植物細(xì)胞工程制藥

1、第五章第五章 植物細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程白菜甘藍(lán)白菜甘藍(lán)一、細(xì)胞工程一、細(xì)胞工程 1 1概念概念: :應(yīng)用的原理和方法應(yīng)用的原理和方法研究的水平研究的水平研究的目的研究的目的細(xì)胞生物學(xué)和分細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)子生物學(xué)細(xì)胞整體水平細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水平或細(xì)胞器水平按照人們的意愿來改變按照人們的意愿來改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得細(xì)胞產(chǎn)品得細(xì)胞產(chǎn)品2 2分類分類: :植物細(xì)胞工程和動(dòng)物細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程和動(dòng)物細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程：以植物細(xì)胞工程：以植物組織細(xì)胞植物組織細(xì)胞為基本單位，在為基本單位，在細(xì)胞或細(xì)胞器細(xì)胞或細(xì)胞器水平上應(yīng)用水平上應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物細(xì)胞生物學(xué)、分子

2、生物學(xué)學(xué)等理論和技術(shù)，在等理論和技術(shù)，在離體條件離體條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖或人為的精細(xì)操作，使細(xì)胞的某些生物學(xué)特性或人為的精細(xì)操作，使細(xì)胞的某些生物學(xué)特性按按人們的意愿人們的意愿發(fā)生改變，從而發(fā)生改變，從而改良品種或創(chuàng)造新物改良品種或創(chuàng)造新物種種，或，或加速繁殖植物個(gè)體加速繁殖植物個(gè)體，或，或獲得有用物質(zhì)的過獲得有用物質(zhì)的過程程。它是在植物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，因此它是在植物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，因此植物細(xì)胞工程也是廣義概念上的植物組織培養(yǎng)。植物細(xì)胞工程也是廣義概念上的植物組織培養(yǎng)。所采用技術(shù)所采用技術(shù)的理論基礎(chǔ)的理論基礎(chǔ) 植植物物細(xì)細(xì)胞胞工工程程通常采用的通常采用的

3、技 術(shù) 手 段技 術(shù) 手 段 植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng) 植物體細(xì)胞雜交植物體細(xì)胞雜交植物細(xì)胞的全能性植物細(xì)胞的全能性（一）（一）種苗脫毒種苗脫毒 莖尖培養(yǎng)可以得到無病毒苗木已成為解決病莖尖培養(yǎng)可以得到無病毒苗木已成為解決病毒病危害和品種退化問題的一個(gè)重要途徑。毒病危害和品種退化問題的一個(gè)重要途徑。二、植物細(xì)胞工程的主要應(yīng)用二、植物細(xì)胞工程的主要應(yīng)用（二）（二）快速繁殖快速繁殖 許多植物名貴是因?yàn)榉敝诚禂?shù)太低，種子結(jié)許多植物名貴是因?yàn)榉敝诚禂?shù)太低，種子結(jié)實(shí)率低或者不結(jié)種子，而營養(yǎng)繁殖又很慢。利用實(shí)率低或者不結(jié)種子，而營養(yǎng)繁殖又很慢。利用組織培養(yǎng)再生植株，進(jìn)行大量繁殖，可以大大提組織培養(yǎng)再生植株，

4、進(jìn)行大量繁殖，可以大大提高繁殖系數(shù)。目前組織培養(yǎng)快速繁殖已在許多植高繁殖系數(shù)。目前組織培養(yǎng)快速繁殖已在許多植物上應(yīng)用，物上應(yīng)用， 最早是蘭花（最早是蘭花（6060年代）。年代）?？焖俜敝硨?shí)現(xiàn)工廠化育苗快速繁殖實(shí)現(xiàn)工廠化育苗(特點(diǎn)：繁殖快，性狀穩(wěn)定，整特點(diǎn)：繁殖快，性狀穩(wěn)定，整齊一致，無病蟲害，周期短，周年生產(chǎn)。齊一致，無病蟲害，周期短，周年生產(chǎn)。) （三）（三）植物細(xì)胞工程育種植物細(xì)胞工程育種 1.利用培養(yǎng)變異，篩選優(yōu)良突變體利用培養(yǎng)變異，篩選優(yōu)良突變體 植物離體培養(yǎng)，能夠明顯提高突變率，并且植物離體培養(yǎng)，能夠明顯提高突變率，并且會(huì)有各種各樣的生理和形態(tài)突變，如株高、花色、會(huì)有各種各樣的生理和

