脊髓缺血再灌注損傷過程中的脊髓血流量與組織病理學變化

1、脊髓缺血再灌注損傷中的脊髓血流量與組織病理學變化的相關性楊小玉 朱慶三 劉光耀 段德生吉林大學中日聯誼醫(yī)院骨科 長春市 仙臺大街2號130031【摘要】 目的 探討脊髓缺血再灌流損傷過程中的脊髓血流量與組織病理學變化的關系。方法 脊髓缺血再灌注損傷模型建立，通過阻斷大鼠腹主動脈造成脊髓腰尾段缺血。按缺血和再灌流各時間段分別阻斷開放腹主動脈。應用激光多譜勒血流儀，分別連續(xù)測定腰髓血流變化。取缺血前、缺血30分鐘、缺血60分鐘，缺血30分鐘再灌2、4、6、9、12、24h局部脊髓組織進行組織病理和透射電鏡檢查。結果：在缺血30分鐘時腰髓局部血灌流量迅速下降至基線值的-77.51%(P值=2.01E

2、-17) 。再灌流時，局部血流迅速增高并超過基線水平。再灌流10分鐘，局部血灌流量與基線的百分比變化值為60.38%(P值=3.3E-7)，隨后逐漸降低，再灌流30分鐘后，局部血灌流基本恢復基線水平(3.7% P值=0.437899)，以后血流量低于基線水平，出現缺血后延遲低灌流。直至再灌流4小時(-23.5%,P值=1.34E-3)，低灌流保持相對穩(wěn)定，血流未見恢復。結論 再灌注期組織損傷較缺血期嚴重，且病理學改變程度與再灌流有時間相關性，同時表明再灌流后脊髓發(fā)生了二次損傷，脊髓微循環(huán)障礙在脊髓缺血再灌注損傷中起重要作用,是脊髓再灌注損傷過程中的重要病理學基礎?！娟P鍵詞】脊髓缺血再灌注損傷

3、血流 激光多普勒血流測定儀 組織病理學 Correlation of Histopathology Changes and Spinal Cord Blood Flow in Spinal Cord Ischemical Reperfusion Injury .Yang Xiaoyu ,ZHU Qing san ,LIU Gingchen, ,LI Yingpu，ZHAO Baollin ,YANG Xiaoyu ,LIN Ye,XING Hongjian orthopedicsdepartment of China-Japanese friendship hospital,，Jilin un

4、iversity Changchun City.130031【Abstract】 Objective: To study the correlation of histopathology changes and spinal cord blood flow after spinal cord ischemical reperfusion injury . Method Model Set-up of ischemic spinal cord injury. Occlusion of the abdominal aorta produces lumbosacral spinal cord is

5、chemia. Abdominal aorta was obstructed and opened according to events of ischemia - referfusion. Laser- Doppler flowmetry was employed to measure hemodynamic changes in the oumbal spinal cord. The lumbo-sacral cord tissue blook was rapidly dissected for the examination of histopathology and transmis

6、sion electron microscopy according to preichemia, 30 min of ischemia, 60 min of ischemia,and 2, 4, 6, 9h and 12h of reperfusion respectively. Results: The lumbar local SCBF decreased rapidly to 77.51%(p=2.01E-17), percentage changes of the mean baseline value after 30 min of ischemial. The onset of

7、reperfusion, the SCBF increased rapidly and exceeded the baseline level.The SCBF was 60.38% (p=3.3E-7) of baseline at 10 min of reperfusion. And the local blood perfusion basically recovered baseline level after 30 min of perfusion(3.7% of baseline, p=0.437899). After wards, the SCBF decreased gradu

8、ally. Up to 4h of reperfusion(-23.5% of baseline, p=1.34E-3) , the SCBF did not return to the baseline level. Conclusion 基金項目：吉林省科學自然基金項目資助 （990563-1）第一作者簡介：女（1959）教授 醫(yī)學博士后，研究方向：脊柱外科基礎 電話（0431）5649255 E-mail:yangxiaoyu 88Damage of spinal cord tissue in the hypoperfusion phase is serious than its isc

9、hemia phase , There are time correlation in the degree of pathology changes and hypoperfusion .At the same time , twice lesion of spinal cord has been occured by spinal cord hypoperfusion. Microcirculation disorder of spinal cord is important base of the pathology.【Key】 Spinal cord Ischemical reperf

