熒光顯微鏡的使用與顯微攝影.

1、 七、熒光顯微鏡的使用七、熒光顯微鏡的使用1 1、原理：用人眼不可見的一定波長的紫外光作光、原理：用人眼不可見的一定波長的紫外光作光源照射被檢物體，使之受激發(fā)后而產(chǎn)生人眼可見的源照射被檢物體，使之受激發(fā)后而產(chǎn)生人眼可見的熒光，然后再經(jīng)顯微鏡成象系統(tǒng)放大來進行檢測。熒光，然后再經(jīng)顯微鏡成象系統(tǒng)放大來進行檢測。引起熒光最有效的光波區(qū)域為：引起熒光最有效的光波區(qū)域為：0.320.320.400.402 2、熒光顯微鏡的裝置、熒光顯微鏡的裝置A A、可以提供特定波長的光源裝置，使被檢物體得可以提供特定波長的光源裝置，使被檢物體得到理想的激發(fā)發(fā)出強的熒光。到理想的激發(fā)發(fā)出強的熒光。B B、可以吸收或反射

2、短波光的一系列濾光片?？梢晕栈蚍瓷涠滩ü獾囊幌盗袨V光片。八、倒置顯微鏡八、倒置顯微鏡九、顯微攝影九、顯微攝影1 1、按不同類型顯微鏡的調(diào)節(jié)方式，對拍攝部位初、按不同類型顯微鏡的調(diào)節(jié)方式，對拍攝部位初步對焦。步對焦。2 2、視場光闌內(nèi)切。、視場光闌內(nèi)切。3 3、選擇光路（包括顯微鏡的與取景器旁的）、選擇光路（包括顯微鏡的與取景器旁的）4 4、安裝膠卷、安裝膠卷5 5、設(shè)置自動曝光裝置、設(shè)置自動曝光裝置6 6、彩色照像要調(diào)色溫，調(diào)電壓或用濾光片、彩色照像要調(diào)色溫，調(diào)電壓或用濾光片7 7、屈光度調(diào)節(jié)、屈光度調(diào)節(jié)8 8、按曝光按鈕、按曝光按鈕9 9、取出膠卷、取出膠卷生物電子顯微鏡技術(shù)生物電子顯微鏡

3、技術(shù) 第一節(jié)第一節(jié) 透射電子顯微鏡技術(shù)透射電子顯微鏡技術(shù)一、顯微鏡的分辨率與放大倍數(shù)一、顯微鏡的分辨率與放大倍數(shù)分辨率：分辨率： d = 0.61 / d = 0.61 / sin sin 電子的波長：電子的波長： = h / = h / mvmv h h 普朗常數(shù)普朗常數(shù) , 6.62, 6.621010-27 -27 爾格爾格 / / 秒秒 m m 電子質(zhì)量電子質(zhì)量 , 9.1, 9.11010-28-28 克克 v v 電子運動速度電子運動速度根據(jù)能量守恒定理：根據(jù)能量守恒定理： 1/2mv1/2mv2 2 = = eUeU e e 電子電量電子電量 , 4.8, 4.81010-10-

4、10 靜電單位靜電單位 U U 電壓電壓 電子顯微鏡的電壓電子顯微鏡的電壓5050100100千伏。千伏。電子波長為電子波長為0.0530.0530.0070.007。最佳孔徑角為最佳孔徑角為1010-2-21010-3-3弧度?；《?。電鏡的最高分辨率可達電鏡的最高分辨率可達2 23 3。有效放大倍數(shù)可達有效放大倍數(shù)可達100100萬倍。萬倍。 12.2512.25 = ( = () ) U U 入射電子入射電子直接透射電子直接透射電子小角度彈性碰撞電子小角度彈性碰撞電子大角度彈性碰撞電子大角度彈性碰撞電子小角度非彈性碰撞電子小角度非彈性碰撞電子背散射電子背散射電子俄歇電子俄歇電子二次電子二次