5、形態(tài)突變，如株高、花色、植株形態(tài)、生育期、耐性等?？梢詮闹羞x擇優(yōu)良植株形態(tài)、生育期、耐性等?？梢詮闹羞x擇優(yōu)良突變體，培育新品種。突變體，培育新品種。 2 .利用遠(yuǎn)緣雜交幼胚培養(yǎng)，獲得雜種植株，利用遠(yuǎn)緣雜交幼胚培養(yǎng)，獲得雜種植株，克服其雜交不親和性克服其雜交不親和性 有些植物遠(yuǎn)緣雜交，能正常受精，但受精胚往有些植物遠(yuǎn)緣雜交，能正常受精，但受精胚往往敗育。這種情況下，可以將幼胚在敗育前進(jìn)行往敗育。這種情況下，可以將幼胚在敗育前進(jìn)行離體培養(yǎng)可以使難度很大的遠(yuǎn)緣雜交取得成功，離體培養(yǎng)可以使難度很大的遠(yuǎn)緣雜交取得成功，獲得緣遠(yuǎn)雜種植株，從而育成一些罕見的新物種獲得緣遠(yuǎn)雜種植株，從而育成一些罕見的新物種。

6、 3.利用細(xì)胞融合技術(shù)，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性利用細(xì)胞融合技術(shù)，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性 野生種往往有許多優(yōu)良性狀，但大部分與栽培種野生種往往有許多優(yōu)良性狀，但大部分與栽培種雜交不親和，嚴(yán)重影響了野生種優(yōu)良遺傳基因的應(yīng)雜交不親和，嚴(yán)重影響了野生種優(yōu)良遺傳基因的應(yīng)用。利用細(xì)胞融合，可以克服這種雜交不親和性，用。利用細(xì)胞融合，可以克服這種雜交不親和性，獲得體細(xì)胞雜種，使野生種的利用成為可能。獲得體細(xì)胞雜種，使野生種的利用成為可能。 4.倍性育種，縮短育種年限倍性育種，縮短育種年限 5.基因工程基因工程基因工程主要研究基因工程主要研究DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后必須通過組織培養(yǎng)途徑才能實(shí)

7、現(xiàn)植株再生。必須通過組織培養(yǎng)途徑才能實(shí)現(xiàn)植株再生。Regeneration of Plants from Cells or Tissue Is an Important Research ToolThis is the most common way of producing transgenic Arabidopsis.（四）（四）離體種質(zhì)保存離體種質(zhì)保存 隨著地球不斷開發(fā)、生態(tài)環(huán)境破壞，種植資隨著地球不斷開發(fā)、生態(tài)環(huán)境破壞，種植資源日趨枯竭，大量有用基因損失。利用組織培養(yǎng)源日趨枯竭，大量有用基因損失。利用組織培養(yǎng)法，低溫保存（法，低溫保存（196）或試管保存，為保存和）或試管保存，為保存和

8、搶救瀕臨滅絕的生物帶來希望。搶救瀕臨滅絕的生物帶來希望。（五）（五）細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)（生物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)（生物 制品）制品） 利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生物質(zhì)，如藥物、色素、利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生物質(zhì)，如藥物、色素、食品添加劑、酶、農(nóng)藥等。有些極其昂貴的生物食品添加劑、酶、農(nóng)藥等。有些極其昂貴的生物制品，如抗癌首選藥物制品，如抗癌首選藥物-紫杉醇等，可以用大規(guī)模紫杉醇等，可以用大規(guī)模培養(yǎng)植物細(xì)胞來直接生產(chǎn)。培養(yǎng)植物細(xì)胞來直接生產(chǎn)。第一節(jié)第一節(jié) 基本概念基本概念1.植物細(xì)胞的全能性：植物細(xì)胞的全能性：植物體中任何一個(gè)具有完整植物體中任何一個(gè)具有完整細(xì)胞核（完整染色體組）的細(xì)胞，在一定條件下細(xì)胞核

9、（完整染色體組）的細(xì)胞，在一定條件下都可以重新再分化形成原來的個(gè)體。都可以重新再分化形成原來的個(gè)體。2.植物組織和器官培養(yǎng)：植物組織和器官培養(yǎng)：在無菌和人工控在無菌和人工控制條件下（培養(yǎng)基、光照、溫度等），研制條件下（培養(yǎng)基、光照、溫度等），研究植物的細(xì)胞、組織和器官以及控制其生究植物的細(xì)胞、組織和器官以及控制其生長發(fā)育的技術(shù)。長發(fā)育的技術(shù)。3.植物的分化：植物的分化：高等植物的分化分為胚胎高等植物的分化分為胚胎發(fā)生和器官發(fā)生兩個(gè)階段。發(fā)生和器官發(fā)生兩個(gè)階段。4.脫分化脫分化:已經(jīng)分化的細(xì)胞、組織和器官在已經(jīng)分化的細(xì)胞、組織和器官在人工培養(yǎng)的條件下又變成未分化的細(xì)胞和人工培養(yǎng)的條件下又變成未分