10、usion injury Blood flow Laser- doppler flowmetryHistopathology 脊髓損傷(spinal cord injury SCI)一直是困擾醫(yī)學界的一大難題。臨床研究中常見到SCI 在解剖上并非完全橫斷,傷情并不嚴重,減壓后癥狀有所緩解，但以后發(fā)展為“二次癱瘓”。臨床上對于SCI 治療常見于針對缺血恢復血供,而忽視了脊髓再灌注損傷。近二年許多研究表明1-3，SCI 后動物雙后肢出 現二次癱瘓與脊髓組織延遲性低灌流密切相關, 脊髓微循環(huán)障礙在脊髓二次損傷中起著重要作用, 因而提出了脊髓存在著缺血再灌注損傷(spinal cord ischemi

11、a reperfusion injury I/R),然而,由脊髓再灌注引發(fā)的微循環(huán)障、病理生理、生化因子參與的脊髓組織進行性、自毀性破壞病理過程仍不十分清楚。因此，本文針對缺血再灌注損傷中脊髓血流量與組織病理學變化進行了動態(tài)觀察，為臨床阻遏脊髓繼發(fā)性損害提供科學實驗依據。 1. 材料和方法1.1脊髓缺血再灌注損傷模型建立：實驗動物分組:Wistar大鼠,體重180-260g,平均220g, 雌雄不限,隨機分為正常組、單純缺血組和缺血再灌組。正常組：(僅麻醉動物不進行阻斷血流量)，單純缺血組:阻斷血流30、60min。單純缺血再灌組：根據所需時間點設計缺血30min后再灌注60min、2、4、6

12、、12、24h組,每組5只鼠，總計40只鼠。1.2 手術方法: 用戊巴比妥納35mg,kg-1ip麻醉后將鼠稱重采用Zivin4法復制模型，鼠俯臥位置于特制臺上, 背部剪毛，無菌操作下，腰椎取背部正中切口，切除L2-L 4雙側椎板,充分顯露L3-L4節(jié)段硬脊膜。然后仰臥位于臺上，腹部剪毛，取腹正中切口。手術分離腹主動脈至腎動脈水平，在左腎動脈起始部遠端用Scoville-Lewis動脈夾夾閉腹主動脈，根據所需測定時間點進行阻斷血流，暫時關閉腹腔至動物蘇醒。然后再次麻醉動物，打開刀口后松夾恢復血流，重新關腹。制成脊髓缺血再灌注損傷模型，可調式加熱墊置于動物身下，室溫保持22,通風良好。1.3脊髓

13、I/R損傷血流動力學監(jiān)測 選用Peri Flux PF3激光多普勒血灌流監(jiān)測儀(Laser Doppler Perfusion Monitor),由瑞典Perimed AB公司生產(Perimed AB,Stockholm, Sweden)。技術參數為：激光二極管光源，2mW氦氖激光(He-Ne Laser),波長為 632.8um。光行探頭:PF303不銹鋼探頭( Stainless Steel Probe ,直徑為1.0mm,纖維分離(Fibre Separation) 0.25mm。一臺瑞典ALR公司(Advanced Logic Research, Inc)生產的386臺式微機(Pow

14、er Flex 20sx) 與激光多普勒Peri Flux PF3相連,通過專門的軟件程序PERISOFT進行操作,顯示并記錄波形,計算并存儲血流數據。將光纖探頭PR303用微型支架固定于L1-2脊髓節(jié)段背側硬脊膜表面上,觸而不壓,既適于動物呼吸又保持測定區(qū)域恒定。術野和探頭覆蓋1%瓊脂液(溶于0.9%生理鹽水)。被測區(qū)域為避開可視血管，距后中央溝1-2mm局部區(qū)域。血流儀增益(Gain)為1,最大上限頻率 ( Upper Frequency Limit)12Kz,即寬頻(Wide band)狀態(tài)。開機預熱30 分鐘后，先測定腰髓局部基線血流,連續(xù)記錄10-20分鐘。然后按缺血和再灌流各時間段

15、分別連續(xù)測定血流變化，顯示血流變化的LDF輸出信號被記錄并存儲在微機內的專門軟件PERISOFT程序中,確定時間區(qū)段(Event),計算平均值。1.4病理形態(tài)學觀察 將實驗組缺血前、缺血30、60min 、缺血30min再灌4、6、12、24h,分別在活體狀態(tài)下取同一節(jié)段脊髓行病理學檢查。1.4.1石蠟切片光鏡觀察實驗組大鼠用小剪刀將脊椎管擴大,切除周圍神經根, 將同一節(jié)段脊髓取出，用4%多聚甲醛固定24h 后常規(guī)石蠟切片,HE染色,光鏡觀察。1.4.2尼氏染色:緩沖亞甲蘭法新鮮組織固定于10%甲醛液，按常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，石蠟切片5m，切片脫蠟至水,蒸餾水洗,入緩沖液亞甲蘭染色內染10分鐘