5、電子陰極發(fā)光陰極發(fā)光X X射線射線掃描電鏡掃描電鏡透射電鏡透射電鏡 1 1、 電子與樣品作用后產(chǎn)生的信息電子與樣品作用后產(chǎn)生的信息X X射線能射線能譜分析譜分析二、電子成像原理二、電子成像原理樣品樣品2 2、樣品的成像、樣品的成像 樣品中質(zhì)量密度小的區(qū)域，電子直接透射，形樣品中質(zhì)量密度小的區(qū)域，電子直接透射，形成亮區(qū)。成亮區(qū)。 樣品中質(zhì)量密度大的區(qū)域，由于電子散射，形樣品中質(zhì)量密度大的區(qū)域，由于電子散射，形成暗區(qū)。成暗區(qū)。 3 3、電磁透鏡的放大作用、電磁透鏡的放大作用 電子顯微鏡的透鏡：電子的外加磁場。電子顯微鏡的透鏡：電子的外加磁場。磁透鏡使電子會聚的原理磁透鏡使電子會聚的原理O OOOz

6、 z電子在磁透鏡中的運動軌跡電子在磁透鏡中的運動軌跡A AC C 所有從所有從O O點出發(fā)的電子類似的軌跡運動，在點出發(fā)的電子類似的軌跡運動，在v v一定時，當軌一定時，當軌跡與軸的角度很小時，電子會聚在跡與軸的角度很小時，電子會聚在OO點（點（O O）的象。的象。O象物Oba平行光軸電子束經(jīng)透鏡成象平行光軸電子束經(jīng)透鏡成象a - b a - b 為磁場作用區(qū)域。為磁場作用區(qū)域。三、電鏡的像差三、電鏡的像差 1 1、球差、球差 球差是由于電子透鏡的中心區(qū)域和邊沿區(qū)域?qū)﹄娮拥那虿钍怯捎陔娮油哥R的中心區(qū)域和邊沿區(qū)域?qū)﹄娮拥臅勰芰Σ煌斐傻?。遠軸的電子通過透鏡時折射得會聚能力不同而造成的。遠軸的

7、電子通過透鏡時折射得比近軸電子要厲害的多，以致兩者不交在一點上，結(jié)果比近軸電子要厲害的多，以致兩者不交在一點上，結(jié)果在象平面成了一個滿散圓斑在象平面成了一個滿散圓斑2 2、衍射差、衍射差 電子通過光闌發(fā)生衍射。增大孔徑角可以減小衍電子通過光闌發(fā)生衍射。增大孔徑角可以減小衍射差。射差。 最佳孔徑角為最佳孔徑角為1010-2-21010-3-3弧度?；《取P象象PP透鏡透鏡物物P P光軸光軸球差球差3 3、色差、色差 入射電子的速度不同，未能會聚于一點。入射電子的速度不同，未能會聚于一點。電子的電子的能量不同，從而波長不一造成的，電子透鏡的焦距隨著能量不同，從而波長不一造成的，電子透鏡的焦距隨著

8、電子能量而改變，因此，能量不同的電子束將沿不同的電子能量而改變，因此，能量不同的電子束將沿不同的軌跡運動。軌跡運動。能量為能量為E E的的電子軌跡電子軌跡象象1 1透鏡透鏡物物P P光軸光軸色差色差能量為能量為E- EE- E的的電子軌跡電子軌跡象象2 2AMAfMrAAfr Af4 4、象散、象散 磁場不對稱時，就出現(xiàn)象散。磁場不對稱時，就出現(xiàn)象散。 圓形物點的象就變成了橢圓形的漫散圓斑圓形物點的象就變成了橢圓形的漫散圓斑 消像散器可減弱。消像散器可減弱。平面平面B BP PA A透鏡平面透鏡平面物物P P光軸光軸P PB Bf fA A 平面平面A A象散象散 四、透射電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)四、