10、化的細(xì)胞和組織的過程。組織的過程。5.再分化：再分化：通過脫分化誘導(dǎo)形成的愈傷組通過脫分化誘導(dǎo)形成的愈傷組織在適宜的培養(yǎng)條件下可再分化成為胚狀織在適宜的培養(yǎng)條件下可再分化成為胚狀體或直接分化成器官。體或直接分化成器官。9.外植體：外植體：在植物組織培養(yǎng)過程中，接種在培養(yǎng)基上的在植物組織培養(yǎng)過程中，接種在培養(yǎng)基上的無菌細(xì)胞、組織、器官等均稱為外植體。無菌細(xì)胞、組織、器官等均稱為外植體。6.植物無菌培養(yǎng)植物無菌培養(yǎng)愈傷組織愈傷組織:愈傷組織是指從植物受傷部位或組織培養(yǎng)物愈傷組織是指從植物受傷部位或組織培養(yǎng)物產(chǎn)生的由分化和未分化細(xì)胞組成的一類薄壁組織產(chǎn)生的由分化和未分化細(xì)胞組成的一類薄壁組織。7.細(xì)

11、胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)8.分生組織培養(yǎng)分生組織培養(yǎng)10.無性繁殖系無性繁殖系11.突變體突變體12.繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)13.次級(jí)代謝作用和次級(jí)代謝產(chǎn)物次級(jí)代謝作用和次級(jí)代謝產(chǎn)物 生物堿、黃酮體、萜類等有明顯的生理活性。生物堿、黃酮體、萜類等有明顯的生理活性。第二節(jié)第二節(jié) 植物細(xì)胞工程發(fā)展歷史植物細(xì)胞工程發(fā)展歷史、探索階段、探索階段(20世紀(jì)初至30年代中)植物的器官和組織可以不斷分割，直至分到單個(gè)植物的器官和組織可以不斷分割，直至分到單個(gè)細(xì)胞而不影響細(xì)胞增殖的觀點(diǎn)。并設(shè)想離體細(xì)胞細(xì)胞而不影響細(xì)胞增殖的觀點(diǎn)。并設(shè)想離體細(xì)胞具有再生完整植株的潛力。具有再生完整植株的潛力。1902年，德國植物學(xué)家年，德國植物

12、學(xué)家 Haberlandt提出了提出了植物植物細(xì)胞全能性學(xué)說細(xì)胞全能性學(xué)說。 作為一門技術(shù)，必須具有一定的程序性（技術(shù)模式）。作為一門技術(shù)，必須具有一定的程序性（技術(shù)模式）。在這一階段植物組織培養(yǎng)建立了在這一階段植物組織培養(yǎng)建立了2個(gè)與培養(yǎng)技術(shù)有關(guān)的重個(gè)與培養(yǎng)技術(shù)有關(guān)的重要模式：要模式：培養(yǎng)基模式、激素調(diào)控模式培養(yǎng)基模式、激素調(diào)控模式。 2 2、培養(yǎng)技術(shù)建立階段、培養(yǎng)技術(shù)建立階段（2020世紀(jì)世紀(jì)3030年代至年代至5050年代末）年代末） 1934年美國的年美國的White，利用番茄根利用番茄根建立了第一個(gè)活躍生長的無性繁殖系，建立了第一個(gè)活躍生長的無性繁殖系，發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)B族維生素對(duì)培養(yǎng)的離體

13、根生長具族維生素對(duì)培養(yǎng)的離體根生長具有重要作用。有重要作用。 創(chuàng)立了創(chuàng)立了 1943年年White發(fā)表了植物組織培養(yǎng)發(fā)表了植物組織培養(yǎng)手冊(cè)的專著，使植物組織培養(yǎng)開始成手冊(cè)的專著，使植物組織培養(yǎng)開始成為一門新興的學(xué)科。為一門新興的學(xué)科。P.R.White 1948 年，年，Skoog和崔徵通和崔徵通過對(duì)煙草莖切段和髓培養(yǎng)組過對(duì)煙草莖切段和髓培養(yǎng)組織的研究，織的研究，確定了腺嘌呤確定了腺嘌呤生長素的比例是控制芽和根生長素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。形成的主要條件之一。 1956年年Miller等發(fā)現(xiàn)了激動(dòng)素?？刂频劝l(fā)現(xiàn)了激動(dòng)素?？刂破鞴俜制鞴俜只募に啬Ｊ阶?yōu)榧?dòng)素生長素的比例關(guān)系化的激

