植物表達載體構建

1、 第五節(jié)第五節(jié) 植物基因工程載體植物基因工程載體 在植物基因轉化研究中已建立了多種轉化系統，在植物基因轉化研究中已建立了多種轉化系統， 如載體轉化系統、原生質體如載體轉化系統、原生質體DNA直接導入轉化系統、基因直接導入轉化系統、基因槍槍DNA導入轉化系統，以及利用植物種質細胞如花粉粒等介導入轉化系統，以及利用植物種質細胞如花粉粒等介導轉化系統等等。導轉化系統等等。 其中的載體轉化系統是植物基因工程中最重要的一種轉化其中的載體轉化系統是植物基因工程中最重要的一種轉化 系統。系統。 載體轉化系統中最重要的又是載體轉化系統中最重要的又是Ti質粒轉化載體。質粒轉化載體。一植物基因工程載體種類及命名規(guī)

2、則：一植物基因工程載體種類及命名規(guī)則：二根癌農桿菌二根癌農桿菌Ti質粒的結構和功能質粒的結構和功能：（一）（一）Ti質粒的遺傳特性、結構及功能：質粒的遺傳特性、結構及功能： （二）（二）T-DNA的基因結構與功能：的基因結構與功能：三農桿菌三農桿菌Ti質粒的基因轉化機理：質粒的基因轉化機理： （一）（一）T-DNAT-DNA的加工和轉移：的加工和轉移： （二）（二）T鏈蛋白復合體的形成及鏈蛋白復合體的形成及VirE的功能：的功能： （三）（三）T鏈復合體通過細菌膜的轉運及鏈復合體通過細菌膜的轉運及VirB的功能：的功能： （四）（四）T鏈復合體靶向植物細胞核：鏈復合體靶向植物細胞核： （五）（

3、五）T鏈整合植物基因組的分子機理：鏈整合植物基因組的分子機理： （六）農桿菌染色體基因對（六）農桿菌染色體基因對T-DNAT-DNA轉移的調控：轉移的調控：四四農桿菌農桿菌TiTi質粒的改造及載體構建：質粒的改造及載體構建：（一）（一）TiTi質粒的改造及卸甲載體構建：質粒的改造及卸甲載體構建： （二）（二）中間載體的構建：中間載體的構建： （三）（三）中間表達載體的構建：中間表達載體的構建： （四）（四）植物基因轉化載體系統的構建：植物基因轉化載體系統的構建： （五）載體構建中常用的選擇基因和報告基因（五）載體構建中常用的選擇基因和報告基因（五）（五）T鏈整合植物基因組的分子機理：鏈整合植物

4、基因組的分子機理：1整合位點及其特性：整合位點及其特性： 遺傳作圖的分析表明，遺傳作圖的分析表明，T-DNA在植物染色體上的插在植物染色體上的插入是隨機的，可插入任何一條植物染色體。但插入位點入是隨機的，可插入任何一條植物染色體。但插入位點常有以下特點：常有以下特點：T-DNAT-DNA優(yōu)先整合到轉錄活躍的植物基優(yōu)先整合到轉錄活躍的植物基因位點；因位點；T-DNAT-DNA與植物與植物DNADNA連接處富含連接處富含A A、T T堿基對；堿基對；植物植物DNADNA上的插入靶位點與上的插入靶位點與T-DNAT-DNA邊界序列有一定程度的邊界序列有一定程度的同源性。同源性。Matsumoto等人

5、認為，正是由于這種同源性才等人認為，正是由于這種同源性才使得插入的使得插入的T-DNA和靶序列能互相靠近，并有效地發(fā)生和靶序列能互相靠近，并有效地發(fā)生DNA鏈的交換。鏈的交換。 在在T-DNA的整合過程中還常發(fā)現植物基因組靶序列的整合過程中還常發(fā)現植物基因組靶序列的缺失、倒位和重復等現象，說明的缺失、倒位和重復等現象，說明T-DNA的整合過程依的整合過程依賴于植物內源重組系統。賴于植物內源重組系統。（五）（五）T鏈整合植物基因組的分子機理：鏈整合植物基因組的分子機理：1整合位點及其特性整合位點及其特性2T-DNA整合的遺傳效應整合的遺傳效應：位點效應：位點效應：T-DNA可插入多個物理位點。遺

6、傳位點數一般少可插入多個物理位點。遺傳位點數一般少于或等于插入的物理位點數，這是因為甲基化可使基因不表于或等于插入的物理位點數，這是因為甲基化可使基因不表達；或者，多拷貝插入不同位點或首尾串聯在一起，可能相達；或者，多拷貝插入不同位點或首尾串聯在一起，可能相互 起 作 用 而 導 致 基 因 的 沉 默 （ 被 稱 為 共 抑 制 ，互 起 作 用 而 導 致 基 因 的 沉 默 （ 被 稱 為 共 抑 制 ， c o -suppression）。）。 T-DNA的插入一般不引起植物的插入一般不引起植物DNA大的重排，但多數插入大的重排，但多數插入會導致靶位點處出現小的缺失，缺失多的可達會導致

7、靶位點處出現小的缺失，缺失多的可達79個核苷酸。個核苷酸。在在T-DNA/植物植物DNA連接處，有幾個至連接處，有幾個至33個核苷酸的個核苷酸的“填填充充”DNA（Filler DNA）的存在，這些填充）的存在，這些填充DNA的序列與靠的序列與靠近連接處的植物近連接處的植物DNA序列相似。序列相似。 在植物靶位處不要求有特異的序列，但若在在植物靶位處不要求有特異的序列，但若在T-DNA兩端和兩端和植物靶位處之間有一段序列（植物靶位處之間有一段序列（5-10bp）同源，則可在整合中）同源，則可在整合中起作用。起作用。（六）農桿菌染色體基因對（六）農桿菌染色體基因對T-DNA轉移的調控：轉移的調控

