PCR實驗室標(biāo)本管理、生物安全和防污染策略

1、PCR實驗室標(biāo)本管理、生物實驗室標(biāo)本管理、生物安全和防污染策略安全和防污染策略廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科李友瓊標(biāo)本采集時間對擴增檢測結(jié)果的影響n 在疾病發(fā)展過程中，標(biāo)本采集過早在疾病發(fā)展過程中，標(biāo)本采集過早或過晚都可能會給出假陰性結(jié)果。或過晚都可能會給出假陰性結(jié)果。標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備n 標(biāo)本采集部位的清潔消毒可去掉污染的微生標(biāo)本采集部位的清潔消毒可去掉污染的微生 物或其他雜物，但應(yīng)適度，過度清潔消毒有物或其他雜物，但應(yīng)適度，過度清潔消毒有可可 能會去掉或破壞靶微生物，故標(biāo)本采集部位能會去掉或破壞靶微生物，故標(biāo)本采集部位的的 準(zhǔn)備應(yīng)由訓(xùn)練有素的人員進行。準(zhǔn)備應(yīng)由訓(xùn)練有素的人員進行。標(biāo)本的類型和

2、采集量標(biāo)本的類型和采集量n標(biāo)本的類型：血清（漿）、分泌物、痰、尿和腦脊液等。n標(biāo)本的采集量：應(yīng)根據(jù)所測病原體而定。一般來說，如果標(biāo)本的量對病原體培養(yǎng)夠用的話，則其量亦足以用于核酸提取及其后的擴增檢測n對于定量檢測來說，對標(biāo)本的收集要求更為精確。采集質(zhì)量的評價采樣及運輸容器標(biāo)本采集中的防污染 n采集中要特別注意污染，防止混入操作者的頭發(fā)、表皮細(xì)胞、痰液等；n如使用玻璃器皿，必須經(jīng)高溫滅菌，以使用可能存在的RNase失活。標(biāo)本運送標(biāo)本運送n 樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢 測實驗室。n 樣本中如加入適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑，如用于 RNA測定加入GITC的血清（漿）樣本和 用于DNA測定的EDTA抗凝血等

3、，則可在 室溫下運送過郵寄。n 實驗室應(yīng)根據(jù)待測靶核酸的特性，對各 種臨床樣本的運送條件作出相應(yīng)的規(guī)定。 第一節(jié) 臨床標(biāo)本的處理和保存n一、血清（漿）標(biāo)本 1. DNA標(biāo)本 DNA標(biāo)本的獲取、處理和保存， 可按照一本的血清標(biāo)本處理程序即可。2. 保存全血樣本用于DNA提取檢測，可4下短期保存如用于RNA檢測， 則應(yīng)在取血后盡快提取RNA。 容器的使用2.RNA標(biāo)本處理和保存 對于RNA測定，標(biāo)本 的 獲取、處理和方式對測定結(jié)果有決定 性影響。研究表明，用于RNA測定的血漿 標(biāo)本最好是使用EDTA抗凝（嚴(yán)禁使用肝素， 因其對PCR擴增有幾只，且很難在核酸提 取過程中完全去除），抗凝后6小時內(nèi)分

4、離血漿保存 ；如使用血清標(biāo)本，則需盡 快（2小時）分離血清后保存。保存時間 短時（1-2周）可放-20下，較長期時應(yīng) 在-70下。 二、二、全血標(biāo)本全血標(biāo)本 以全血作為以全血作為 待測標(biāo)本時待測標(biāo)本時 1. 抗凝劑的選擇 以全血作為待測標(biāo)本 時，一般使用EDTA-Na2或枸櫞酸鈉， 不可使用肝素。 2. 保存全血樣本用于DNA提取檢測，可 4下短期保存，如用于RNA檢測， 則 應(yīng)在取血后盡快提取RNA。 三、外周血單個核細(xì)胞三、外周血單個核細(xì)胞n外周血單個核細(xì)胞可從抗凝全血制備，主要有兩條途徑，一是使用淋巴細(xì)胞分離液分離制備；二是使用紅細(xì)胞裂解液，裂解全血中的紅細(xì)胞，經(jīng)生理鹽水?dāng)?shù)次洗滌，即可看