14、素模式變?yōu)榧?dòng)素生長素的比例關(guān)系。促進(jìn)組培發(fā)展。促進(jìn)組培發(fā)展。F.Skoog 1958年，英國科學(xué)家年，英國科學(xué)家Steward 等用胡蘿卜根的愈傷組等用胡蘿卜根的愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出胚狀體并分化為完整織細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出胚狀體并分化為完整的小植株，的小植株，首次獲得植株再生成功。首次獲得植株再生成功。使細(xì)胞全能性理論使細(xì)胞全能性理論得到證實(shí)，這是植物組培的第一次突破。得到證實(shí)，這是植物組培的第一次突破。Edward C. Cocking 1960 1960年，年，Cocking Cocking 等用等用真菌纖維素真菌纖維素酶酶分離植物原生分離植物原生質(zhì)體獲得成功。這

15、是植物組質(zhì)體獲得成功。這是植物組織培養(yǎng)的第二次突破織培養(yǎng)的第二次突破 。 1960年年G.Morel采用蘭花的莖采用蘭花的莖尖培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了去病毒和快速繁尖培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了去病毒和快速繁殖兩個(gè)目的。這是經(jīng)過莖尖殖兩個(gè)目的。這是經(jīng)過莖尖原原球莖球莖小植株的方式而再生的。小植株的方式而再生的。G.Morel Morel提出的這種離體無性繁殖方法，其繁殖提出的這種離體無性繁殖方法，其繁殖系數(shù)極高，很快被蘭花生產(chǎn)者所采用，迅速建立系數(shù)極高，很快被蘭花生產(chǎn)者所采用，迅速建立起蘭花工業(yè)。植物離體微繁技術(shù)及脫毒技術(shù)得到起蘭花工業(yè)。植物離體微繁技術(shù)及脫毒技術(shù)得到了迅速發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化。了迅速發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化。

16、1962年年Marshing和和Skoog在煙草培養(yǎng)中篩選在煙草培養(yǎng)中篩選出至今仍被廣泛使用的出至今仍被廣泛使用的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)基。 1964年，印度科學(xué)家年，印度科學(xué)家Guha 和和Maheswari 在曼在曼陀羅花藥培養(yǎng)中陀羅花藥培養(yǎng)中首次由花粉誘導(dǎo)得到了單倍體首次由花粉誘導(dǎo)得到了單倍體植株植株。 19711971年，年，Takebe Takebe 等從煙草原生質(zhì)體得到再生等從煙草原生質(zhì)體得到再生植株，植株，首次獲得原生質(zhì)體植株再生成功。首次獲得原生質(zhì)體植株再生成功。 1972 1972年，年，Carlson Carlson 等通過兩個(gè)煙草物種之間原等通過兩個(gè)煙草物種之間原生質(zhì)體的融合，生

17、質(zhì)體的融合，獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜種植株。獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜種植株。3 3、應(yīng)用研究階段、應(yīng)用研究階段（2020世紀(jì)世紀(jì)7070年代以后）年代以后）（1）原生質(zhì)體培養(yǎng)取得重大突破）原生質(zhì)體培養(yǎng)取得重大突破（2）花藥培養(yǎng)取得顯著成績）花藥培養(yǎng)取得顯著成績 （3）微繁技術(shù)廣泛應(yīng)用）微繁技術(shù)廣泛應(yīng)用第三節(jié)第三節(jié) 植物細(xì)胞的形態(tài)及生理特性植物細(xì)胞的形態(tài)及生理特性一、植物細(xì)胞的形態(tài)一、植物細(xì)胞的形態(tài) 細(xì)胞大小不一，基本組織細(xì)胞體積較大直徑在細(xì)胞大小不一，基本組織細(xì)胞體積較大直徑在20100微米微米之間，儲(chǔ)藏組織細(xì)胞的直徑可達(dá)之間，儲(chǔ)藏組織細(xì)胞的直徑可達(dá)1毫毫米，最長的細(xì)胞是無節(jié)乳管長達(dá)數(shù)米至數(shù)十米。米，