9、透射電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)電子光學(xué)系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、供電系統(tǒng)電子光學(xué)系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、供電系統(tǒng)電子光學(xué)系統(tǒng)電子光學(xué)系統(tǒng)照明系統(tǒng)照明系統(tǒng)成像系統(tǒng)成像系統(tǒng)觀察記錄系統(tǒng)觀察記錄系統(tǒng)電子槍電子槍聚光鏡聚光鏡 樣品室樣品室物鏡物鏡第一中間鏡第一中間鏡第二中間鏡第二中間鏡投影鏡投影鏡 觀察室觀察室照相艙照相艙 自動曝光裝置自動曝光裝置（一）電子光學(xué)系統(tǒng)（一）電子光學(xué)系統(tǒng) 1 1、照明系統(tǒng)、照明系統(tǒng) a a、電子槍電子槍 陰極、陽極、柵極陰極、陽極、柵極陰極：陰極：0.1mm0.1mm粗的鎢絲，粗的鎢絲，v v型，型，2,2272,227C C時，產(chǎn)生電子發(fā)射。時，產(chǎn)生電子發(fā)射。 陽極：相對于陰極有陽極：相對于陰極有

10、5050100100千伏的正電位差，加速電子流。千伏的正電位差，加速電子流。 柵極：相對于陰極有柵極：相對于陰極有100 100 500 500伏的負電位。調(diào)節(jié)到達陽極伏的負電位。調(diào)節(jié)到達陽極的電子量，并使電子束會聚一點。的電子量，并使電子束會聚一點。 陰極陰極陽極陽極柵極柵極 b b、聚光鏡聚光鏡 兩個電磁透鏡兩個電磁透鏡 聚光鏡的作用是將電子束會聚在樣品上，控制照明束聚光鏡的作用是將電子束會聚在樣品上，控制照明束斑的大小及孔徑角。斑的大小及孔徑角。 2 2、成像與放大系統(tǒng)、成像與放大系統(tǒng) a a、樣品室樣品室 插入支持銅網(wǎng)的樣品臂。插入支持銅網(wǎng)的樣品臂。b b、物鏡物鏡 短焦距的強磁透鏡，

11、安裝了光闌和消像散器，短焦距的強磁透鏡，安裝了光闌和消像散器，決定分辨率。首次成像，放大決定分辨率。首次成像，放大100100c c、中間鏡及投影鏡中間鏡及投影鏡中間鏡：弱透鏡，放大中間鏡：弱透鏡，放大20X20X，用用來調(diào)節(jié)放大倍數(shù)。中間鏡越多放來調(diào)節(jié)放大倍數(shù)。中間鏡越多放大倍數(shù)越大。大倍數(shù)越大。透射電鏡成像的三級放大透射電鏡成像的三級放大投影鏡：高倍放大透鏡，放大投影鏡：高倍放大透鏡，放大100X 100X ，越復(fù)雜的電鏡投影鏡，越復(fù)雜的電鏡投影鏡越多。越多。3 3 、觀察記錄系統(tǒng)、觀察記錄系統(tǒng) a a、觀察室觀察室 觀察室前方擋紫外線的鉛玻璃，用于肉眼觀察。觀察室前方擋紫外線的鉛玻璃，用

12、于肉眼觀察。 底面是熒光屏，投射鏡產(chǎn)生的最終放大像形成在底面是熒光屏，投射鏡產(chǎn)生的最終放大像形成在熒光屏上。熒光屏上。 b b、照相艙照相艙 在觀察室下面，裝有底片。在觀察室下面，裝有底片。1 1、高壓電線、高壓電線2 2、電子槍室、電子槍室3 3、第一聚光鏡、第一聚光鏡4 4、第二聚光鏡、第二聚光鏡5 5、光闌、光闌6 6、樣品臂、樣品臂7 7、物鏡、物鏡8 8、第一中間鏡、第一中間鏡9 9、第二中間鏡、第二中間鏡1010、投影鏡、投影鏡1111、觀察窗、觀察窗1212、觀察室、觀察室1313、熒光板、熒光板1414、底片盒、底片盒照明系統(tǒng)照明系統(tǒng)放大系統(tǒng)放大系統(tǒng)觀察記錄系統(tǒng)觀察記錄系統(tǒng)(

