PKH26說明書中文

1、PKH26紅色熒光細胞連接試劑盒（普通細胞膜標記）產品編號：MINI26,MIDE26和PKH26GL室溫保存TECHNICALBULLETIN域發(fā)出的紫色、綠色、紅色和遠紅外等，不產品說明PKH26熒光細胞連接試劑盒采用擁有專利的膜標記技術，能夠將帶有較長脂質尾巴的黃色-橙色熒光染料（PKH26）結合到細胞膜脂質區(qū)域上。試劑盒中提供染色過程中所需的溶劑（稀釋液C）,該溶劑可以可以在染色過程中，增加染料溶解度和染色效率，同時維持細胞活力。稀釋液C與哺乳動物細胞等滲，且不含去垢劑或有機溶劑，也不含生理鹽水和緩沖鹽。根據細胞類型及標記后細胞膜內在的變化，標記后的細胞表面會由均一透亮變得有點狀凸起或

2、補丁狀。但在生理范圍內，PKH26熒光不受pH的影響，每個細胞的熒光強度與染料標記位置無關。PKH26熒光在黃色-橙色區(qū)域（圖一），可用來標記追蹤體內外多種細胞。在細胞毒性分析，熒光蛋白、抗體或DNA料在該區(qū)會與PKH26產生干擾。PKH2限常被用于基于染料稀釋增殖的分析的染料稀釋應用，包括建立抗原特異性前體frequecies和正?；蚰[瘤組織中靜止或緩慢干細胞或祖細胞的鑒定。同時PKH2他可用于監(jiān)測外來病毒、血小板和其他納米顆粒的攝入；干細胞分裂過程中膜的分配；細胞-細胞之間膜的轉移；細胞吞噬作用；抗原呈遞；粘附；通過間隙連接的信號傳遞；以及組織切片中的神經元遷移。由于其熒光穩(wěn)定性較強，PK

3、H2瞰用于體內細胞追蹤研究，特別是在標記的細胞的研究周期超過一周時。圖1,PKH26激發(fā)和發(fā)射光譜無Csi+,M和血清的培養(yǎng)基或者緩沖鹽（如Dulbecco'sPBS或Hank'sBSS）試劑組成*1X1Q-3M(溶于乙醇)PKH26染料*(P9691)稀釋液C(G8278)MINI261X1X1QmLMIDI262X6X1QmLPKH26GL1X6X1QmL 血清，白蛋白或其它組織兼容性蛋白離心管（4-15mL）.溫控離心機（1,QQQXg）熒光分析設備（熒光讀板機，熒光或共聚焦顯微鏡，流式細胞儀）,層流罩 血球計數板或細胞計數器載玻片和蓋玻片注意事項和免責說明MINI26試

4、劑盒推薦用于小的或初步試驗研究，PKH26G用于體內實驗研究該產品僅用于科研，不用于制藥、家庭或其它用途。請遵照安全數據清單中關于有害及安全操作規(guī)范操作。所需設備和試劑（試劑盒未提供） 充分分散的單個懸浮細胞 含血清的組織培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）儲存/穩(wěn)定性PKH26乙醇溶液（貨號P9691）可室溫或冷藏保存。減少蒸發(fā)以防止染料濃度升高。保證染料乙醇溶液瓶蓋蓋緊。該染料避光保存，使用前觀察是否有結晶。如出現結晶，37c熱水浴加熱，然后超聲或震蕩直至溶解。稀釋液C可室溫或冷藏保存。如果冷藏保存，使用前復溫至室溫（過程，步驟A5和A6）。稀釋液C為無菌溶液，不含任何防腐劑和抗生素，其需保持無菌。不要將

5、染料儲存于稀釋液C中。溶于稀釋液C的工作液需現配現用，且配好后需立即使用。操作過程A.一般細胞膜標記親脂性染料結合到細胞膜上完成標記。染色強度是染料濃度和細胞濃度的函數，上滲透性無關。因此，保證染料添加量不過量非常關鍵。過標記的細胞將會導致細胞膜完整性缺失和reducedcellrecovery。下列過程可用于體內體外細胞的標記，包括干細胞、淋巴細胞、單核細胞、內皮細胞、神經細胞或者任何其他細胞。體內細胞的標記過程需一定的改進，如血小板的染色，或者選擇性標記吞噬細胞。Generalcellmembranelabelingshouldbeperformedpriortomonoclonalant

6、ibodystaining.Themembranedyeswillremainstableduringthemonoclonalstainingat4C；however,cappingofthemonoclonalantibodiesishighlyprobableifthegeneralcellmembranelabelingiscarriedoutatambienttemperaturesubsequenttoantibodylabeling.下述染色過程中細胞濃度和染料濃度代表操作的起始濃度。該濃度被證明適用于多種細胞。使用者需通過評估染色后細胞活率（如，PI染色）、熒光強度、染色均勻度