18、最長的細(xì)胞是無節(jié)乳管長達(dá)數(shù)米至數(shù)十米。 多細(xì)胞植物其細(xì)胞多細(xì)胞植物其細(xì)胞形態(tài)多種多樣形態(tài)多種多樣，球形、，球形、類圓形、橢圓形、角形；具有支持作用的細(xì)胞類圓形、橢圓形、角形；具有支持作用的細(xì)胞細(xì)胞壁常增厚，類圓形、紡錘形；具有輸導(dǎo)作細(xì)胞壁常增厚，類圓形、紡錘形；具有輸導(dǎo)作用的細(xì)胞管形。用的細(xì)胞管形。二、植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征二、植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征細(xì)胞壁細(xì)胞壁細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì) 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 高爾基體高爾基體 線粒體線粒體 葉綠體葉綠體等。等。細(xì)胞核細(xì)胞核液泡液泡1.生理活性物質(zhì)生理活性物質(zhì) 一類對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)和生理活動(dòng)起調(diào)節(jié)一類對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)和生理活動(dòng)起調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)的總稱，包括作用的物質(zhì)的總稱

19、，包括酶、維生素、植物激素酶、維生素、植物激素、抗生素和植物殺菌素、抗生素和植物殺菌素等。等。2.后含物后含物 植物細(xì)胞儲(chǔ)藏的物質(zhì)或者廢棄物質(zhì)，包括植物細(xì)胞儲(chǔ)藏的物質(zhì)或者廢棄物質(zhì)，包括生生物堿、苷類、有機(jī)酸、揮發(fā)油物堿、苷類、有機(jī)酸、揮發(fā)油等。等。三、植物細(xì)胞主要生理活性物質(zhì)及其他化學(xué)組分三、植物細(xì)胞主要生理活性物質(zhì)及其他化學(xué)組分二二 植物培養(yǎng)細(xì)胞的生理特性植物培養(yǎng)細(xì)胞的生理特性（1）細(xì)胞個(gè)體較大細(xì)胞個(gè)體較大（較微生物細(xì)胞大得多），有（較微生物細(xì)胞大得多），有纖維細(xì)胞壁，細(xì)胞纖維細(xì)胞壁，細(xì)胞抗剪切力差抗剪切力差。（2）細(xì)胞生長）細(xì)胞生長速度較慢速度較慢，容易被微生物污染，培，容易被微生物污染，

20、培養(yǎng)時(shí)需添加抗生素養(yǎng)時(shí)需添加抗生素（3）細(xì)胞培養(yǎng)過程中）細(xì)胞培養(yǎng)過程中易聚集成團(tuán)易聚集成團(tuán)，較難進(jìn)行懸浮，較難進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)。（4）培養(yǎng)時(shí)）培養(yǎng)時(shí)需供養(yǎng)需供養(yǎng)，但培養(yǎng)液粘度較大，不能耐，但培養(yǎng)液粘度較大，不能耐受強(qiáng)力通風(fēng)攪拌。受強(qiáng)力通風(fēng)攪拌。（5）細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，）細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)量低產(chǎn)量低。（6）植物細(xì)胞具有結(jié)構(gòu)和功能）植物細(xì)胞具有結(jié)構(gòu)和功能全能性全能性，即培養(yǎng)的，即培養(yǎng)的細(xì)胞可以分化成完整的植株。細(xì)胞可以分化成完整的植株。第四節(jié)第四節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)一、植物材料的準(zhǔn)備一、植物材料的準(zhǔn)備1. 外植體的選擇外植體的選擇（1）遺傳表型選擇：

21、）遺傳表型選擇：（2）生理狀態(tài)的選擇：）生理狀態(tài)的選擇：（3）取外植體的部位：）取外植體的部位：（4）取外植體的季節(jié)和時(shí)間：）取外植體的季節(jié)和時(shí)間：（5）外植體大小與誘導(dǎo)成功率：）外植體大小與誘導(dǎo)成功率：2.外植體的滅菌外植體的滅菌消毒原則：消毒原則：既要徹底消滅外植體表面的微生物，又要保持外植體正既要徹底消滅外植體表面的微生物，又要保持外植體正?；盍?。?；盍?。消毒劑：消毒劑：良好的消毒作用，又要易被無菌水沖掉或自行分解掉。良好的消毒作用，又要易被無菌水沖掉或自行分解掉。消毒程序：消毒程序：消毒劑種類、濃度和消毒時(shí)間。消毒劑種類、濃度和消毒時(shí)間。目前常用消毒方法：目前常用消毒方法：首先首先70