8、： 目前已發(fā)現位于細菌染色體上的一些基因也與目前已發(fā)現位于細菌染色體上的一些基因也與T-DNA的轉移有關，并已經了解它們編碼的蛋白質的功能。的轉移有關，并已經了解它們編碼的蛋白質的功能。ChrA、ChrB和和ChrC均參與細菌的附著功能。還有一些均參與細菌的附著功能。還有一些基因（基因（Cel、Att、ivr、PscA和和ExoC等）在等）在T-DNA轉移轉移中起重要作用，這些基因的突變將使細菌表面成分發(fā)生中起重要作用，這些基因的突變將使細菌表面成分發(fā)生變化，從而喪失與植物細胞識別和結合的的能力。此外，變化，從而喪失與植物細胞識別和結合的的能力。此外，ChrD位點影響位點影響AS對毒性區(qū)的誘導

9、效率和農桿菌的致瘤對毒性區(qū)的誘導效率和農桿菌的致瘤能力。這是因為能力。這是因為ChrD可能編碼一種細菌可能編碼一種細菌ATP結合蛋白，結合蛋白，在低在低pH值和磷酸饑餓的情況下可誘導值和磷酸饑餓的情況下可誘導VirG的表達。的表達。ChrE位點編碼一個單糖結合蛋白，與單糖影響位點編碼一個單糖結合蛋白，與單糖影響Vir區(qū)的區(qū)的表達有關。表達有關。Ros基因與基因與Vir基因的負調節(jié)有關?？梢姡炕虻呢撜{節(jié)有關?？梢?，目前已知農桿菌染色體上游前已知農桿菌染色體上游10個基因與個基因與T-DNA的轉移有關。的轉移有關。四四農桿菌農桿菌TiTi質粒的改造及載體構建質粒的改造及載體構建（一）（一）Ti

10、Ti質粒的改造及卸甲載體構建質粒的改造及卸甲載體構建（二）中間載體的構建（二）中間載體的構建（三）（三）中間表達載體的構建中間表達載體的構建（四（四）植物基因轉化載體系統的構建植物基因轉化載體系統的構建（五）載體構建中常用的選擇基因和報告基因（五）載體構建中常用的選擇基因和報告基因（一）（一）TiTi質粒的改造及卸甲載體構建：質粒的改造及卸甲載體構建： 由于大腸桿菌具有能與農桿菌高效接合轉移的特性，由于大腸桿菌具有能與農桿菌高效接合轉移的特性，科學家們可以先把科學家們可以先把T-DNA片段克隆到大腸桿菌的質粒中，片段克隆到大腸桿菌的質粒中，并插入外源基因，最后通過接合轉移把外源基因引入到農并插

11、入外源基因，最后通過接合轉移把外源基因引入到農桿菌的桿菌的Ti質粒上。帶有重組質粒上。帶有重組T-DNA的大腸桿菌質粒稱為中的大腸桿菌質粒稱為中間載體（間載體（intermediate vector），而接受中間載體的），而接受中間載體的Ti質質粒稱為受體粒稱為受體Ti質粒（質粒（acceptor Ti plasmid），一般是卸甲），一般是卸甲載體（載體（disarmed vector）。）。卸甲載體卸甲載體（disarmed vector）1Onc-卸甲載體：卸甲載體：所謂的卸甲載體就是無毒的（所謂的卸甲載體就是無毒的（non-oncogenic）、即切）、即切除了除了Onc致瘤基因的致瘤

12、基因的Ti質粒載體。在這種質粒載體。在這種Onc-載體中，已載體中，已經缺失的經缺失的T-DNA部位被大腸桿菌的一種常用質粒部位被大腸桿菌的一種常用質粒pBR322取取代。這樣，任何適合于克隆在質粒中的外源代。這樣，任何適合于克隆在質粒中的外源DNA片段，都片段，都可以通過與可以通過與pBR322質粒質粒DNA的同源重組，而被共整合到的同源重組，而被共整合到Onc-Ti質粒載體上。最常用的質粒載體上。最常用的 Onc-卸甲載體為卸甲載體為pGV3850，它保留了兩個邊界和右邊界附近的它保留了兩個邊界和右邊界附近的nos基因（胭脂堿合成酶基因（胭脂堿合成酶基因），可作為鑒別轉化細胞的一個標記；基

13、因），可作為鑒別轉化細胞的一個標記；T-DNA內部的內部的 Onc缺失區(qū)被缺失區(qū)被pBR322序列（含序列（含Apr基因）所取代。插入基因）所取代。插入pBR序列可供卸甲載體和中間載體之間實現交換重組形成序列可供卸甲載體和中間載體之間實現交換重組形成共和體，即重組體。共和體，即重組體。2. Onc+卸甲載體：卸甲載體：不去除不去除Onc基因的卸甲載體，用于特殊用途。基因的卸甲載體，用于特殊用途。四四農桿菌農桿菌TiTi質粒的改造及載體構建質粒的改造及載體構建 （一）（一）TiTi質粒的改造及卸甲載體構建：質粒的改造及卸甲載體構建：（二）（二）中間載體中間載體的構建：的構建：1中間載體的基本結構

14、與特點中間載體的基本結構與特點2常用的中間載體及其構建常用的中間載體及其構建1中間載體的基本結構與特點：中間載體的基本結構與特點： 為解決為解決Ti質粒不能直接導入目的基因的困難，構建中質粒不能直接導入目的基因的困難，構建中間載體是有效方法之一。中間載體是在大腸桿菌的克隆間載體是有效方法之一。中間載體是在大腸桿菌的克隆載體（例如載體（例如pBR322質粒）中插入一段合適的質粒）中插入一段合適的T-DNA片段片段而構成的小型質粒。中間載體通常是多拷貝的而構成的小型質粒。中間載體通常是多拷貝的E.Coli小質小質粒。粒。從結構特點上看，中間載體可分為兩類：從結構特點上看，中間載體可分為兩類：共整合

