紫外分光光度法操作規(guī)程

1、文件名稱紫外分光光度法操作規(guī)程第6頁，共6頁文件編碼BPZK3-SOP.F028版本號00紫外分光光度法操作規(guī)程文件編碼BPZK3-SOP.F028版 本 號00代替文件紫外-可見分光光度法工作標準代替文件編碼BPSOS02.069-00部門職務簽名日期起草人QC室QC人員審核人QC室主管審核人QA室QA人員審核人QA室主管格式審核QA室文件管理員批準人質量部經理頒發(fā)部門質量部生效日期分發(fā)份數Copy 分發(fā)部門質量部QC室1 目的規(guī)范紫外分光光度法操作規(guī)程，確保紫外分光光度法操作規(guī)范化、科學化。2 范圍適用于藥品及藥品生產用原輔料及其他物質的紫外-可見分光光度法分析。3 職責3.1檢驗員：負責

2、按本規(guī)程進行樣品的紫外-可見分光光度法分析。3.2 QC主管、質量部經理：負責監(jiān)督。4 內容4.1原理 紫外-可見分光光度法是通過被測物質在紫外-可見光區(qū)的特定波長處或一定波長范圍內光的吸收度，對該物質進行定性和定量分析的方法。本法在藥品檢驗中主要用于藥品的鑒別、檢查和含量測定。 定量分析通常選擇物質的最大吸收波長處測出吸收度，然后用對照品或百分吸收系數求算出被測物質的含量，多用于制劑的含量測定；對已知物質定性可用吸收峰波長或吸收度比值作為鑒別方法；若化合物本身在紫外-可見區(qū)無吸收，而雜質在紫外區(qū)有相當強度的吸收，或雜質的吸收峰處無吸收，則可用本法作雜質檢查。 物質對紫外輻射的吸收是由于分子中

3、原子的外層電子躍遷所產生的，因此，紫外吸收主要決定于分子的電子結構，故紫外光譜又稱電子光譜。有機化合物分子結構中如含有共軛體系、芳香環(huán)或發(fā)色基因，均可在近紫外區(qū)（200400nm）或可見光區(qū)（400850nm）產生吸收。通常使用的紫外分光光度計的工作波長范圍為190900nm，因此又稱為紫外-可見光光度計。 紫外吸收光譜為物質對紫外區(qū)輻射的能量吸收區(qū)。朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律為光的吸收定律，它是紫外分光光度法定量的依據，其數學表達式為： Alg=ECL式中 A吸收度； T透光率； E吸收系數； C溶液濃度； L光路長度。 如溶液的濃度（C）為1%（g/ml），光路長度（L）為

4、1cm，相應的吸收系數為百分吸收系數，以E1cm1%表示。如溶液的濃度（C）為摩爾濃度（mol/L），光路長度為1cm時，則相應有吸收系數為摩爾吸收系數，以表示。 4.2儀器 紫外分光光度計主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、記錄儀、顯示系統(tǒng)和數據處理系統(tǒng)等部分組成。4.3紫外分光光度計的校正和檢定4.3.1儀器波長的檢定4.3.1.1 用低壓汞燈檢定關閉儀器光源，將汞燈直接對準進光狹縫，如為雙光束儀器，用單光束能量測定方式，采用波長掃描方式，掃描速度“慢”（如15nm/min）、響應“快”、最小狹縫寬度（如0.1nm）、量程0-100%，在200-800nm范圍內單方向重復掃描3次，由儀器識

5、別記錄各峰值（若儀器無“峰檢測”功能，必要時可對指定波長進行“單峰”掃描）。如為但光束儀器，具體操作按儀器說明書進行。用于檢定紫外-可見分光光度計的汞燈譜線波長：237.83、253.65、275.28、296.73、302.15、313.16、334.15、365.02、365.48、366.33、404.66（紫色）、435.83（藍色）、546.07（綠色）、576.96（黃色）及579.07nm。4.3.1.2 用儀器固有的氘燈檢定本法主要用于日常工作中波長準確度的核對。取單光束能量測定方式，測定條件同上述低壓汞燈的方法，對486.02nm及656.10nm二單峰進行單方向重復掃描3次