16、,0.2N 醋酸鹽緩沖液(PH4.6)分化1-3分鐘,并在顯微鏡下觀察,至尼氏體清晰為止。4%鉬酸銨液處理3-5分鐘,蒸餾水洗, 常規(guī)脫水透明,中性樹膠封片,尼氏體染成鮮蘭色。隨機選取缺血前、缺血30分鐘、再灌流4 小時各組脊髓前角有核細胞各30個,應用 Luzes- F 型圖像分析系統(tǒng)(Japan),在20倍物鏡下測定尼氏體平均灰度和平均面積。1.4.3電鏡標本制備及觀察按40kgkg-1用3%戊巴比妥鈉經腹腔注射麻醉后,剪開腹腔,暴露心臟,經左心室穿刺,先用37,0.9%生理鹽水心臟灌洗,再用2.5%戊二醛進行灌洗固定。取腰髓在解剖顯微鏡下定位于脊髓前角,經1%鋨酸后固定,逐級乙醇, 丙酮

17、系列脫水,Epon812包埋,半薄切片定位,LKB 超薄切片機切片,片厚700A。經醋酸雙氧鈾-檸酸鉛雙重染色, 在日產JEM-1200EX透射電鏡下觀察并攝片。1.5 數據處理所有測定值以平均值標準差 ( mean value standard deviation, X S) 表示。 統(tǒng)計學意義通過 Microsoft Exce15.0 for windows電子表格軟件中的F 檢驗和t檢驗進行評價,P值0.05為具有顯著性差異。 2. 結果2.1脊髓I/R后脊髓血灌流量的動態(tài)變化L1-L2脊髓血灌流量(spinal cord blood perfusion, SCBP)平均基線值是301.

18、346.89 PU(表1)。缺血初始 SCBP迅速下降，單純缺血10min時，平均SCBP下降至38.9216.87PU,與基線的百分比變化為-74.37%,單純缺血30min平均下降至41.7914.44 PU,與基線的百分比變化值為-75.37(P值=2. 01,E-16)再灌流時,SCBP迅速增高超過基線水平。再灌注10min,SCBP值為426.2672.11PU,(P值=3.4E-08) 與基線的百分比變化值為35.21%,以后 SCBP 逐漸降低。再灌30min，接近基線水平(327.4270.26pu,P值=0.434,17.16%)以后持續(xù)低于基線水平,再灌注60min(243

19、.1830.27, -19.10%,P值=0.244)再灌注4小時,降至180.3230.75PU, -40.08%P值=0.1515)以后未見恢復。(見表1和圖1)Reperfusion500400300Ishaemia0 10 20 30 60 90 120 240 0 10 20 30 40圖1、鼠脊髓缺血再灌注后腰髓血流變化 表1 鼠脊髓缺血灌注后腰髓血流值 TIME SCBP(PU) % percentage of thebaseline baseline 301.346.89(30) I 10min 38.9216.87(5) -74.37% I 30min 41.7914.44(

20、5) -75.37% P 10min 426.2692.11(4)* 36.21% P 30min 327.4270.26(4) 17.16% P 50min 255.3864 (4)* -18.39% P 60min 243.1830.27(4)* -19.10% P 90min 246.0553.31(4)* -21.37% P 120min 240.9452.12(4)* -23.01% P 150min 224.1650.97(3)* -28.37% P 180min 206.4145.56(3)* -34.04% P 210min 196.0991.79(3) -37.34% P 2

21、40min 180.3230.75(3)* -40.08% P 360min 176.8861.56(3)* -43.48% P 540min 150.1132.42(3)* -52.03% P 600min 130.1132.43(3)* -58.42% P 720min 130.8941.34(3)* -58.17% 注:PU:血灌流單位,Baseline:缺血前的基線值:I:缺血; P,再灌流,括號內數為動物數(以下同)。與基線值比較:*P值0.05,* P值0.05. 2.2病理結果2.2.1光鏡檢查HE染色缺血前組:前角運動神經元無明顯變化, 缺血30min再灌注6小時,可見部分神經