15、系統中間載體共整合系統中間載體雙元載體系統中間載體雙元載體系統中間載體（1）共整合系統中間載體共整合系統中間載體：含有與含有與Ti質粒質粒T-DNA區(qū)同源的區(qū)同源的序列，此外含有序列，此外含有pBR的序列，在其被引入農桿菌后即可高頻的序列，在其被引入農桿菌后即可高頻地與地與Ti質粒的質粒的T-DNA的同源序列進行重組；具有一個或多個的同源序列進行重組；具有一個或多個細菌選擇標記，這將有利于篩選共整合質粒；具有細菌選擇標記，這將有利于篩選共整合質粒；具有bom位點位點（接合轉移位點），在有誘導質粒存在的情況下，（接合轉移位點），在有誘導質粒存在的情況下，bom位點位點的存在可使中間載體在不同細菌

16、細胞內進行轉移；含有植物的存在可使中間載體在不同細菌細胞內進行轉移；含有植物陽性選擇標記，例如可賦予轉化植物細胞卡那霉素抗性的新陽性選擇標記，例如可賦予轉化植物細胞卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉移酶（霉素磷酸轉移酶（neomycin phosphoransferase，Npt-II）基）基因，以利于轉化植物細胞的篩選；含有單一的限制性內切酶因，以利于轉化植物細胞的篩選；含有單一的限制性內切酶切點，以利于外源基因的插入；無切點，以利于外源基因的插入；無Ti質粒的邊界序列質粒的邊界序列(見下見下圖圖)。（2）雙元載體系統中間載體雙元載體系統中間載體：其與共整合載體的不同之處：其與共整合載體的不同之處是

17、：無同源序列；具有是：無同源序列；具有LB和和RB；無；無ColE復制點。復制點。2常用的中間載體及其構建：常用的中間載體及其構建：（1）廣譜中間載體廣譜中間載體：所謂廣譜中間載體是由大腸桿菌廣譜質?？寺∷^廣譜中間載體是由大腸桿菌廣譜質?？寺-DNA片段后片段后構建而成的。常用的廣譜質粒是構建而成的。常用的廣譜質粒是RK2衍生的載體衍生的載體pRK290。由它構建的中間載體既能在大腸桿菌中復制，又能在農桿菌由它構建的中間載體既能在大腸桿菌中復制，又能在農桿菌中復制。中復制。廣譜中間載體的構建過程見下圖。廣譜中間載體的構建過程見下圖。將選定的將選定的T-DNA片段克隆到大腸桿菌質粒上；片段克

18、隆到大腸桿菌質粒上；將外源基因連同細菌選擇標記（如抗生素抗性）一起插入將外源基因連同細菌選擇標記（如抗生素抗性）一起插入到到T-DNA片段的限制性切點中；片段的限制性切點中；將產生的將產生的T-DNA“工程工程”片段亞克隆或共整合到廣譜質粒片段亞克隆或共整合到廣譜質粒pRK290。由于由于pRK290具有在廣寄主范圍中復制和接合轉移的起點，具有在廣寄主范圍中復制和接合轉移的起點，因而在輔助質粒如因而在輔助質粒如pRK2013反式動員作用下，反式動員作用下，pRK290即可即可從大腸桿菌轉入根癌農桿菌中。從大腸桿菌轉入根癌農桿菌中。（2）pBR322衍生的中間載體：衍生的中間載體： 這類中間載體

19、含有這類中間載體含有pBR322質粒的部分序列，是質粒的部分序列，是由由pBR322質?；蚱溲苌|粒亞克隆質粒或其衍生質粒亞克隆T-DNA片段而形片段而形成。其構建方法類似于上述廣譜中間載體。由于成。其構建方法類似于上述廣譜中間載體。由于pBR322質粒上帶有質粒上帶有pMB1的的bom轉移接合位點，因而轉移接合位點，因而在輔助質粒如在輔助質粒如R64drd11的幫助下，這種的幫助下，這種pBR322衍生衍生的中間載體能夠導入農桿菌中的的中間載體能夠導入農桿菌中的Ti質粒。質粒。pBR322質質粒只有與粒只有與Ti質粒重組后得以生存，未重組的質粒重組后得以生存，未重組的pBR322不能在根癌農

20、桿菌中復制而自行消失。不能在根癌農桿菌中復制而自行消失。（三）（三）中間表達載體中間表達載體的構建：的構建：中間載體從功能上看可分為兩大類：克隆中間載體從功能上看可分為兩大類：克隆載體和表達載體。載體和表達載體?？寺≥d體的主要功能是復制和擴增基因；克隆載體的主要功能是復制和擴增基因；表達載體是適于在受體細胞中表達外源基表達載體是適于在受體細胞中表達外源基因的載體。因的載體。中間表達載體含有植物特異啟動子，因而中間表達載體含有植物特異啟動子，因而能在植物中表達外源基因能在植物中表達外源基因。（三）中間表達載體的構建（三）中間表達載體的構建1啟動子及其它調控序列：啟動子及其它調控序列： 轉錄的調控

21、對真核生物基因表達起著關鍵的作用。大多轉錄的調控對真核生物基因表達起著關鍵的作用。大多數真核生物在轉錄起始點的數真核生物在轉錄起始點的5端上游區(qū)第端上游區(qū)第30至至25bp處具有處具有TATA盒，在盒，在70至至80bp處還有處還有CAAT盒；盒；3端具有端具有AATAA序序列。列。Ti質粒的質粒的Nos、Ocs、Tmr等基因都具有與真核生物啟動等基因都具有與真核生物啟動子類似的子類似的TATA盒和盒和CAAT盒，均能在植物細胞中表達，且盒，均能在植物細胞中表達，且無組織特異性。因此，它們成為早期構建嵌合基因的啟動子，無組織特異性。因此，它們成為早期構建嵌合基因的啟動子，其中以其中以Nos啟動

