加數(shù)粒硫酸亞鐵和20%氫氧化鉀氫氧化鉀0.5ml去毒，然后去毒，然后再滅菌、洗滌。再滅菌、洗滌。銅綠假單胞菌檢驗(yàn)程序銅綠假單胞菌檢驗(yàn)程序 供試品供試品 供試液供試液 BL增菌液增菌液 35371824h 溴代十六烷三甲胺平板溴代十六烷三甲胺平板 35371824h 氧化酶、革蘭染色鏡檢氧化酶、革蘭染色鏡檢 氧化酶陰性氧化酶陰性 氧化酶陽性氧化酶陽性 非革蘭陰性無芽孢桿菌非革蘭陰性無芽孢桿菌 革蘭陰性無芽孢桿菌革蘭陰性無芽孢桿菌 綠膿菌素綠膿菌素 報(bào)告報(bào)告

21、綠膿菌素陽性綠膿菌素陽性 綠膿菌素陰性綠膿菌素陰性 生化試驗(yàn)生化試驗(yàn) 報(bào)告報(bào)告注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 銅綠假單胞菌污染藥品后，因生產(chǎn)工藝和藥物的銅綠假單胞菌污染藥品后，因生產(chǎn)工藝和藥物的影響，在溴代十六烷基三甲胺平板上的菌落形態(tài)影響，在溴代十六烷基三甲胺平板上的菌落形態(tài)可產(chǎn)生非典型形態(tài)。為防止漏檢，在挑取疑似菌可產(chǎn)生非典型形態(tài)。為防止漏檢，在挑取疑似菌落時(shí)，宜取落時(shí)，宜取23個(gè)以上菌落，分別進(jìn)行檢驗(yàn)，以提個(gè)以上菌落，分別進(jìn)行檢驗(yàn)，以提高銅綠假單胞菌的檢出率。高銅綠假單胞菌的檢出率。 做氧化酶試驗(yàn)時(shí)，試驗(yàn)菌苔必須新鮮，陳舊培養(yǎng)做氧化酶試驗(yàn)時(shí)，試驗(yàn)菌苔必須新鮮，陳舊培養(yǎng)物反應(yīng)不可靠物反應(yīng)不可靠 試驗(yàn)應(yīng)避

22、免與鐵、鎳等金屬接觸，不可用普通接試驗(yàn)應(yīng)避免與鐵、鎳等金屬接觸，不可用普通接種針（環(huán)）（白金材料除外），挑取菌苔，否則種針（環(huán)）（白金材料除外），挑取菌苔，否則易出現(xiàn)假陽性。宜用玻璃棒或木棒。易出現(xiàn)假陽性。宜用玻璃棒或木棒。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 試劑試劑 宜新鮮配制，放置過久，二鹽酸二甲基對苯二宜新鮮配制，放置過久，二鹽酸二甲基對苯二胺氧化變色不可用。胺氧化變色不可用。 該反應(yīng)需在有氧條件下進(jìn)行，勿滴加試劑過多，以該反應(yīng)需在有氧條件下進(jìn)行，勿滴加試劑過多，以免浸沒培養(yǎng)物，使之與空氣隔絕，造成假陰性反應(yīng)。免浸沒培養(yǎng)物，使之與空氣隔絕，造成假陰性反應(yīng)。 綠膿菌素是銅綠假單胞菌鑒定的重要特征，但色素綠膿

23、菌素是銅綠假單胞菌鑒定的重要特征，但色素的產(chǎn)生受許多因素的影響，除菌株差異及變異外，的產(chǎn)生受許多因素的影響，除菌株差異及變異外，培養(yǎng)條件是重要因素，溫度、培養(yǎng)基成分等皆可影培養(yǎng)條件是重要因素，溫度、培養(yǎng)基成分等皆可影響色素產(chǎn)生。培養(yǎng)基中瓊脂、蛋白胨等均應(yīng)事先測響色素產(chǎn)生。培養(yǎng)基中瓊脂、蛋白胨等均應(yīng)事先測試，選用適宜品牌，實(shí)驗(yàn)時(shí)并用陽性菌株作對照試試，選用適宜品牌，實(shí)驗(yàn)時(shí)并用陽性菌株作對照試驗(yàn)。驗(yàn)。金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)程序金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)程序 供試品 供試液 營養(yǎng)肉湯（亞碲酸鈉肉湯） 35371824h 卵黃氯化鈉平板或甘露醇氯化鈉平板 35371824h 無菌落 營養(yǎng)瓊脂斜面 35371824

24、h 報(bào)告 血漿凝固酶試驗(yàn)，革蘭染色鏡檢注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 金黃色葡萄球菌在上述三種分離培養(yǎng)基上的典型菌落為金黃色。但由于受藥物影響或非典型菌株存在，可呈橙黃色、檸檬色或白色。做控制菌檢查，對非典型菌落也有必要進(jìn)行凝固酶試驗(yàn)做金黃色葡萄球菌的篩查，以防漏檢金黃色葡萄球菌。培養(yǎng)基存放時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間影響色素產(chǎn)生，故培養(yǎng)基應(yīng)新鮮配制。培養(yǎng)時(shí)間宜48h以上。 做血漿凝固酶試驗(yàn)應(yīng)用新鮮培養(yǎng)物及新鮮血漿。如用舊培養(yǎng)物及血漿易導(dǎo)致假陰性反應(yīng)。此外，觀察結(jié)果時(shí)不宜搖動試管，因凝固初期凝塊不結(jié)實(shí)易破壞，引起假陰性反應(yīng)。 梭菌的檢驗(yàn)程序 供試液10ml 2份（1份置80水浴保溫10分） 100ml皰肉培養(yǎng)基 厭氧培養(yǎng)7296h 未渾濁、產(chǎn)氣、消化碎肉、臭氣 0.2ml 報(bào)告 含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂平板 厭氧培養(yǎng) 4872h 無菌生長 過氧化氫酶試驗(yàn) 報(bào)告 過氧化氫酶陰性、G+梭 菌有或無卵圓形或球形芽孢 報(bào)告，檢出梭菌 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 厭氧培養(yǎng) 是厭氧菌培養(yǎng)的基本前提，有些厭氧菌嚴(yán)格厭氧，一旦在有氧存在時(shí)迅速死亡，這是導(dǎo)致培養(yǎng)失敗、造成假陰性結(jié)果的主要原因之一因此檢查梭菌，必須保證厭氧的培養(yǎng)條件。厭氧培養(yǎng)方法冷觸媒法：該法是