5、到單個核細(xì)胞。n保存 外周血單個核細(xì)胞如暫不提取核酸，可保存于-70下。四、痰四、痰n特點 痰屬于分泌物，痰標(biāo)本中含有大量粘蛋白和雜質(zhì)。n處理 1、如作結(jié)核桿菌DNA測定標(biāo)本，提取核酸前，需對標(biāo)本進行初步處理，即用 1mmol/LNaOH液化。需注意的是，液化時不能加熱，液化時間不能過長。n保存 液化標(biāo)本如不立即用于核酸提取，可保存于-70下如用于非結(jié)核桿菌如肺炎支原體的PCR檢測，痰標(biāo)本的處理只能室溫懸浮于生理鹽水中，充分震蕩混勻，促使大塊粘狀物下沉，取上清離心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取五、棉拭子五、棉拭子n使用PCR方法檢測性疾病病原體時，臨床標(biāo)本一般為棉拭子，可將棉拭子置于適量生理

6、鹽水中，充分震蕩洗滌后，取上清立即離心，其后的沉淀即可用于DNA提取。n保存 如不立即用于核酸提取，則需保存于-70下。六、膿液六、膿液n膿液的處理依情況而定。n如用于分枝桿菌（如結(jié)核桿菌）核酸測定的標(biāo)本，粘稠的膿液可采用痰標(biāo)本的處理模式，先進行液化，再離心取沉淀提取DNA；水樣的膿液則直接離心，沉淀用于生理鹽水洗2-3次后，即可用于DNA提取。n對于用于非分枝桿菌測定的膿液標(biāo)本，如過于粘稠，則加入適量生理鹽水，充分振蕩后，靜置，取上清立即離心，沉淀用于DNA提?。蝗鐬樗畼?，則按上述直接離心取沉淀即可。n保存 沉淀標(biāo)本的保存條件同樣為-70。七、體液七、體液n臨床體液標(biāo)本包括胸水，腹水，腦脊液

7、，尿液等，可按水樣標(biāo)本的方式直接離心取沉淀提取核酸。沉淀樣本的保存同上。八、組織八、組織n組織分新鮮組織塊和石蠟切片。n新鮮組織塊的處理步驟 首先用生理鹽水洗兩次，然后將其搗碎或切碎，加入生理鹽水后劇烈震蕩混勻，離心，棄上清，再加蛋白酶K消化后提取核酸。n保存 新鮮組織最好是保存于50%乙醇中，具體作法是，先用生理鹽水將組織洗一次，切成寬度小于1cm的小片，加入適量的生理鹽水，然后，邊搖邊加入無水乙醇至濃度為50%，這樣固定的組織標(biāo)本室溫下可保存數(shù)日，4可保存6年。n保存 新鮮組織最好是保存于50%乙醇中，具體作法是，先用生理鹽水將組織洗一次，切成寬度小于1cm的小片，加入適量的生理鹽水，然后

8、，邊搖邊加入無水乙醇至濃度為50%，這樣固定的組織標(biāo)本室溫下可保存數(shù)日，4可保存6年。n石蠟切片用于核酸提取，需先用辛烷或二甲苯脫蠟，再用蛋白酶K消化后可進行DNA提取。小結(jié)小結(jié)n1、標(biāo)本的收集及適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，對用于PCR測定的核酸模板的成功提取，具有決定性作用。n2、要著重強調(diào)的一點是，所有用于上述臨床標(biāo)本收集的容器如試管或離心管，均應(yīng)使用前高壓滅菌。PCR污染與對策nPCR反映的最大特點是具有較大擴增能力與較高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，機器微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。n實驗中設(shè)立的陰性對照可提示有無假陽性結(jié)果出現(xiàn)。如果一次試驗中的幾個陰性對照結(jié)果中出現(xiàn)一個或幾個陽性結(jié)果，提示

9、本次試驗中其他標(biāo)本的檢驗結(jié)果可能有假陽性。造成假陽性的原因包括樣品污染擴增試劑污染擴增產(chǎn)物交叉污染等n常見的污染來源包括實驗室環(huán)境、加樣器、操作中形成的噴霧、DNA抽提、儀器、試劑及其他與擴增產(chǎn)物接觸的物品。PCR污染與對策 污染的原因 來自其他測試樣品污染：標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時，由于密封不嚴(yán)溢出容器外，或容器外貼有標(biāo)本而造成相互間交叉污染；標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;微生物可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導(dǎo)致彼此間的污染。PCR污染與對策 污染的原因 :來自實驗材料或者配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