22、子（啟動子（pNos）最常用。后來發(fā)現，由）最常用。后來發(fā)現，由CaMV35s啟動子、外源結構基因和啟動子、外源結構基因和Nos 3端的非編碼區(qū)域組成的嵌合端的非編碼區(qū)域組成的嵌合基因，能在植物細胞中高效表達?；?，能在植物細胞中高效表達。CaMV35s啟動子既無組啟動子既無組織特異性，又不受發(fā)育時期的影響，是一個較理想的植物基織特異性，又不受發(fā)育時期的影響，是一個較理想的植物基因工程啟動子。因工程啟動子。 現在已發(fā)現很多誘導啟動子和特異表達的啟動子，被用現在已發(fā)現很多誘導啟動子和特異表達的啟動子，被用于各種不同的轉化目的。于各種不同的轉化目的。2嵌合基因嵌合基因（chimeric gene）

23、構建：）構建： 所謂嵌合基因就是所謂嵌合基因就是來自兩種或兩種以上生物的啟動來自兩種或兩種以上生物的啟動子、結構基因連接在一起而構成的基因子、結構基因連接在一起而構成的基因。 3中間表達載體的構建過程：中間表達載體的構建過程： 中間表達載體是由中間載體加上能在植物細中間表達載體是由中間載體加上能在植物細胞中表達的啟動子和選擇標記基因構成，也就是胞中表達的啟動子和選擇標記基因構成，也就是嵌合基因插入中間載體后構成。所以中間載體的嵌合基因插入中間載體后構成。所以中間載體的構建是一個十分復雜的過程。構建是一個十分復雜的過程。（四）（四）植物基因轉化載體系統植物基因轉化載體系統的構建：的構建： 上述構

24、建的中間表達載體仍然不能直接作為植物外上述構建的中間表達載體仍然不能直接作為植物外源基因轉化的載體，因為中間表達載體仍是一種細菌源基因轉化的載體，因為中間表達載體仍是一種細菌的質粒，不能把外源基因轉化到植物細胞。因此，必的質粒，不能把外源基因轉化到植物細胞。因此，必須進一步把中間載體引入到上述已改造的受體須進一步把中間載體引入到上述已改造的受體TiTi質粒質粒中，并構建成能侵染植物細胞的基因轉化載體，才能中，并構建成能侵染植物細胞的基因轉化載體，才能應用于植物基因的轉化。它是由兩種以上質粒構成的應用于植物基因的轉化。它是由兩種以上質粒構成的復合型載體，故稱之為載體系統。復合型載體，故稱之為載體

25、系統。 目前采用的主要有兩種載體系統：目前采用的主要有兩種載體系統：一元載體系統一元載體系統和和雙元載體系統雙元載體系統。（四）植物基因轉化載體系統的構建：（四）植物基因轉化載體系統的構建：1一元載體系統的構建：一元載體系統的構建： 這類載體是中間表達載體與改造后的受體這類載體是中間表達載體與改造后的受體Ti質粒之間，質粒之間，通過同源重組所產生的一種復合型載體，通常亦稱為通過同源重組所產生的一種復合型載體，通常亦稱為共共整合載體整合載體（co-integrated vector，cis），由于該載體的），由于該載體的T-DNA區(qū)與區(qū)與Ti質粒質粒Vir區(qū)連鎖，因此又稱為順式載體（區(qū)連鎖，因此

26、又稱為順式載體（cis-vector）。）。 一元載體的特點是：一元載體的特點是：由兩個質粒（由兩個質粒（E.Coli質粒和質粒和Ti質粒）重組而成，分子量較大；質粒）重組而成，分子量較大；共整合體的形成頻共整合體的形成頻率與兩個質粒的重組頻率有關，相對較低；率與兩個質粒的重組頻率有關，相對較低；必須用必須用Southern雜交或雜交或PCR對大的共整合體質粒進行檢測；對大的共整合體質粒進行檢測；構建時比較困難。構建時比較困難。 一元載體系統目前主要有兩種：共整合載體和一元載體系統目前主要有兩種：共整合載體和拼接末拼接末端載體端載體（split-end vector，SEV）。）。（四）植物基

27、因轉化載體系統的構建：（四）植物基因轉化載體系統的構建： 1一元載體系統的構建：一元載體系統的構建： （1）共整合載體共整合載體的構建：的構建：共整合載體的特點：共整合載體的特點：中間表達載體與受體中間表達載體與受體Ti卸甲載體通過同源重組共整合而成；卸甲載體通過同源重組共整合而成；共整合載體與受體共整合載體與受體Ti質粒之間的同源序列是質粒之間的同源序列是pBR322。以以pGV3850為例說明其構建過程（圖）：為例說明其構建過程（圖）： 第一步：中間載體導入農桿菌第一步：中間載體導入農桿菌 接合轉移法和三親雜交轉移法接合轉移法和三親雜交轉移法 第二步：中間載體與受體第二步：中間載體與受體T

28、i質粒的同源重組：質粒的同源重組： 第三步：共整合載體的選擇：第三步：共整合載體的選擇： （1）共整合載體的構建）共整合載體的構建第一步：中間載體導入農桿菌：通常有兩種方法第一步：中間載體導入農桿菌：通常有兩種方法:即接合轉移法（即接合轉移法（conjugative transfer）和三親雜交轉移法。）和三親雜交轉移法。1）接合轉移法接合轉移法是由于大腸桿菌質粒衍生出來的中間表達載體是由于大腸桿菌質粒衍生出來的中間表達載體均為接合缺陷型（非接合型），不能自主轉移，只有在具均為接合缺陷型（非接合型），不能自主轉移，只有在具有接合轉移功能的協助質粒存在時才能被動地完成轉移。有接合轉移功能的協助質