22、元胞體放大,胞漿胞核著色變淺。尼氏染色缺血前組:前角運動神經元輪廓清楚,多極形, 細胞核 大多位于中央,核仁清晰可見。尼氏體呈網班狀均勻排列于核周，胞漿均勻，深染。缺血30分鐘組:前角運動神經元腫脹,圓形,胞核偏位, 核仁尚清楚。尼氏體呈細塵狀顆粒，淺染，松散，排列紊亂/或位于細胞周邊部。再灌流4小時組:前角運動神經元固縮,變小,呈三角形。胞核結構大多萎縮消失。尼氏體溶解，消失，胞漿呈空狀改變。再灌注6、12、24h小時, 隨著缺血再灌時間延長,病變有逐漸加重趨勢。應用Luzed-F型圖像分析系統(tǒng),在20倍物鏡下隨機測定30個前角細胞的尼氏體平均灰度和平均面積,結果見表2。 表2、脊髓缺血再灌

23、注損傷尼氏染色圖象分析結果（xs） Rmean gray 132.3710.91 149.4711.03* 188.5112.34* mean area 850.04111.49 922.11 97.34 588.0495.57*(mm2) * P0.01 =Normal =Ischemia =Reperfusion 缺血30分鐘組，平均灰度明顯高于缺血前組(P值= 5.88E-04),再灌流4小時組,平均灰度進一步升高，與缺血前比較P值=1.095E-16。注：灰度表示圖像各部分顏色的深淺程度，切片底色越淺，灰度值越高。缺血30分鐘組，平均面積與缺血前組沒有明顯差異(P值=0.844058)

24、。但再灌流4小時組,平均面積較血前組明顯減小(P值=2.49E-10)。 2.2.2電鏡觀察 缺血30分鐘組：可見神經元細胞基本正常，內質網排列分布雜散，局部有脫顆?，F象，游離核糖體增多，并可見突觸結構，突觸內可見突觸小泡較多，有線粒體，神經膠質細胞核基質局部變化，核異染色質趨邊，粗面內質網輕度腫脹，線粒體輕度凝聚，有髓神經纖維和髓鞘未見明顯改變。脊髓灰質內毛細血管未見明顯改變。缺血60分鐘組：神經元實質內基質高度空化，線粒體凝聚，可見板層小體，粗面內質網排列成堆擴張，游離核糖體增多，神經膠質細胞核膜局部不清晰。再灌流4小時組：核膜不清,線粒體高度腫脹，空泡化。內質網互相離散，明顯擴張，游離核

25、糖明顯減少。髓鞘板層輕度松解。再灌流6、12小時組：軸突基質空化，線粒體增多，基質集凝，神經元細胞核膜不清晰，核基質淡薄，胞質內游離核糖體增多，局部密集分布，可見空泡結構脂褐素。有髓神經纖維顯示不規(guī)則形，毛細血管核內皮異染色質凝聚趨邊，局部增厚，向腔內形成許多絨毛狀突起，基質質密。再灌流24小時組：神經軸突內線粒體凝聚, 有線粒體嵴斷裂，腫脹呈空泡狀，有髓神經纖維嚴重分離，局部凝聚。 3.0 討論 脊髓損傷(SCI)后，發(fā)生一系列缺血等病理生理改變，使脊 髓的損傷進一步加重。由于脊髓血流(Spinal cord blood flow ,SCBF)變化能較好地反應脊髓組織的病理改變。因此，有關S

26、CBF 的研究越來越受到重視。目前定量測定(SCBF)的方法很多，如常用的氫氣清除法、放射性自顯影法、微球法等5。 但由于電極直接插入脊髓內，必然要引起脊髓損傷，改變脊髓循環(huán)的生理條件。同時如氫氣清除法還要根據H2的濃度曲線來進行復雜計算脊髓血流量，必然要影響到結果的準確性。因此，本實驗選用激光多普勒血流測定法(Laser Doppler Flowmetry,LDF) 成功的建立了一個持續(xù)性監(jiān)測脊髓I/R損傷微循環(huán)血流的實驗模型。它能夠連續(xù)性、及時性、非侵襲性通過直接測定血流來反映真正的脊髓血流狀態(tài)。本實驗通過阻斷鼠腹主動脈，持續(xù)監(jiān)測L1-2節(jié)段脊髓血流。發(fā)現缺血30分鐘，血灌流量平均下降85