13、(二二) )真空系統(tǒng)真空系統(tǒng) 真空泵（機械泵）真空泵（機械泵） 油擴散泵油擴散泵 真空系統(tǒng)真空系統(tǒng) 管道及自動伐門管道及自動伐門 預(yù)抽室、空氣干燥器預(yù)抽室、空氣干燥器 真空檢測系統(tǒng)真空檢測系統(tǒng) ( (三三) )電源系統(tǒng)電源系統(tǒng) 高壓電源高壓電源 電源系統(tǒng)電源系統(tǒng) 透鏡電源透鏡電源 附屬電源附屬電源光源光源中間象中間象物鏡物鏡樣品樣品聚光鏡聚光鏡目鏡目鏡電子槍電子槍聚光鏡聚光鏡樣品樣品物鏡物鏡中間象中間象投影鏡投影鏡觀察屏觀察屏照相底板照相底板虛象虛象三、透射電鏡的樣品制作（一）超薄切片法主要步驟：主要步驟： 取材取材 固定固定 洗滌洗滌 脫水脫水 浸透浸透 包埋包埋 聚合聚合 修塊修塊 切片切

14、片 裝網(wǎng)裝網(wǎng) 電子染色電子染色 上鏡觀察上鏡觀察1 1、取材取材 1mm1mm3 3（或（或mmmm2 2） 活體取材，低溫，活體取材，低溫，4 4C C。 刀片鋒利，動作輕巧迅速。刀片鋒利，動作輕巧迅速。2 2、固定固定 電鏡常用固定劑：電鏡常用固定劑： 戊二醛、鋨酸戊二醛、鋨酸 固定方法：固定方法： 戊二醛戊二醛鋨酸雙固定鋨酸雙固定前固定前固定 2.5%2.5%戊二醛溶液，戊二醛溶液，4 4C C，1 14 4小時。小時。 洗滌洗滌 0.2M0.2M磷酸緩沖液，磷酸緩沖液，pH 7.4pH 7.4，5 5 6 6次，每次次，每次1010分鐘。分鐘。后固定后固定 1%1%的鋨酸溶液，的鋨酸溶

15、液， 4 4C C，1 1小時。小時。 洗滌洗滌 0.2M0.2M磷酸緩沖液，磷酸緩沖液，pH 7.4pH 7.4，3 3 4 4次，每次次，每次1010分鐘。分鐘。 c、注意事項注意事項 溫度溫度 在低溫下進行，在低溫下進行，4C。時間時間 與固定液的濃度、種類有關(guān)。不可隨意更改。與固定液的濃度、種類有關(guān)。不可隨意更改。 固定液的固定液的pH 接近組織的接近組織的pH。 固定液的濃度固定液的濃度 濃度過低，會發(fā)生組織腫脹、抽提；濃度過低，會發(fā)生組織腫脹、抽提； 濃度過高，組織收縮或遭破壞。濃度過高，組織收縮或遭破壞。 固定液的滲透壓固定液的滲透壓 應(yīng)該接近組織液的滲透壓。應(yīng)該接近組織液的滲透

16、壓。3 3、脫水脫水 一定濃度的酒精或丙酮系列一定濃度的酒精或丙酮系列 30% 50% 70% 30% 50% 70% 80% 90% 95% 100%80% 90% 95% 100%（2-32-3次），每步次），每步5 51515分鐘。分鐘。注意：注意： a a、70%70%脫水劑以上各步都在低溫（脫水劑以上各步都在低溫（4 4C C）下進行。下進行。b b、樣品只有在樣品只有在70%70%脫水劑，脫水劑，4 4C C可以存放過夜。可以存放過夜。 c c、脫水要徹底。脫水要徹底。4 4、浸透浸透 包埋劑成分：包埋劑成分： 樹脂單體（環(huán)氧樹脂樹脂單體（環(huán)氧樹脂618#618#、Epon812E