29、粒存在時才能被動地完成轉移。根據中間載體是否有根據中間載體是否有recA依賴性重組和協助質粒本身是否依賴性重組和協助質粒本身是否轉移，可將中間載體的接合轉移分為傳導（轉移，可將中間載體的接合轉移分為傳導（conduction）和供給（和供給（donation）兩種類型。）兩種類型。傳導傳導：特點是依賴：特點是依賴recA介導的重組，協助質粒本身也從大腸桿菌轉移介導的重組，協助質粒本身也從大腸桿菌轉移到農桿菌，轉化效率低；到農桿菌，轉化效率低；供給供給：既不依賴于：既不依賴于recA介導重組，協助質粒也不從大腸桿菌轉移到農介導重組，協助質粒也不從大腸桿菌轉移到農桿菌，然而其轉化效率很高，又被稱為

30、桿菌，然而其轉化效率很高，又被稱為“動員動員”（mobilization）。）。pBR322屬于屬于ColEI型的、無自我傳遞功能的質粒。型的、無自我傳遞功能的質粒。2）三親雜交轉移法三親雜交轉移法（triparental mating）：）：第一步：中間載體導入農桿菌第一步：中間載體導入農桿菌 （1）接合轉移法（）接合轉移法（conjugative transfer）（2）三親雜交轉移法（）三親雜交轉移法（triparental mating）：）： 上述接合轉移法是先將中間載體的上述接合轉移法是先將中間載體的DNA轉化到帶有協助轉化到帶有協助質粒的大腸桿菌菌株上，然后再與帶有受體質粒的大腸

31、桿菌菌株上，然后再與帶有受體Ti質粒的農桿菌接質粒的農桿菌接合，整個過程比較復雜。近年來新發(fā)展起來的三親雜交法則比合，整個過程比較復雜。近年來新發(fā)展起來的三親雜交法則比較簡便有效。就是將三種有關的菌株混合培養(yǎng)進行雜交。較簡便有效。就是將三種有關的菌株混合培養(yǎng)進行雜交。這三種菌株是：這三種菌株是：含有協助質粒的大腸桿菌菌株（如含有協助質粒的大腸桿菌菌株（如pG23中含有的中含有的pGJ28質粒和質粒和R64dRd11質粒）；質粒）；含有重組的中間載體的大腸桿菌菌株（如含有重組的中間載體的大腸桿菌菌株（如pLGV1103中含中含有有pBR322）；）；含有受體含有受體Ti質粒的農桿菌菌株，如質粒的

32、農桿菌菌株，如pGV3850。 在混合培養(yǎng)的過程中，通過雜交使協助質粒先轉移到含有在混合培養(yǎng)的過程中，通過雜交使協助質粒先轉移到含有重組中間載體的菌株中，然后中間載體再被動員和轉移到農桿重組中間載體的菌株中，然后中間載體再被動員和轉移到農桿菌中。菌中。（四）（四）植物基因轉化載體系統植物基因轉化載體系統的構建：的構建：（1）共整合載體的構建共整合載體的構建 第一步：中間載體導入農桿菌第一步：中間載體導入農桿菌第二步：中間載體與受體第二步：中間載體與受體TiTi質粒的同源重組：質粒的同源重組： pLGV1103pLGV1103中間表達載體導入農桿菌后，由于兩中間表達載體導入農桿菌后，由于兩種質粒

33、中都帶有種質粒中都帶有pBR322pBR322同源序列，因此少部分質同源序列，因此少部分質粒發(fā)生重組和交換，使少數中間載體整合到粒發(fā)生重組和交換，使少數中間載體整合到pGV3850pGV3850的的T-DNAT-DNA區(qū)域中，形成一個大的共整合載區(qū)域中，形成一個大的共整合載體。該共整合載體的基因結構及酶切圖如下：體。該共整合載體的基因結構及酶切圖如下：（四）（四）植物基因轉化載體系統植物基因轉化載體系統的構建：的構建：（1）共整合載體的構建共整合載體的構建第一步第一步：中間載體導入農桿菌第二步：中間載體與受體Ti質粒的同源重組第三步：共整合載體的選擇第三步：共整合載體的選擇： 通過通過pGV3

34、850和和pLGV1103質粒同源重組形成的共整合載質粒同源重組形成的共整合載體能夠不斷復制和增殖，整合在體能夠不斷復制和增殖，整合在Ti質粒中的中間載體隨同質粒中的中間載體隨同Ti質質粒得到復制和增殖。中間載體所帶有的粒得到復制和增殖。中間載體所帶有的Apr（氨芐青霉素抗性（氨芐青霉素抗性基因）、基因）、Knr（卡那霉素抗性基因）和（卡那霉素抗性基因）和Smr或或Str（鏈霉素抗性（鏈霉素抗性基因）都能得到表達。此時含有共整合質粒的農桿菌將表現基因）都能得到表達。此時含有共整合質粒的農桿菌將表現出中間載體攜帶的抗性標記，從而在含有抗菌素的培養(yǎng)基上出中間載體攜帶的抗性標記，從而在含有抗菌素的培

35、養(yǎng)基上被保留和生長。未發(fā)生重組的被保留和生長。未發(fā)生重組的pGV3850和和pLGV1103等均不能等均不能生長，因為生長，因為pBR衍生質粒的復制屬于衍生質粒的復制屬于ColEI類型，在農桿菌細類型，在農桿菌細胞內不能自我復制，因不能穩(wěn)定存在而消失。胞內不能自我復制，因不能穩(wěn)定存在而消失。含有共整合質含有共整合質粒的農桿菌即可用于植物的轉化。粒的農桿菌即可用于植物的轉化。（四）（四）植物基因轉化載體系統植物基因轉化載體系統的構建：的構建： 1一元載體系統的構建：一元載體系統的構建： （1）共整合載體的構建）共整合載體的構建（2）SEV的構建的構建： 即即T-DNA邊界拼接系統，亦稱拼接末端載