22、75酒精，酒精，30秒，表面殺菌，后用其他消毒劑消毒；如秒，表面殺菌，后用其他消毒劑消毒；如： 0.1升汞，升汞，510分鐘，分鐘，25次氯酸鈉，次氯酸鈉，530分鐘。分鐘。莖尖、莖段、葉片消毒程序：莖尖、莖段、葉片消毒程序：70乙醇乙醇30秒秒 無菌水無菌水23次次 25次氯酸鈉次氯酸鈉1015分分 無菌水無菌水35次。次。種子的消毒程序：種子的消毒程序：10次氯酸鈉次氯酸鈉2030分分無菌水無菌水35次。次。根的消毒程序：根的消毒程序：自來水沖洗自來水沖洗純乙醇漂洗純乙醇漂洗0.1升汞升汞510分分無菌水無菌水35次。次。3.誘導(dǎo)培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)（1）外植體的切割：）外植體的切割：葉片葉片0.

23、50.8 cm2；莖段和頂芽以；莖段和頂芽以cm長為宜。長為宜。（2）接種：）接種：形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基（如莖切段），葉平鋪。形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基（如莖切段），葉平鋪。不可將切塊深埋于培養(yǎng)基中，以防無氧呼吸。不可將切塊深埋于培養(yǎng)基中，以防無氧呼吸。（3）最佳培養(yǎng)基的篩選：）最佳培養(yǎng)基的篩選：主要因素主要因素: 基本培養(yǎng)基，植物生長物質(zhì)的種類、濃基本培養(yǎng)基，植物生長物質(zhì)的種類、濃度和配比。度和配比。二、培養(yǎng)基及其組成二、培養(yǎng)基及其組成1.培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基的種類（1）基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基：包括大量元素和微量元素、維生素和：包括大量元素和微量元素、維生素和氨基酸，還有碳源和水。常見的有氨基酸，還有

24、碳源和水。常見的有MS、White、Nitsch、B5和和N6等。等。 完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基：根據(jù)各種不同試驗(yàn)要求，在基本培養(yǎng)：根據(jù)各種不同試驗(yàn)要求，在基本培養(yǎng)基中附加一些物質(zhì)，如各種植物生長物質(zhì)以及其它有機(jī)基中附加一些物質(zhì)，如各種植物生長物質(zhì)以及其它有機(jī)附加物（如椰乳、香蕉汁、番茄汁、酵母提取物、麥芽附加物（如椰乳、香蕉汁、番茄汁、酵母提取物、麥芽等）。等）。（2）根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分：根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分：液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基（3）根據(jù)培養(yǎng)基的無機(jī)鹽分根據(jù)培養(yǎng)基的無機(jī)鹽分：高鹽高鹽(MS)、中鹽、中鹽(Miller)、低鹽、低鹽(White)培養(yǎng)基培養(yǎng)基（4）根

25、據(jù)培養(yǎng)物分：根據(jù)培養(yǎng)物分：愈傷組織培養(yǎng)基、芽增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)基、芽增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)基和原生質(zhì)體培養(yǎng)基等基和原生質(zhì)體培養(yǎng)基等2.培養(yǎng)基的組分培養(yǎng)基的組分（1）無機(jī)營養(yǎng)成分：無機(jī)營養(yǎng)成分：植物生長發(fā)育必需的元素為植物生長發(fā)育必需的元素為14種：種：大量元素大量元素 N、P、 K、Ca、S、Mg（大于大于30mg/L）微量元素微量元素 Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、Cl、Ni（小于小于30mg/L）（2）有機(jī)營養(yǎng)成分：有機(jī)營養(yǎng)成分：A 碳源碳源：為生長發(fā)育提供碳骨架和能源，維持培養(yǎng)基的滲：為生長發(fā)育提供碳骨架和能源，維持培養(yǎng)基的滲透平衡。主要為糖類，常

26、用蔗糖。一般用量為透平衡。主要為糖類，常用蔗糖。一般用量為25%。B 有機(jī)有機(jī)N源源：構(gòu)成蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的組成分，：構(gòu)成蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的組成分，并提供激素。如蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、氨基酸和有機(jī)復(fù)合物并提供激素。如蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、氨基酸和有機(jī)復(fù)合物。（3）植物生長物質(zhì)：）植物生長物質(zhì)： A 生長素生長素：主要用于誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂（愈傷組織的形成）：主要用于誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂（愈傷組織的形成）和根的分化，如和根的分化，如IAA，NAA，IBA，2,4D。B 細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素：主要用于促進(jìn)細(xì)胞分裂和由愈傷或器官上：主要用于促進(jìn)細(xì)胞分裂和由愈傷或器官上分化不定芽，也用于莖芽增殖，常用分化不