7、及是否對所研究細胞功能有影響等，根據實驗目的，確定最優(yōu)的染料濃度和細胞濃度。注意1:PKH26染色過程中，不能存在疊氮化物或代謝毒性物。注意2:雖然貼壁細胞也可以染色，但單個懸浮細胞染色均一性更佳。因此用蛋白酶（trypsin/EDTA）將貼壁細胞消化成單個懸浮細胞后再染色效果更佳。液C重懸時，減少殘留培養(yǎng)基或緩沖液體積卜列過程最終體積為2mLPKH26濃度為卜列過程最終體積為2mLPKH26濃度為非常重要。見參考文獻9的注意28。2X10-6M細胞濃度為1xi07cells/mL以下過程均在室溫下進行（20-25C）1.將2X107個細胞于離心管中，用不含血清培養(yǎng)基洗一遍。注意：血清蛋白和脂

8、質會與染料結合，降低與細胞膜結合的染料濃度。最好在用稀釋液C重懸細胞染色前（第四步）用無血清培養(yǎng)基或緩沖液洗細胞一次（第一步）。4.加入1mL稀釋液C（CatalogNumberG8278）,用移液管輕輕吹打混勻，制備2X細胞懸液。不要用振蕩器震蕩，不要讓細胞在稀釋液C中保存太長時間。注意：生理鹽（physiologicsalts）的存在會使得染料結團并大幅降低染色效率。因此，需確保染色時細胞懸浮于稀釋液C中，不含培養(yǎng)基或緩沖鹽。2 .400Xg離心5分鐘。注意：PKH26染料不能直接加到離心沉淀中,這樣會造成細胞染色不均一和細胞活力降低。3 .離心后，小心吸棄上層清液，剩余上層細5 .臨染色

9、之前，將4dLPKH26乙醇溶液加入1mL稀釋液C中，充分混勻，配制的2X染色液（4X10-6M）o注意1:為減少乙醇對細胞活率的影響，步驟5加入的染料使得步驟6中乙醇最終濃度不能超過1-2%。注意2:如果所需染料最終濃度2X10-6M,需用100噌醇將PKH2琳釋于另一單獨的容器中，以確胞液體積不超過25科L。保實驗結果的可重復性。注意：為得到可重復的實驗結果，在用稀釋較慢，染色均一性較差。均勻。Racking和旋渦震蕩混勻同樣混勻.快速將1mL2X細胞懸液（步驟4）力口入1mL2X染色液（步驟5）中，立即用移液管混勻。最終細胞濃度為1xi07/mL,PKH26濃度為2X10-6M注意：由于

10、染色瞬間完成，快速將細胞與染料混勻對得到明亮、均勻和可重復的標記結果非常重要。下列措施有助于得到較優(yōu)的結果：a.不要將PKH26染料直接加入含2X細胞的稀釋液C中。b.將2X細胞懸液（步驟4）與2X染色液（步驟5）等體積混合。c.調整2X細胞和2X染料的濃度避免染色體積太小（100L）或太大（5mD。d.用電動移液器快速將細胞和染料混勻。血清移液管混勻速度太慢而使得染色不e.分配體積盡量準確，以保證樣品與樣品之間，實驗與實驗之間的可重復性。7 .混勻后的染色的細胞孵育1-5min。由于染色速度較快，延長孵育時間對實驗沒有幫助。注意：讓細胞在染色液中停留盡量短的時間，同時保證得到理想的染色強度。

11、因為稀釋?夜C缺少生理性鹽，過長時間的暴露在稀釋?夜C中會造成某些細胞活力降低。如果不能確定其影響程度，可增加僅作稀釋的對照組和只用乙醇而不用染料染色的對照組。8 .加入等體積的血清（2mL）或其它合適的蛋白溶液（如1%BSA終止反應，孵育1min以結合多余的染料。注意1：血清（或等效的蛋白濃度）為最優(yōu)的終止液。如果用完全培養(yǎng)基替代，添加體積為10mL注意2：不要通過加稀釋液C或離心來終止反應。注意3:不要用無血清培養(yǎng)基或緩沖鹽，他們會使染料產生聚集。染料聚集使清洗過程中無法洗凈，使得分析過程中仍存在未標記的細胞。9.將細胞在20-25C條件下400Xg離心10min，小心吸棄上清。用10mL完全培養(yǎng)基重懸，將重懸液轉移至另一新的無菌離心管中，20-25C條件下400Xg離心5min。用10mL完全培養(yǎng)基再清洗兩遍以除去沒結合的染料。注意1:將重懸液轉移至新離心管中，減少了離心管壁殘留的染料對洗滌效率的影響；注意2：不要用稀釋液C清洗。10.最后一步清洗后，用10mL完全培養(yǎng)基重懸細胞評估細胞回收率，細胞活率和熒光強度（圖2。離心重懸細胞至所需活細胞濃度。注意1:染色后的細胞可以用中性甲醛固定，注意2:染色熒光強度一般