17、pon812等）、固化劑、增塑等）、固化劑、增塑劑及加速劑。劑及加速劑。注意事項：注意事項： 浸透要充分；包埋劑配制時要混勻各種成分；用具要干燥，浸透要充分；包埋劑配制時要混勻各種成分；用具要干燥，防止包埋劑吸潮。防止包埋劑吸潮。浸透過程：浸透過程： 無水丙酮無水丙酮 無水丙酮無水丙酮+1/2+1/2包埋劑（包埋劑（4 4小時）小時） 純包埋劑（過夜）。純包埋劑（過夜）。5 5、包埋與聚合包埋與聚合 包埋模包埋，加溫聚合。包埋模包埋，加溫聚合。 注意：防止產(chǎn)生氣泡；包埋后要干燥，防止吸潮。注意：防止產(chǎn)生氣泡；包埋后要干燥，防止吸潮。6 6、修塊修塊 注意事項：注意事項： 盡量削去樣品周圍的空白

18、介質(zhì)，頂面呈梯形或方形，盡量削去樣品周圍的空白介質(zhì)，頂面呈梯形或方形，大小大小1mm1mm。 梯形或方形的上下兩邊平行。梯形或方形的上下兩邊平行。7 7、切片切片 切片刀有鉆石刀和玻璃刀。切片刀有鉆石刀和玻璃刀。 注意事項：切片刀要鋒利，否則切片上會出現(xiàn)劃痕。注意事項：切片刀要鋒利，否則切片上會出現(xiàn)劃痕。 切片厚度切片厚度50050010001000，面積面積1mm1mm以下。以下。 切片連成帶浮在水面上。切片連成帶浮在水面上。8 8、裝網(wǎng)裝網(wǎng) 載網(wǎng)的類型：載網(wǎng)的類型：FormvarFormvar 膜的制備：膜的制備：配制配制0.3% 0.3% FormvarFormvar（聚乙烯醇縮甲醛）的

19、二氯乙烷（或聚乙烯醇縮甲醛）的二氯乙烷（或氯仿）溶液。氯仿）溶液。 切片用帶膜的銅網(wǎng)撈取，在顯微鏡下進行。切片用帶膜的銅網(wǎng)撈取，在顯微鏡下進行。 9 9、電子染色電子染色 醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛染色。醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛染色。1010、上鏡觀察上鏡觀察（二）負染色技術(shù)（二）負染色技術(shù) 所謂負染色，負染色技術(shù)又稱為陰性染色術(shù)。所謂負染色，負染色技術(shù)又稱為陰性染色術(shù)。是指通過重金屬鹽是指通過重金屬鹽 在樣品四周的堆積而加強樣在樣品四周的堆積而加強樣品外周品外周 的電子密度，使樣品顯示負的反差，的電子密度，使樣品顯示負的反差， 襯襯托出樣品的形態(tài)和大小。托出樣品的形態(tài)和大小。 磷鎢酸滴染磷鎢酸滴染 第

20、二節(jié)第二節(jié) 掃描電子顯微鏡技術(shù)掃描電子顯微鏡技術(shù)一、掃描電鏡的結(jié)構(gòu)一、掃描電鏡的結(jié)構(gòu)電子光學(xué)系統(tǒng)電子光學(xué)系統(tǒng) 信號的收集轉(zhuǎn)換系統(tǒng)信號的收集轉(zhuǎn)換系統(tǒng)信號的顯示與記錄系統(tǒng)。信號的顯示與記錄系統(tǒng)。真空和供電系統(tǒng)真空和供電系統(tǒng)電子槍電子槍 電磁透鏡電磁透鏡 掃描線圈掃描線圈 樣品樣品 入射電子入射電子直接透射電子直接透射電子小角度彈性碰撞電子小角度彈性碰撞電子大角度彈性碰撞電子大角度彈性碰撞電子小角度非彈性碰撞電子小角度非彈性碰撞電子背散射電子背散射電子俄歇電子俄歇電子二次電子二次電子陰極發(fā)光陰極發(fā)光X X射線射線掃描電鏡掃描電鏡透射電鏡透射電鏡 電子與樣品作用后產(chǎn)生的信息電子與樣品作用后產(chǎn)生的信息X X射線能射線能譜分析譜分析（一）電子光學(xué)系統(tǒng)（一）電子光學(xué)系統(tǒng) 1 1、電子槍、