27、.37%，再灌流即刻血灌流量迅速升高，超過缺血前水平。再灌流10分鐘左右達到最高點，血灌流量上升36.21%。再灌流30分鐘，血灌流量基本恢復缺血前基線水平,以后逐漸降低,再灌流60分鐘左右一直保持低于基線水平，直至再灌流4小時(血灌流量下降67.62%)未見恢復。 證實了缺血30分鐘、再灌流4小時脊髓發(fā)生了進行性延遲性低灌流(Delayed hypoperfusion)。與正常對照、缺血30分鐘、再灌流4 , 6 , 9 , 12h局部脊髓光鏡病理和電鏡超微結構檢查，證實了缺血 30分鐘就已有明確的病理改變，說明了缺血缺氧本身對脊髓的損傷;而再灌流4小時以后,在恢復血供的條件下，病理改變更加

28、嚴重,揭示了脊髓存在著再灌流損傷(reperfusion injury)。本實驗觀察到局部SCBF改變與病理學檢查結果具有極好的時間相關性。缺血時，血流下降明顯，出現病理性損傷；再灌流時，出現延遲性缺血性低灌流，微循環(huán)功能不良，病理改變更加明顯，表現出了再灌流損傷，同時我們還觀察到缺血再灌后脊髓前角細胞超微結構改變要比單純缺血性損害嚴重。如單純缺血30分組與缺血30分再灌組有明顯病理學差異。隨著再灌流時間延長，脊髓前角細胞出現高度腫脹，核膜結構不清，胞質內空泡，線粒體增多凝聚，髓鞘神經纖維溶解、嚴重分離等缺血、缺氧改變。毛細血管內皮增厚基質致密空泡，有微絨毛毛狀向血管腔內突入等內皮損傷改變，均

29、證實再灌流使脊髓發(fā)生了二次損傷，并也證明這種脊髓二次損傷有某種損傷因子的共同參予并加重了再灌注損傷的病理過程，故導致了SCI后的繼發(fā)性損害。 對于再灌流后出現的延遲性低灌流的原因，目前仍不十分清楚， 有幾種解釋。有的作者認為是由于組織水腫壓迫血管致SCBF降低5。根據張屹6等脊髓I/R損傷動物模型脊髓組織水份含量的測定結果，再灌流24小時水腫較前有所減輕，認為組織水腫不是造成SCBF下降的主要原因。Kogure7等指出中樞神經缺血后代謝紊亂是通過血流降低和/或再灌流不平衡而加重，這可能與受損組織的代謝需求相關系。Senter等實驗表明損傷區(qū)局部的缺血缺氧很難通過脊髓本身的血液循環(huán)得到改善，即脊

30、髓I/R損傷很難通過恢復血供而改善所存在的繼發(fā)性損害，本實驗結果證實了這一點。 脊髓微血管內皮細胞在I/R損傷中扮演著最重要的角色，與星形膠質細胞緊密連接構成血脊髓屏障的基本結構，脊髓I/R 過程中血管內皮細胞是最先波及的部位，而該部位的變化對組織損傷及功能恢復影響巨大。因而血管內皮細胞在缺血再灌注損傷中日益受到重視，在正常情況下，內皮可分泌多種物質來調節(jié)血管張力，維持血液流動性，并調節(jié)血管內血栓形成。因此，我們認為缺血再灌流可引起大血管及微血管內皮細胞的損傷，使內皮細胞的形態(tài)和功能異常。它主要表現為微血管阻力增加，血管擴張的儲備能力的減弱，毛細血管堵塞-通常為“無復流”現象。所以本實驗總結為

31、缺血、低灌流是嚴重脊髓損傷后主要的血流變 化。而延遲性低灌流現象主要與血脊髓屏障損害、脊髓實質性微循環(huán)障礙、血管自由基化學過程改變相關。本研究同時給人另一 啟示：臨床上對脊髓缺血損傷治療上常常是針對缺血、恢復血供，往往忽視了再灌注所存在的繼發(fā)性損傷，如何克服微循環(huán)障礙，阻斷及抑制SCI缺血后繼發(fā)性功能障礙，促進脊髓功能恢復是今后脊髓損害的治療方向。本實驗觀察結論，再灌注期組織損傷較缺血期嚴重，且病理改變程度與再灌流有時間相關性，同時表明再灌流后脊髓發(fā)生了二次損傷，脊髓微循環(huán)障礙在脊髓I/R損傷中起重要作用,是脊髓I/R過程中的重要病理基礎。參考文獻1 avid C. Cassada, MDa, Jam