36、體邊界拼接系統，亦稱拼接末端載體（split-end vector，SEV），是另一種共整合載體。），是另一種共整合載體。因為它的兩個因為它的兩個LIH序列在同源重組前分別處于不同序列在同源重組前分別處于不同質粒上而得名。質粒上而得名。其構建過程如下圖。其構建過程如下圖。SEV的構建過程：的構建過程：1）SEV的受體的受體Ti質粒是質粒是pTiB6S3-SE，來自野生型質粒，來自野生型質粒pTiB6S3的突變體。的突變體。它的它的TL-DNA上的致瘤基因（上的致瘤基因（onc）及）及TR都已經缺失，都已經缺失，T-DNA的保留部分的保留部分被稱為被稱為“左邊界內部同源區(qū)左邊界內部同源區(qū)”（le

37、ft inside homcology，LIH），即左邊界），即左邊界內部同源序列。該受體內部同源序列。該受體Ti質粒還保留了質粒還保留了Vir基因及其它正常的功能基因，同基因及其它正常的功能基因，同時還攜有用于細菌篩選的卡那霉素抗性基因（時還攜有用于細菌篩選的卡那霉素抗性基因（Knr）。）。2）SEV中間載體是中間載體是pMon200或或pMon120。它含有一個胭脂堿合成酶基因，。它含有一個胭脂堿合成酶基因，一個在細菌里編碼的壯觀酶素抗性基因（一個在細菌里編碼的壯觀酶素抗性基因（Spcr）、鏈霉素抗性基因）、鏈霉素抗性基因Strr和和Npt-II基因，特別是它具有與受體基因，特別是它具有與

38、受體Ti質粒同源的質粒同源的LIH序列及序列及TR。3）通過三親雜交將中間載體）通過三親雜交將中間載體pMon200導入農桿菌后，由于它們之間都具有導入農桿菌后，由于它們之間都具有LIH同源序列，即可發(fā)生同源重組，形成同源序列，即可發(fā)生同源重組，形成SEV的共整合載體。的共整合載體。SEV包含有包含有分別來自兩個質粒的左右邊界及分別來自兩個質粒的左右邊界及Vir基因基因，成為一個完整的非致瘤性，成為一個完整的非致瘤性Ti質粒。質粒。由于由于pMon200中間載體帶有抗性嵌合基因，因而轉化的植物可以直接進行中間載體帶有抗性嵌合基因，因而轉化的植物可以直接進行篩選。篩選。（3）SEV和和pGV38

39、50的比較：的比較： 兩者都是通過受體兩者都是通過受體Ti質粒與中間載體同源重組而形成，同屬質粒與中間載體同源重組而形成，同屬于共整合的一元載體系統，但它們之間有一定差異：于共整合的一元載體系統，但它們之間有一定差異：1）它們的受體）它們的受體Ti質粒和中間載體的結構不同。質粒和中間載體的結構不同。pGV3850的左的左右邊界在一個受體右邊界在一個受體Ti質粒上，而質粒上，而SEV來自兩個質粒，即來自兩個質粒，即TR來自中間載體。來自中間載體。2）同源序列不同。）同源序列不同。pGV3850重組的同源序列是重組的同源序列是 pBR322，而，而SEV是是LIH。3）SEV是更有效的共整合載體。

40、由于是更有效的共整合載體。由于pGV3850 共整合載體共整合載體帶有大腸桿菌帶有大腸桿菌pBR322序列，外源基因嵌合在該序列中，序列，外源基因嵌合在該序列中，因而轉化的植物中也帶有重復的因而轉化的植物中也帶有重復的 pBR322序列。序列。此重復序此重復序列可能對轉化植物中外源基因的穩(wěn)定性有影響，而列可能對轉化植物中外源基因的穩(wěn)定性有影響，而SEVSEV系系統則排除了這種可能性統則排除了這種可能性。（四）（四）植物基因轉化載體系統植物基因轉化載體系統的構建：的構建： 1一元載體系統的構建一元載體系統的構建2雙元載體系統的構建：雙元載體系統的構建：雙元載體（雙元載體（binary vecto

41、r）系統是指由兩個分別）系統是指由兩個分別含含T-DNA和和Vir區(qū)的相容性突變區(qū)的相容性突變Ti質粒構成的雙質粒構成的雙質粒系統，也因為其質粒系統，也因為其T-DNA與與Vir基因在兩個獨基因在兩個獨立的質粒上立的質粒上，通過反式激活，通過反式激活T-DNA轉移，故又轉移，故又稱為稱為反式載體反式載體（trans vector）。）。（1）雙元載體系統的構建原理：）雙元載體系統的構建原理： Ti質粒上的質粒上的Vir基因與基因與T-DNA具有反式互補作用，即具有反式互補作用，即Vir基因可以反式激活基因可以反式激活T-DNA的轉移。根據這一原理可以使的轉移。根據這一原理可以使T-DNA與與V

42、ir區(qū)處于不同的復制子或不同的區(qū)處于不同的復制子或不同的Ti質粒中，同樣可質粒中，同樣可以激活以激活T-DNA的轉移，使插入到的轉移，使插入到T-DNA區(qū)的外源基因導入區(qū)的外源基因導入到植物細胞中；其次，雙元載體含有廣泛寄主范圍質粒的到植物細胞中；其次，雙元載體含有廣泛寄主范圍質粒的復制起始點（復制起始點（oriv），從而替代了在共整合載體中用以重組），從而替代了在共整合載體中用以重組的同源區(qū)。它們能夠在任何農桿菌寄主里自發(fā)復制，這意的同源區(qū)。它們能夠在任何農桿菌寄主里自發(fā)復制，這意味著所有的農桿菌菌株不論它帶有味著所有的農桿菌菌株不論它帶有Ti質粒還是質粒還是Ri質粒，不論質粒，不論它是武裝