10、“遺留”污染。這是PCR反應(yīng)中最常見的污染問題。因為PCR產(chǎn)物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml），高于PCR檢測的拷貝極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可以造成假陽性。PCR污染與對策污染的原因:還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形成是氣溶膠污染，在空氣中與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作是比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。 PCR污染與對策 防治污染的方法: 嚴(yán)格實驗室分區(qū)及其他實驗用品及吸樣槍應(yīng)專用。實驗前實驗室應(yīng)用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA

11、. 吸樣槍：由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或黏在槍頭上，是一個嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。PCR污染與對策防治污染的方法: 分裝PCR試劑：所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配置好，然后小量分裝，-20保存，以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機會，另外，PCR試劑，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰箱。 防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、離心管應(yīng)一次性使用 PCR污染與對策防治污染的方法: 每次PCR實驗務(wù)必做陽性對照、陰性對照、陰性對照它包括標(biāo)本對照：

12、被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定正常血清作對照;被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對照。試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進行PCR擴增，以監(jiān)測試劑是否污染。 選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋的液體甩至管底部，開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。PCR污染原因分析 實驗室污染的檢測一、 如果陰性對照標(biāo)本的擴增結(jié)果為陽性原因：1、實驗室擴增產(chǎn)物的污染。2、實驗室操作所致的樣本間的交叉污染，如強陽性標(biāo)本氣溶膠加樣器所致的污染、強陽性標(biāo)本經(jīng)操作者的手所致的污染、使用翻蓋離心管核酸提取時在較高溫時崩開等。3、擴增反應(yīng)試劑的污染

13、。陽性結(jié)果說明上述三個環(huán)節(jié)中有可能在一個或幾個環(huán)節(jié)中出了問題。PCR污染原因分析n 試劑（擴增反應(yīng)混合液）擴增的結(jié)果為陽性原因：擴增試劑發(fā)生污染， 如想鑒別試驗室是否發(fā)生污染，可將一個或多個空管打開，靜置標(biāo)本制備區(qū)3060分鐘，然后加入擴增反應(yīng)混合液擴增，如為陽性，則說明實驗室以前擴增產(chǎn)物的存在，污染了整個實驗室。n試劑（擴增反應(yīng)混合液），用水替代核酸樣本擴增，如為陰性，說明試劑質(zhì)量是好。關(guān)于PCR假陽性問題 PCR假陽性的問題是比較單純的，一般僅涉及污染和引物的非特異性問題。而污染可以通過嚴(yán)格的實驗室管理，合理的環(huán)境設(shè)置，以及加入UNG酶抗污染基本可以解決，而引物的非特異性問題基本屬于廠家試

14、劑質(zhì)量問題。PCR的假陰性卻不同，他涉及了PCR實驗的人員和技術(shù)環(huán)節(jié)，十分復(fù)雜。就臨床而言，三大陽檢出率低，或PCR檢測陰性經(jīng)常發(fā)生，可見假陰性問題的嚴(yán)重性。 PCR假陰性問題總體來說有如下因素： 一 儀器因素 PCR實驗對儀器的依賴性是很高，離心機、擴增儀都是造成PCR假陰性的因素。擴增儀的主要的影響是孔間差，引起擴增失敗或擴增效率降低。而離心機的影響則更容易被忽視。國內(nèi)使用離心機很少使用離心加速度（XXXg） 作為參考指標(biāo)，由于離心機的大小不同，有效離心半徑也不相同，因此同樣的轉(zhuǎn)速所產(chǎn)生的離心力相差很大（有的在數(shù)倍以上），造成PCR假陰性。這個問題在其他實驗也有，但因其他實驗都是測大分子蛋

15、白沉淀，對離心的速度要求較低所以不太明顯。建議使用小型臺式離心機的實驗要注意這個問題。 試劑質(zhì)量問題 PCR實驗的成功與否試劑的質(zhì)量至關(guān)重要，試劑的質(zhì)量問題涉及多個方面：細(xì)胞的裂解；模板的抽提；引物位點的選擇；Tap酶的活性等等。其中任一環(huán)節(jié)出了問題都會引起結(jié)果的假陰性。這些都是試劑質(zhì)量的問題，因此選用高質(zhì)量的PCR試劑非常重要。核酸模板問題n 核酸模版質(zhì)量是制約PCR最重要的因素之一。核酸模板在擴增區(qū)出現(xiàn)斷裂、蛋白粘附等模版質(zhì)量問題，都有可能引起擴增失敗造成結(jié)果的假陰性或定量不準(zhǔn)確。無論什么提取方法都不可能得到完全理想化的核酸模板，因此核酸模板質(zhì)量雖然與試劑的質(zhì)量有關(guān)但它不可能由試劑質(zhì)量完全

