葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖濃度.

1、生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)XXX郵箱:葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖濃度1.掌握血糖測(cè)定原理，計(jì)算方法，參考正常值，臨床意義。2.了解尿糖的測(cè)定及意義。1.收集耳緣靜脈血,制備血漿,葡萄糖氧化法比色測(cè)定血糖濃度。2.收集尿液,班氏法測(cè)定。一.實(shí)驗(yàn)要求 二.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 血糖（blood glucose,BG）指血漿（清）中的糖類物質(zhì)，主要為葡萄糖。一.血糖的來(lái)源：食物、糖原的分解、糖異生。二. 血糖的去路：有氧氧化、轉(zhuǎn)換成非糖物質(zhì)、尿排出、糖酵解。血糖血糖1.正常血糖濃度: 3.9-6.1 mmol/L(成年人空腹) 低血糖: 低于 2.8 mmol/L 高血糖: 超過(guò) 7.8 mmol/L2. 低血糖的因

2、素：胰島素、磺脲類藥、飲酒、嚴(yán)重饑餓 高血糖的因素：進(jìn)食、情緒緊張時(shí)、糖尿病.3. 糖尿病的診斷和治療監(jiān)視、新生兒低血糖癥等.腎上腺素由腎上腺髓質(zhì)分泌的一種兒茶酚胺激素。腎上腺素升高血糖機(jī)制：腎上腺素升高血糖機(jī)制：在應(yīng)激狀態(tài)、內(nèi)臟神經(jīng)刺激和低血糖等情況下，腎上腺素被釋放入血液循環(huán)，促進(jìn)糖原分解并升高血糖，促進(jìn)脂肪分解，促進(jìn)非糖物質(zhì)向血糖的轉(zhuǎn)化，使血糖濃度增大。 腎上腺素腎上腺素adrenaline;epinephrine 一、血糖測(cè)定一、血糖測(cè)定福林-酚試劑法葡萄糖氧化酶法 鄰甲苯胺法葡萄糖氧化酶法原理葡萄糖氧化酶法原理葡萄糖葡萄糖O2H2O葡萄糖酸葡萄糖酸H2O2葡萄糖氧化酶（葡萄糖氧化酶（

3、GOD）氧化，37oCH2O2 苯酚苯酚 4-氨基安替吡啉氨基安替吡啉H2O 紅色紅色醌亞胺 + + O237oC 辣根過(guò)氧化物酶（辣根過(guò)氧化物酶（POD）Trinder反應(yīng)反應(yīng)溶液在505nm下有吸收峰,可用比色法測(cè)定,得出葡萄糖的濃度。標(biāo)準(zhǔn)濃度法A標(biāo)=KC標(biāo)LA樣=KC樣L C樣=A樣A標(biāo) C標(biāo)【試劑】 酶酚混合試劑（PH7.0） 5mmol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 班氏試劑【器材】試管、試管架、吸量管、移液槍、恒溫水浴、722型分光光度計(jì)。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備【標(biāo)本】1.血漿 應(yīng)在血液采集1小時(shí)內(nèi)盡早分離。 具體操作具體操作（1）稱重；（2）取血： 找到耳緣靜脈，二甲苯擦拭，涂薄層凡士林（有

4、何作用）。用三棱針刺破耳緣靜脈放血(自然血流)，將血液收集于草酸鈉抗凝管內(nèi)（邊接邊搖,以防凝固），取約5ml 。離心，2000rpm，10min，取上清，編號(hào)；（3）注射激素后再取血:皮下注射腎上腺素(0.4mg/kg體重)， 記錄在注射時(shí)間。 30min后取血5ml于抗凝管內(nèi), 離心，2000rpm，10min，取上清，編號(hào)。（4）取4支試管，按下表加入試劑:標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)(ml)正常正常 (ml)注射后注射后(ml)空白空白(ml)血清樣品血清樣品葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液蒸餾水蒸餾水酶酚混合試劑酶酚混合試劑0.023.000.023.000.023.000.023.00 將各管充分混勻，37 水

5、浴中保溫15min；取出冷卻至室溫后，505nm處比色；以空白管調(diào)零，讀取標(biāo)準(zhǔn)管及測(cè)定管光密度值。計(jì)算： 測(cè)定管測(cè)定管葡萄糖含量葡萄糖含量（mmol/L）測(cè)定管光密度測(cè)定管光密度 標(biāo)準(zhǔn)管光密度標(biāo)準(zhǔn)管光密度51.注射前后的血糖濃度2. 注射后血糖濃度增高率A A腎腎-A-A正正 A A正正 100%增高率增高率 =結(jié)果記錄結(jié)果記錄標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)(ml)正常正常 (ml)注射激素后注射激素后(ml)空白空白(ml)A血糖濃度增高率尿糖是指尿中的糖類，主要是指尿中的葡萄糖。正常情況下，腎小管能將腎小球?yàn)V過(guò)的葡萄糖全部重吸收回血液，當(dāng)血糖腎糖閾8.96-10.08mmol/L,超過(guò)腎小管的重吸收能力,部分葡