6、。4.3.1.3 用氧化鈥玻璃檢定將氧化鈥玻璃放入樣品光路，參比光路為空氣，按測定吸收光譜圖方法測定。校正自動記錄儀器時，應考慮記錄儀的時間常數，測定樣品與校正時取同一掃描速度。氧化鈥玻璃在279.4、287.5、333.7、360.9、418.7、460.0、484.5、536.2及637.5nm波長處有尖銳的吸收峰，可供波長檢定。氧化鈥玻璃因制造的原因，每片氧化鈥的吸收波長有差異，另外，在放置過程中也會發(fā)生波長漂移，因此需要定期由計量部門校驗。4.3.1.4用高氯酸鈥溶液檢定本法可供沒有單光束測定功能的雙光束紫外分光光度計波長準確度檢定用。使用高氯酸鈥溶液校正雙光束儀器，以10%高氯酸溶液

7、為溶劑，配制含氧化鈥（HO2O3）4%的溶液，該溶液的吸收峰波長為241.13nm，278.10nm，287.18nm，333.44nm，345.47nm，361.31nm，416.28nm，451.30nm，485.29nm，536.64nm和640.52nm。如果是雙光束掃描儀器，但不是數據貯存型的，記錄的波長可能因記錄筆滯后而非真實波長，為了準確測定，建議采用定點檢定而不同掃描方式。4.3.1.5儀器波長的允許誤差為：紫外光區(qū)1nm，500nm附近2nm。4.3.1.6 可采用以上檢定方法中的一種方法進行波長檢定，我公司目前主要采用高氯酸鈥溶液檢定波長，每次檢定后填寫紫外分光光度計校準記

8、錄(BPZK4-TR.109)。4.3.2 吸收度的準確度可用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定。精密稱取在120干燥至恒重的基準重鉻酸鉀約60mg，精密稱定，用0.005mol/L硫酸液溶解并稀釋至1000ml，以硫酸液（0.005mol/L）為空白，在235nm，257nm，313nm，350nm分別測定并計算其吸收系數，并與規(guī)定的吸收系數比較，應符合下表的規(guī)定。波長，nm235（最小）257（最大）313（最?。?50（最大）吸收系數（）的規(guī)定值124.5144.048.62106.6吸收系數（）的許可范圍123.0126.0142.8146.247.050.3105.5108.54.3.3雜散光的

9、檢查按下表所列的試劑和濃度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，規(guī)定的波長處測定透光率，應符合下表的規(guī)定。試劑濃度/%(g/ml)測定用波長/nm透光率/%碘化鈉1.002200.8亞硝酸鈉5.003400.84.3.4 對溶劑的要求測定供試品前，應先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長附近是否符合要求；即用1cm石英吸收池盛溶劑，以空氣為空白（即空白光路中不置任何物質）測定其吸收度，溶劑和吸收池的吸收度，在220nm240nm范圍內不得超過0.40；在241nm250nm范圍內不得超過0.20；在251nm300nm范圍內不得超過0.10；在300nm以上時不得超過0.05。4.4 測定方法4.

10、4.1通用操作方法：測定時，除另有規(guī)定外，應以配制供試品溶液的同批溶劑為空白對照，采用1cm的石英吸收池，在規(guī)定的吸收峰波長2nm以內測試幾個點的吸收度，以核對供試品的吸收峰波長位置是否正確，除另有規(guī)定外，吸收峰波長應在該品種項下規(guī)定的波長1nm以內；否則應考慮該試樣的真?zhèn)?、純度以及儀器波長的準確度，并以吸收度最大的波工作為測定波長。一般供試品溶液的吸收度讀數，以在0.30.7之間的誤差較小。儀器的狹縫波帶寬度應小于供試品吸收帶的半寬度，否則測得的吸收度會偏低；狹縫寬度的選擇，應以減小狹縫寬度時供試品的吸收度不再增加為準，由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測定供試品的吸收度后應減去空白讀