16、決定。 核酸模板問題除了模板本身的問題外，還存在模板溶液中抑制Tap酶活性成分（如某些蛋白、離子等）作用，導(dǎo)致擴增效率降低甚至擴增失敗的問題。操作人員素質(zhì)問題 PCR實驗的環(huán)節(jié)很多，而且對每一環(huán)節(jié)的質(zhì)量要求都很高，例如少加、漏加試劑、離心不充分、循環(huán)參數(shù)設(shè)計錯誤、由于RNA抽提降解、逆轉(zhuǎn)錄失敗等等都能造成結(jié)果的假陰性。因此要求PCR的實驗操作人員有良好的素質(zhì)，能夠嚴(yán)格遵守操作規(guī)則，并能敏銳的發(fā)現(xiàn)問題和解決問題。生物安全柜的使用biosafety cabinet防止操作過程中含有危害性或未知微生物氣溶膠散逸的空氣凈化安全裝置II級生物安全柜 用于對人員、受試樣本及環(huán)境進行保護且能滿足生物安全柜危

17、險度等級為1、2、3級的病原體操作的生物安全柜。II級生物安全柜的前窗開口區(qū)向內(nèi)吸入負(fù)壓氣流用以保護人員的安全；經(jīng)高效過濾器過濾的垂直氣流用以保護受試樣本的安全；排出氣流經(jīng)高效過濾器過濾是為了保護環(huán)境不受污染。生物安全柜知識簡介II級生物安全柜 二級生物安全柜是目前應(yīng)用最為廣泛飛柜型，是有前窗操作口的安全柜，操作者可以通過前窗操作口在安全柜內(nèi)進行操作，對操作過程中的人員、產(chǎn)品及環(huán)境進行保護。生物安全柜的使用安全柜的使用 與注意事項與注意事項正確的使用生物安全柜 應(yīng)遵循以下使用原則： 緩慢移動原則 物品平行擺放原則 避免震動原則 不同樣品柜內(nèi)移動原則 避免明火使用原則 定期進行安全柜防護效果的評

18、估生物安全柜操作程序一、制定操作步驟、列出明細(xì)表、準(zhǔn)備好所有材料二、用殺菌肥皂清洗雙手、戴手套；高危險性操作 要穿隔離服，戴兩副手套，手套和工作服可在 進行實驗時將保護你不受到操作中生物因子的 危害，也可以防止人體所攜帶寄生菌對安全柜 工作區(qū)和實驗樣品的污染。三、如果紫外燈正在工作，進入實驗室后關(guān)閉紫外 燈，將前窗開至工作高度病開啟熒光照明燈。 確保安全柜進氣和排氣區(qū)域沒有物體阻礙或干 擾，開啟安全柜的風(fēng)機進行預(yù)熱5分鐘，這程 序可以清楚安全柜工作區(qū)內(nèi)可能經(jīng)空氣傳播的 污染物，并有助于穩(wěn)定安全柜的氣流。調(diào)節(jié)工 作椅的高度，是你的肩膀和前窗下緣平行，這 樣可以確保你的面部在前窗的保護之下，病有

19、給予你足夠的操作空間。四、使用適當(dāng)?shù)南疽喝?0%的乙醇擦拭工作區(qū)表面包 括前方的進氣格櫥。選擇適合并有效的消毒劑主要根 據(jù)安全柜內(nèi)實驗的微生物種類和實驗內(nèi)容所決定。用 消毒劑擦拭實驗用品后再將他們移入安全柜內(nèi)的工作 區(qū)域內(nèi)，檢查實驗用品明細(xì)表，確保所有的實驗用品 都齊備，實驗操作一旦開始后，在安全柜內(nèi)移入或取 出任何物品都是不允許的，請?zhí)貏e注意前方的進氣格 櫥上不允許堆放任何實驗物品，否則會阻礙氣流的進 入，對氣流造成干擾會影響安全柜的性能。當(dāng)你在安全柜內(nèi)操作時請遵循移動原則，操作當(dāng)中手臂應(yīng)盡量平緩移動，為了避免影響正常的氣流狀態(tài)，盡量減少手臂的水平橫向移動，手臂進入和離開工作區(qū)水平縱向姿勢。七、生物安全柜可以有效控制