考馬斯亮藍法(Bradford法)測定蛋白質含量doc

1、考馬斯亮藍法考馬斯亮藍法（Bradford法）法）測定蛋白質含量測定蛋白質含量【實驗目的】【實驗目的】 1. 掌握考馬斯亮藍染色法定量掌握考馬斯亮藍染色法定量測定蛋白質的原理與方法。測定蛋白質的原理與方法。 2. 熟練分光光度計的使用和熟練分光光度計的使用和操作方法。操作方法。 【實驗原理】【實驗原理】 考馬斯亮藍考馬斯亮藍G250測定蛋白質含量屬于測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種。染料結合法的一種。 考馬斯亮藍考馬斯亮藍G250在酸性溶液中呈棕在酸性溶液中呈棕紅色，最大吸收峰在紅色，最大吸收峰在465nm；當它與蛋白；當它與蛋白質通過范德華鍵結合成復合物時變?yōu)樗{色，質通過范德華鍵結合成復合

2、物時變?yōu)樗{色，其最大吸收峰移至其最大吸收峰移至595nm，而且消光系數，而且消光系數更大。更大?？捡R斯亮藍考馬斯亮藍G-250在游離狀態(tài)在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在下呈紅色，最大光吸收在465nm；當它與蛋白質結合；當它與蛋白質結合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質后變?yōu)榍嗌?，蛋白質-色素結色素結合物在合物在595nm波長下有最大波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比。含量成正比。蛋白質與考馬斯亮藍蛋白質與考馬斯亮藍G250的的結合十分迅速，約結合十分迅速，約2min即可即可反應完全，其復合物在反應完全，其復合物在1h內內保持穩(wěn)定。保持穩(wěn)定?？捡R斯亮藍考馬斯亮藍R250

3、與蛋白與蛋白質反應雖然比較緩慢，質反應雖然比較緩慢，但是可以被洗脫下去，但是可以被洗脫下去，所以可以用來對電泳條所以可以用來對電泳條帶染色。帶染色。 在一定蛋白質濃度范圍內在一定蛋白質濃度范圍內 (11000g/ml）,蛋白質染料復合物在蛋白質染料復合物在595nm處的光吸收與蛋白處的光吸收與蛋白質含量成正比，故可用于蛋白質的定量測定。質含量成正比，故可用于蛋白質的定量測定。 由于蛋白質染料復合物具有很由于蛋白質染料復合物具有很高的消光系數，因此大大提高了蛋白高的消光系數，因此大大提高了蛋白質測定的靈敏度（最低檢出量為質測定的靈敏度（最低檢出量為1g）。）?！酒鞑呐c試劑】【器材與試劑】（一）器

4、材（一）器材 1. 可見光分光光度計可見光分光光度計 2. 刻度移液管刻度移液管 3. 移液槍移液槍 （二）試劑（二）試劑 1. NaCl （0.15mol/L） 2. 考馬斯亮藍試劑考馬斯亮藍試劑 3. 蛋白質標準液蛋白質標準液 （1mg /mL） 4. 待測蛋白質溶液待測蛋白質溶液 1.如黑板上表格操作如黑板上表格操作2.繪制標準曲線：以繪制標準曲線：以A595nm為縱坐為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。標紙上繪制標準曲線。3.算出待測蛋白質濃度？算出待測蛋白質濃度？ 定義定義: 分光光度法是利用物質所特有的吸分光光度法是利用物質所特有的

5、吸收光譜來鑒別物質或測定其含量的分析檢測技術。收光譜來鑒別物質或測定其含量的分析檢測技術。 特點特點: 靈敏、精確、快速和簡便，在復雜組靈敏、精確、快速和簡便，在復雜組分系統中，不需要分離，即能檢測出其中所含的分系統中，不需要分離，即能檢測出其中所含的極少量物質。極少量物質。 應用應用: 生物化學研究中廣泛使用的方法之生物化學研究中廣泛使用的方法之一，廣泛用于糖，蛋白質，核酸，酶等的快速定一，廣泛用于糖，蛋白質，核酸，酶等的快速定量檢測。量檢測。 分光光度計的分類分光光度計的分類紅外分光光度計紅外分光光度計:可見光分光光度計可見光分光光度計:紫外分光光度計紫外分光光度計:測定波長范圍為測定波長

6、范圍為大于大于760 nm的的紅外光區(qū)紅外光區(qū) 測定波長范圍為測定波長范圍為400 760 nm的的可見光區(qū)可見光區(qū)測定波長范圍為測定波長范圍為200400 nm的的紫外光區(qū)紫外光區(qū)可見光譜可見光譜可見光范圍內波長和顏色的關系可見光范圍內波長和顏色的關系分光光度計的基本結構分光光度計的基本結構 無論哪一類分光光度計都包括：光源、單無論哪一類分光光度計都包括：光源、單色器、吸收池、檢測器和測量儀表。分光光色器、吸收池、檢測器和測量儀表。分光光度計各部件的次序如圖所示度計各部件的次序如圖所示: 入射光入射光強度強度 Io透射光透射光強度強度 I樣品池樣品池 檢測器檢測器及儀表及儀表單色器單色器光源

7、光源光照射到物質上，物質的分子結構決定光照射到物質上，物質的分子結構決定哪些特定波長的光被吸收。這一現象符哪些特定波長的光被吸收。這一現象符合符合朗伯比耳定律。合符合朗伯比耳定律。入射光強度入射光強度 Io樣品濃度樣品濃度c光程光程 b透射光強度透射光強度 I當一束平行單色光當一束平行單色光(I0)照射有色溶液時，光的一部照射有色溶液時，光的一部分被吸收，一部分透過溶液分被吸收，一部分透過溶液(I)朗伯朗伯比爾定律比爾定律: A=lg(1/T)=Kbc A為吸光度為吸光度;T為透光度為透光度,是透射光強度比上入射光強度（是透射光強度比上入射光強度（I/I0);c為吸光物質的濃度為吸光物質的濃度; b為吸收層厚度為吸收層厚度(光程）光程）. 物理意義物理意義當一束平行單色光垂直通過某一吸光物質時當一束平行單色光垂直通過某一吸光物質時,