6、萄糖隨尿排出。尿糖的測(cè)定雖然不能單純作為糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但是從某種層面上也能反映一些問(wèn)題。血血漿漿尿糖尿糖尿糖尿糖動(dòng)脈血血細(xì)胞、大分子蛋白質(zhì)等部分水、無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖、維生素、尿素等重吸收近端小管二、二、二、1.班氏定性試驗(yàn)：2.葡萄糖氧化酶試紙法（干化學(xué)法）：反應(yīng)原理同血糖葡萄糖氧化酶法。尿糖測(cè)定尿糖測(cè)定班氏定性試驗(yàn)原理：班氏定性試驗(yàn)原理：利用葡萄糖或其它還原性物質(zhì)在堿性高溫環(huán)境中，將反應(yīng)液中Cu2+還原為亞銅離子Cu+，形成黃色的氫氧化亞銅或紅色的氧化亞銅。根據(jù)顯色的程度，可對(duì)尿葡萄糖作定性及半定量檢測(cè)。(CHOH)(CHOH)n nCHOCHOCHCH2 2OHOH+ + 2Cu2Cu2

7、+2+ + 4OH4OH- -COOHCOOH(CHOH)(CHOH)n nCHCH2 2OHOH+ +2CuOH+ +H H2 2O O2CuOHH H2 2O O+ +CuCu2 2O O醛糖醛糖醛糖酸醛糖酸黃色或紅色黃色或紅色 操作步驟20滴班氏劑A尿液2滴 B尿液2滴煮沸5min煮沸5min葡萄糖含量葡萄糖含量(g/L)試管變化試管變化結(jié)果符號(hào)結(jié)果符號(hào)無(wú)糖試劑仍清晰呈藍(lán)色，如有多量尿酸存在也可能少許藍(lán)灰色沉淀微量0.5以下僅冷卻后有少量綠色沉淀+少量0.51煮沸約1min后，出現(xiàn)少量黃綠色沉淀+中等量12煮沸約15s，即呈土黃色沉淀+多量2以上開始煮時(shí)，即呈多量紅棕色沉淀 +【注意事項(xiàng)

8、】1.操作到位，取量要準(zhǔn)確，吸量管不能混用。2.血清分離后要及時(shí)的測(cè)定以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3.試劑中含疊氮鈉（0.95 g/L）為防腐劑。不可入口！避免接觸皮膚及粘膜。 應(yīng)采取必要的預(yù)防措施使用試劑。結(jié)果分析三.測(cè)定的血糖濃度異常：反應(yīng)不徹底引起的（偏低）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度有問(wèn)題（偏高或偏低）移液器引起的（偏高或偏低）一.結(jié)果可報(bào)告范圍：本法對(duì)葡萄糖的檢測(cè)范圍為0.0622.2 mmol/L。當(dāng)樣品測(cè)定值超過(guò)上限時(shí)，應(yīng)將樣品用9 g/L氯化鈉溶液作1+ 4稀釋，重新測(cè)定，結(jié)果乘以5。二.當(dāng)樣品中抗壞血酸濃度 852 mol/L，膽紅素濃度 684 mol/L，血紅蛋白濃度 2.00 g/L，甘油三酯濃度 22.6 mmol/L時(shí)沒(méi)有觀察到干擾。本法測(cè)定葡萄糖非常特異，從原理反應(yīng)式中可知第一步是特異反應(yīng)，第二步特異性較差。誤差往往發(fā)生在反應(yīng)的第二步。一些還原性物質(zhì)如尿酸、維生素C、膽紅素和谷胱甘肽等，可與色原性物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)過(guò)氧化氫，從而消耗反應(yīng)過(guò)程中所產(chǎn)生的過(guò)氧化氫，產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，使測(cè)定結(jié)果偏低。（1）葡萄糖）葡萄糖O2H2O葡萄糖酸葡萄糖酸H2O2（2）H2O24-氨基安替吡啉苯酚氨基安替吡啉苯酚H2O 紅色醌式物質(zhì)紅色醌式物質(zhì)過(guò)氧化物酶過(guò)氧化物酶（POD）Trinder反反應(yīng)應(yīng)【討論】【思考題】【思考題】1