27、定芽，也用于莖芽增殖，常用6-BA、KT、ZT。（4）瓊脂與瓊脂與pH值值： 瓊脂是由海藻得來的多糖類物質(zhì)，一般用瓊脂是由海藻得來的多糖類物質(zhì)，一般用0.71.0。pH一般為一般為57間，常用間，常用 5.8。pH 6.0，培養(yǎng)基變硬；，培養(yǎng)基變硬；pH 5.0，瓊脂不凝固。，瓊脂不凝固。（5）維生素：維生素： 植物細(xì)胞通常是維生素自養(yǎng)型，但合成量太少，需要植物細(xì)胞通常是維生素自養(yǎng)型，但合成量太少，需要額外加入少量的維生素。額外加入少量的維生素。3.培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備（1）母液的配制和保存：）母液的配制和保存： 培養(yǎng)基母液是指按培養(yǎng)基配方配制濃度高培養(yǎng)基母液是指按培養(yǎng)基配方配制濃度高10

28、100倍倍的高濃度溶液。的高濃度溶液。（2）配制培養(yǎng)基：）配制培養(yǎng)基： 100ml大量元素大量元素 + 10ml微量元素微量元素 + 10ml鐵鹽鐵鹽+ 10ml有機(jī)物有機(jī)物 + 生長物質(zhì)生長物質(zhì) + 30g蔗糖蔗糖 + 7g瓊脂，定容瓊脂，定容1L，煮沸，煮沸溶解后滅菌備用。溶解后滅菌備用。 滅菌后的培養(yǎng)基一般隔天再用，因滅菌后的培養(yǎng)基一般隔天再用，因pH變動(dòng)（偏酸變動(dòng)（偏酸0.10.3 pH ）。）。 培養(yǎng)基在低溫暗中可保存一段時(shí)間（培養(yǎng)基在低溫暗中可保存一段時(shí)間（1個(gè)月）。個(gè)月）。三、培養(yǎng)方法三、培養(yǎng)方法按按培養(yǎng)對(duì)象培養(yǎng)對(duì)象分：原生質(zhì)體培養(yǎng)和單倍體細(xì)胞培養(yǎng)；分：原生質(zhì)體培養(yǎng)和單倍體細(xì)胞培

29、養(yǎng)；按按培養(yǎng)基類型培養(yǎng)基類型分：固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)；分：固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)；按按培養(yǎng)方式培養(yǎng)方式分：懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和固定化細(xì)胞培養(yǎng)。分：懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和固定化細(xì)胞培養(yǎng)。切取切取接種接種愈傷組織的形成愈傷組織的形成分化形成小芽或根分化形成小芽或根試管苗的形成試管苗的形成移栽移栽植物組織固體培養(yǎng)舉例植物組織固體培養(yǎng)舉例離體植離體植物細(xì)胞物細(xì)胞（外植體）（外植體）胚狀體胚狀體根芽根芽愈傷組織愈傷組織脫分化脫分化再分化再分化1 1、過程、過程植物體植物體優(yōu)勢？優(yōu)勢？繁殖速度快繁殖速度快不受季節(jié)限制不受季節(jié)限制工廠化生產(chǎn)工廠化生產(chǎn)幼苗無毒幼苗無毒保持優(yōu)良性狀保持優(yōu)良性狀1.植物細(xì)胞培養(yǎng)所需要的營養(yǎng)物質(zhì)有哪些

30、？植物細(xì)胞培養(yǎng)所需要的營養(yǎng)物質(zhì)有哪些？2.植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)有哪些？植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)有哪些？2 2、組織培養(yǎng)應(yīng)用：、組織培養(yǎng)應(yīng)用： （1 1）植物快速繁殖）植物快速繁殖（植物克隆，珍稀、（植物克隆，珍稀、瀕危物種）瀕危物種）（2 2）無性繁殖植物）無性繁殖植物脫毒幼苗的培養(yǎng)脫毒幼苗的培養(yǎng) 紫草紫草紫草素紫草素 愈傷組織愈傷組織（3 3）提取原料（藥物、食品添加劑、香料、色素、殺蟲劑）提取原料（藥物、食品添加劑、香料、色素、殺蟲劑）懸浮培養(yǎng)舉例懸浮培養(yǎng)舉例 在愈傷組織液體培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來。在愈傷組織液體培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來。是指將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中是指將單個(gè)游離細(xì)