43、的還是解除武裝的，都能導入中間載體成為雙元它是武裝的還是解除武裝的，都能導入中間載體成為雙元載體，寄主僅需要一套完整的載體，寄主僅需要一套完整的Vir基因。基因。 雙元載體主要包括兩個雙元載體主要包括兩個TiTi質粒，即微型質粒，即微型TiTi質粒和輔助質粒和輔助TiTi質粒。質粒。 （2）微型微型Ti質粒質粒（mini-Ti plasmid）：）：所謂微型所謂微型Ti質粒就是質粒就是含有含有T-DNA邊界、缺失邊界、缺失Vir基因的基因的Ti質粒質粒，因而轉化的植物不會產生腫瘤。因而轉化的植物不會產生腫瘤。Mini-Ti是一個廣譜質粒，除含有是一個廣譜質粒，除含有T-DNA左右邊界外，還左右

44、邊界外，還具有廣譜質粒的復制起始點具有廣譜質粒的復制起始點OriV及選擇標及選擇標記基因。記基因。Mini/PRK的復制原點來自的復制原點來自pRK290，pAL1050復制原點復制原點來自來自pRm，Bin6、Bin9等均含有等均含有pRK252的復制原點。的復制原點。Bin19是應用得最廣泛的是應用得最廣泛的Mini-Ti（下圖）。它含有來自（下圖）。它含有來自pTiT37的的T-DNA左右邊界序列，在兩個邊界序列之間左右邊界序列，在兩個邊界序列之間T-DNA區(qū)含有植物選擇標記區(qū)含有植物選擇標記Npt-II基因，基因，以及來自噬菌體以及來自噬菌體M13mp19的多種酶連接接頭的的多種酶連接

45、接頭的LacZ基因。在基因。在LacZ基因內部含基因內部含有多克隆位點，外源基因可以便利地插入其間使其本身失活。此外，含有廣寄有多克隆位點，外源基因可以便利地插入其間使其本身失活。此外，含有廣寄主質粒主質粒Rk2的復制和轉移起始位點。總之，的復制和轉移起始位點?？傊?，Bin19具有質粒小、宿主廣、帶有具有質粒小、宿主廣、帶有LacZ基因和基因和EcoRI、BamHI、Hind、SstI、KpnI、SmaI、XbaI及及SalI等單一等單一限制性內切酶切點組成的多用接頭等優(yōu)點，故外源基因較易插入，并且可在含限制性內切酶切點組成的多用接頭等優(yōu)點，故外源基因較易插入，并且可在含X-gal（5-bro

46、mo,4-chloro,3-indoly,1-D-galactopyronoside，5溴溴-4-氯氯-3-吲哚呋吲哚呋喃半乳糖苷）和喃半乳糖苷）和IPTG（isopripy, 1-D-thiogalactoside，異丙基硫代半乳糖苷），異丙基硫代半乳糖苷）的平板上直接進行篩選，操作極為方便。的平板上直接進行篩選，操作極為方便。（四）（四）植物基因轉化載體系統植物基因轉化載體系統的構建：的構建：1一元載體系統的構建一元載體系統的構建2雙元載體系統的構建雙元載體系統的構建（3）輔助）輔助Ti質粒：質粒： 含有含有Vir區(qū)段的區(qū)段的Ti質粒稱為輔助質粒稱為輔助Ti質粒。實際上輔助質粒。實際上輔助

47、Ti質質粒是粒是T-DNA缺失的突變型缺失的突變型Ti質粒，完全喪失了致瘤功能，因此質粒，完全喪失了致瘤功能，因此是相當于在共整合載體系統中的卸甲是相當于在共整合載體系統中的卸甲Ti質粒（質粒（Disarmid Ti）。）。其主要作用是提供其主要作用是提供Vir基因功能，激活處于反式位置上的基因功能，激活處于反式位置上的T-DNA轉移，該卸甲載體在此又稱為輔助質粒（轉移，該卸甲載體在此又稱為輔助質粒（helper Ti）。）。一一元載體系統提供的輔助質粒的作用是提供誘導接合質粒轉移的元載體系統提供的輔助質粒的作用是提供誘導接合質粒轉移的Tra和和Mob功能，不能混淆功能，不能混淆。 最常用的輔

48、助最常用的輔助Ti質粒是根癌農桿菌質粒是根癌農桿菌LBA4404所含有的所含有的Ti質質粒粒pAL4404。其為章魚堿型。其為章魚堿型Ti質粒質粒pTiAch5的衍生質粒，其的衍生質粒，其T-DNA區(qū)已發(fā)生缺失突變，但仍保存有完整的區(qū)已發(fā)生缺失突變，但仍保存有完整的Vir基因功能。近基因功能。近年來的研究表明，野生型的年來的研究表明，野生型的Ti質粒即不卸甲的質粒即不卸甲的Ti質粒，同樣可質粒，同樣可以作為輔助以作為輔助Ti質粒，而且具有更強毒性。質粒，而且具有更強毒性。（四）植物基因轉化載體系統的構建：（四）植物基因轉化載體系統的構建：1一元載體系統的構建一元載體系統的構建2雙元載體系統的構

49、建雙元載體系統的構建 （4）雙元載體的構建：）雙元載體的構建： 將將Mini-Ti質粒轉入質粒轉入Helper Ti質粒根癌農桿菌的途質粒根癌農桿菌的途徑有兩條，一條是徑有兩條，一條是直接用純化的直接用純化的Mini-Ti質粒轉化速凍質粒轉化速凍的根癌農桿菌感受細胞的根癌農桿菌感受細胞；另一條是與共整合載體構建一；另一條是與共整合載體構建一樣，采用樣，采用三親接合三親接合的方式。的方式。 Mini-Ti質粒均能以質粒均能以E.cili的的pRk2031為輔助質粒，為輔助質粒，通過通過三親雜交三親雜交而接合轉移到含有輔助而接合轉移到含有輔助Ti質粒的農桿菌細質粒的農桿菌細胞內。由于胞內。由于E.