11、數，再計算含量。當溶液的pH值對測定結果有影響時，應將供試品溶液和對照品溶液的pH值調成一致。4.4.2 吸收系數測定（性狀項下）按各品種項下規(guī)定的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長處測定其吸光度，并計算吸收系數，應符合規(guī)定范圍。4.4.3 鑒別及檢查按各品種項下的規(guī)定。測定供試品溶液的最大及最小吸收波長，有的并須測定其在最大吸收波長與最小吸收波長處的吸光度比值，均應符合規(guī)定。4.4.4 含量測定4.4.4.1 對照品比較法按各品種項下的方法，分別配制供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測成分的量應為供試品溶液中被測成標示量的10010%，所用溶劑也應完全一致，在規(guī)定的波長測定供試品溶液和

12、對照品溶液的吸收度后，按下式計算供試品中被測溶液的濃度：cx = （Ax / Ar）cR式中：cx供試品溶液的濃度；Ax供試品溶液的吸光度；cR對照品溶液的濃度；Ar對照品溶液的吸光度。4.4.4.2 吸收系數法按各品種項下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長處測定其吸收度，再以該品種在規(guī)定條件下的吸收度計算含量。用本法測定時，吸收系數通常應大于100，并注意儀器的校正和檢定。4.4.4.3 計算分光光度法采用計算分光光度法應慎重。本法有多種，使用時均應按各品種項下規(guī)定的方法進行。當吸收度處在吸收曲線的陡然上升或下降的部位測定時，波長的微小變化可能對測定結果造成顯著影響，故對照品和供試品測試條件

13、應盡可能一致。計算分光光度法一般不宜用作含量測定。4.4.4.4 比色法供試品本身在紫外-可見區(qū)沒有強吸收，或在紫外區(qū)雖有吸收但為了避免干擾或提高靈敏度，可加入適當的顯色劑顯色后測定，這種方法為比色法。用比色法測定時，由于顯色時影響顯色深淺的因素較多，應取供試品與對照品溶液同時操作。除另有規(guī)定外，比色法所用的空白系指用同體積的溶劑代替對照品或供試品溶液，然后依次加入等量的相應試劑，并用同樣方法處理。在規(guī)定的波長處測定對照品和供試品溶液的吸收度后，按4.4.4.1對照品比較法的計算供試品濃度。當吸收度和濃度關系不呈線形時，應取數份梯度量的對照品溶液，用溶劑補充至同一體積，顯色后測定各份溶液的吸收

14、度，然后以吸收度與相應的濃度繪制標準曲線，再根據供試品的吸收度在標準曲線上求出其含量。4.5注意事項4.5.1試驗中所用的量瓶和移液管均應經檢定校正、洗凈后使用。4.5.2使用的石英吸收池必須潔凈。當吸收池中裝入同一溶劑，在規(guī)定波長測定吸收池的透光率，如透光率相差在0.3%以下者可配對使用，否則必須加以校正。4.5.3取吸收池時，手拿毛玻璃面的兩側。盛裝樣品溶液以池體積的4/5為度，使用揮發(fā)性溶液時應加蓋，透光面要用擦鏡紙由上而下擦拭干凈，檢視應無殘留溶劑，為防止溶劑揮發(fā)后溶質殘留在池子的透光面，可先用蘸有空白溶劑的擦鏡紙擦拭，然后再用擦鏡紙拭凈。吸收池放入樣品室時應注意每次放入方向不同相同。使用后用溶劑及水沖洗干凈，晾干防塵保存，吸收池如污染不易洗凈時，吸收池不宜在清潔液中長時間浸泡，否則清潔液中的鉻酸鉀結晶會損壞吸收池的光學表面，并應充分用水沖洗，以防鉻酸鉀吸附于吸收池表面。4.5.4 測定前應先檢查所用的溶劑在測定供試品所用的波長附近是否符合要求， 所用試劑應不超過其截止使用波長。每次測定是應采用同一廠牌批號，混合均勻的1批溶劑。4.5.5稱量應按藥典規(guī)定要求。配制測定溶液時稀釋轉移次數應盡量可能少，轉移稀釋時所取容積一般應不少于5ml。含量測定供試品應稱取2份，如為對照品比較法，對照品一般也應稱兩份。吸收系數檢查也應