31、胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。1.懸浮培養(yǎng)的特點(diǎn)懸浮培養(yǎng)的特點(diǎn)： （1）細(xì)胞可以不斷增殖，形成高密度的細(xì)胞群體，并且）細(xì)胞可以不斷增殖，形成高密度的細(xì)胞群體，并且適于適于大規(guī)模培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)；（2）可）可大量提供較均勻的細(xì)胞大量提供較均勻的細(xì)胞，為深入細(xì)致地研究細(xì)胞，為深入細(xì)致地研究細(xì)胞的生長、分化創(chuàng)造了一個(gè)很好的實(shí)驗(yàn)方法和條件。的生長、分化創(chuàng)造了一個(gè)很好的實(shí)驗(yàn)方法和條件。2.懸浮培養(yǎng)液的制備：懸浮培養(yǎng)液的制備：3.懸浮培養(yǎng)類型懸浮培養(yǎng)類型（1）成批培養(yǎng)（成批培養(yǎng)（Batch culture）：）： 是把細(xì)胞接種到一個(gè)與外界隔絕的只允許氣體和揮是把細(xì)胞接種到

32、一個(gè)與外界隔絕的只允許氣體和揮發(fā)性的代謝物質(zhì)交換的、營養(yǎng)液體積保持不變的密閉系發(fā)性的代謝物質(zhì)交換的、營養(yǎng)液體積保持不變的密閉系統(tǒng)中培養(yǎng)。統(tǒng)中培養(yǎng)。 成批培養(yǎng)細(xì)胞生長的周期呈型曲線。成批培養(yǎng)細(xì)胞生長的周期呈型曲線。 細(xì)胞培養(yǎng)周期時(shí)間長短因植物種類和起始培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)周期時(shí)間長短因植物種類和起始培養(yǎng)細(xì)胞的密度而異。的密度而異。 滯后期的長短主要取決于在繼代時(shí)原種培養(yǎng)細(xì)胞所滯后期的長短主要取決于在繼代時(shí)原種培養(yǎng)細(xì)胞所處的生長期和轉(zhuǎn)入細(xì)胞的數(shù)量。處的生長期和轉(zhuǎn)入細(xì)胞的數(shù)量。 當(dāng)懸浮液達(dá)到最大干重產(chǎn)量后，須繼代。當(dāng)懸浮液達(dá)到最大干重產(chǎn)量后，須繼代。氣升式反應(yīng)器和機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器氣升式反應(yīng)器和機(jī)械攪

33、拌式生物反應(yīng)器（2）連續(xù)培養(yǎng)（）連續(xù)培養(yǎng)（Continuous culture）：）：是用一定容積的但非密閉的反應(yīng)器來進(jìn)行的，培養(yǎng)過程中是用一定容積的但非密閉的反應(yīng)器來進(jìn)行的，培養(yǎng)過程中不斷注入新鮮培養(yǎng)基，使其營養(yǎng)物質(zhì)連續(xù)得到補(bǔ)充，細(xì)不斷注入新鮮培養(yǎng)基，使其營養(yǎng)物質(zhì)連續(xù)得到補(bǔ)充，細(xì)胞的生長和增殖連續(xù)進(jìn)行。胞的生長和增殖連續(xù)進(jìn)行。恒化培養(yǎng)；恒濁培養(yǎng)。恒化培養(yǎng)；恒濁培養(yǎng)。二階段連續(xù)培養(yǎng)法。二階段連續(xù)培養(yǎng)法。（3）固定化培養(yǎng)）固定化培養(yǎng)第五節(jié)第五節(jié) 影響植物次級(jí)代謝產(chǎn)物累計(jì)的因素影響植物次級(jí)代謝產(chǎn)物累計(jì)的因素影響因素：影響因素：生物條件生物條件（外植體外植體、季節(jié)、休眠、分化等）；、季節(jié)、休眠、分化等）；物理?xiàng)l件物理?xiàng)l件（溫度、光、通氣、（溫度、光、通氣、pH、滲透壓）；、滲透壓）；化學(xué)條件化學(xué)條件（無機(jī)鹽無機(jī)鹽、碳源碳源、維生素、氨基酸等）；、維生素、氨基酸等）；工業(yè)培養(yǎng)條件工業(yè)培養(yǎng)條件（培養(yǎng)罐、攪拌等）（培養(yǎng)罐、攪拌等）一、外植體選擇一、外植體選擇 不同外植體的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物，最大次級(jí)