50、coli pRk2031不能在農桿菌中復制而最后不能在農桿菌中復制而最后消失，含有消失，含有Mini-Ti質粒和質粒和Helper Ti質粒的根癌農桿菌質粒的根癌農桿菌可直接用于植物細胞的轉化?？芍苯佑糜谥参锛毎霓D化。（5）一元載體系統和雙元載體系統的比較：）一元載體系統和雙元載體系統的比較：1）雙元載體系統中的兩個質粒不必含有同源序列；）雙元載體系統中的兩個質粒不必含有同源序列；2）Mini-Ti質粒具有質粒具有E.coli質粒的復制其始點，能在農桿菌的寄主中復制，質粒的復制其始點，能在農桿菌的寄主中復制，而且，而且，Mini-Ti質粒分子量?。ㄙ|粒分子量?。?0kb），較易直接進行體外遺

51、傳操作；），較易直接進行體外遺傳操作；3）雙元載體不需要經過兩個質粒的共整合過程，構建的操作步驟較簡單；）雙元載體不需要經過兩個質粒的共整合過程，構建的操作步驟較簡單；4）Mini-Ti質粒較小，因此質粒轉移到農桿菌比較容易，構建頻率較高；質粒較小，因此質粒轉移到農桿菌比較容易，構建頻率較高；5）由于根癌農桿菌感染的寄主范圍是由）由于根癌農桿菌感染的寄主范圍是由Vir基因及染色體上的基因決定的，基因及染色體上的基因決定的，因此，使用雙元載體系統更便于根據轉化材料的來源不同選擇適宜的因此，使用雙元載體系統更便于根據轉化材料的來源不同選擇適宜的Helper系統；系統；6）雙元載體在外源）雙元載體在

52、外源DNA轉入植物細胞前，無需進行同源重組，插入載體轉入植物細胞前，無需進行同源重組，插入載體的外源基因變異可能要比的外源基因變異可能要比pGV3850系統來得?。幌到y來得?。?）共整合載體系統比雙元載體系統更難以應用，通常一個共整合載體在用）共整合載體系統比雙元載體系統更難以應用，通常一個共整合載體在用于植物轉化之前，應弄清于植物轉化之前，應弄清Ti質粒的拷貝數和大小，所以必須通過質粒的拷貝數和大小，所以必須通過Southern雜交來鑒定；雜交來鑒定；8）共整合載體構建成功后，工程菌的穩(wěn)定性較好，）共整合載體構建成功后，工程菌的穩(wěn)定性較好，雙元載體穩(wěn)定性較差雙元載體穩(wěn)定性較差，容易丟失；容易

53、丟失；9）雙元載體在外源基因向植物的轉化中效率高于共整合載體。）雙元載體在外源基因向植物的轉化中效率高于共整合載體。（五）載體構建中常用的（五）載體構建中常用的選擇基因選擇基因和和報告基因報告基因作為一種標記基因，必須具備作為一種標記基因，必須具備4個條件：個條件： 編碼一種不存在于正常植物細胞中的酶；編碼一種不存在于正常植物細胞中的酶； 基因較小，可構成嵌合基因；基因較小，可構成嵌合基因； 能在轉化體中得到充分表達；能在轉化體中得到充分表達； 檢測容易，并能定量分析。檢測容易，并能定量分析。 標記基因分為兩種：選擇標記基因和篩選標記基因。標記基因分為兩種：選擇標記基因和篩選標記基因。選擇標記

54、基因選擇標記基因的功能是該基因的產物對植物細胞產生一種的功能是該基因的產物對植物細胞產生一種選擇壓力，使未轉化的細胞不能生長、發(fā)育與分化；而轉選擇壓力，使未轉化的細胞不能生長、發(fā)育與分化；而轉化細胞對該標記產生抗性，不影響其生長，從而將轉化細化細胞對該標記產生抗性，不影響其生長，從而將轉化細胞選擇出來。胞選擇出來。篩選標記基因篩選標記基因則強調給轉化細胞帶上一種標記，起報告與則強調給轉化細胞帶上一種標記，起報告與識別作用，故稱報告基因。識別作用，故稱報告基因。1選擇標記基因的應用及原理：選擇標記基因的應用及原理： 一般采用的選擇標記基因都是一般采用的選擇標記基因都是低毒性化合物，抑低毒性化合物，抑制植物細胞的生長但不殺死細胞制植物細胞的生長但不殺死細胞。當采用高毒性化合。當采用高毒性化合物時，細胞將很快死亡；物時，細胞將很快死亡；死亡的或將要死亡的細胞對死亡的或將要死亡的細胞對臨近的細胞會產生抑制作用，即使鄰近細胞是轉化細臨近的細胞會產生抑制作用，即使鄰近細胞是轉化細胞也會受到某種抑制胞也會受到某種抑制。其次，選擇標記對轉化細胞生。其次，選擇標記對轉化細胞生長和器官分化能力會有一定影響；而且，一種選擇標長和器官分化能力會有一定影響；而且，一種選擇標記對不同作物的細胞影響不同，這是值得注意的。此記對不同作物的細胞影響不同，這是值得注意的。此外，選擇標記在用于檢驗轉化效果時，應該