慢病毒轉(zhuǎn)染手冊研究

1、慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。基本概述慢病毒載體的研究發(fā)展得很快,研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、月中瘤細胞、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果，在美國已經(jīng)開展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。慢病毒的應(yīng)用目前慢病毒也被廣泛地應(yīng)用于表達RNAi的研究中。由于有些類型細胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)的siRN

2、A半衰期短，體外合成siRNA對基因表達的抑制作用通常是短暫的，因而使其應(yīng)用受到較大的限制。采用事先在體外構(gòu)建能夠表達siRNA的載體，然后轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA的策略，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細胞種類增加，而且對基因表達抑制效果也不遜色于體外合成siRNA,在長期穩(wěn)定表達載體的細胞中，甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達的作用。在所構(gòu)建的siRNA表達載體中，是由RNA聚合酶田啟動子來指導RNA合成的，這是因為RNA聚合酶田有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA不會帶polyA尾。當RNA聚合酶田遇到連續(xù)4個或5個T時，它指導的轉(zhuǎn)錄就會停止，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3'端形成14個U。U6和H1RNA

3、啟動子是兩種RNA聚合酶田依賴的啟動子，其特點是啟動子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達21ntRNA和50ntRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stemloop)。在siRNA表達載體中，構(gòu)成siRNA的正義與反義鏈，可由各自的啟動子分別轉(zhuǎn)錄，然后兩條鏈互補結(jié)合形成siRNA;也可由載體直接表達小發(fā)卡狀RNA(smallhairpinRNA,shRNA),載體包含位于RNA聚合酶ID啟動子和45T轉(zhuǎn)錄終止位點之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列，轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有14個U3'突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在細胞內(nèi)進一步加工成siRNA。構(gòu)建載體前通常要通過合成siRNA的方法，尋找高效的siRNA,然后從中挑選符合載體要求的

4、序列，將其引入siRNA表達載體。慢病毒載體慢病毒載體(Lentiviralvector)較逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有更廣的宿主范圍,慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細胞。慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細胞、干細胞、受精卵以及分化的后代細胞中表達shRNA,實現(xiàn)在多種類型的細胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達的功能性沉默，為在原代的人和動物細胞組織中快速而高效地研究基因功能，以及產(chǎn)生特定基因表達降低的動物提供了可能性。慢病毒作為siRNA的攜帶者，不但具備特異性地使基因表達沉默的能力，而且充分發(fā)揮了慢病毒載體自身所具備的優(yōu)勢，為基因功能的研究提供了更強有力

5、的工具。慢病毒表達載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應(yīng)分子。慢病毒載體與其它常見病毒載體的特征比較目前常用的病毒載體有腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染分裂期細胞，而且容量有限，腺病毒一般不能整合到染色體上，只能進行瞬時感染。與其它逆轉(zhuǎn)錄

6、病毒相比，慢病毒(LV)具有可以感染非分裂期細胞、容納外源性基因片段大，可以長期表達等顯著優(yōu)點。慢病毒不產(chǎn)生任何有效的細胞免疫應(yīng)答，可作為一種體外基因運輸?shù)墓ぞ?。慢病毒載體介導的轉(zhuǎn)基因表達能持續(xù)數(shù)月，且無可觀察到的病理學現(xiàn)象。1病母表達系統(tǒng)腺病母表達系統(tǒng)慢病母表達系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病母病毒基因組雙鏈DNA病毒RNARNA是否整合病毒基因組游離于宿主基因組外，瞬時表達外源基因病毒基因組整合于宿主基因組，長時間、穩(wěn)定表達外源基因病毒基因組整合于宿主基因組，長時間、穩(wěn)定表達外源基因感染細胞類型感染分裂和不分裂細胞感染分裂和不分裂細胞感染分裂細胞，但在干細胞中表達效率低表達豐度局水平表達局水平表達局水平表達表

7、達時間1-22-41-2滴度滴度高達1012pfu/ml最高可達10910TU/ml最高可達10910TU/ml克隆容量可插入高達8kb外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低可插入不超過8kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低可插入不超過6kb的外源片段免疫原性高免疫原性低免疫原性低免疫原性動物模型不能得到轉(zhuǎn)基因動物口產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，效率達50以上可以，但很難啟動子動子啟動子/、需要啟動子能否用于MIRCORNA可以可以/、可以能否用于四環(huán)素誘導/、可以TET-ON,TET-OFF/、可以系統(tǒng)的目的與意義對于一些較難轉(zhuǎn)染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導效

8、率，而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加，這就為RNAi,cDNA克隆以及報告基因的研究提供了一個有利的途徑。進行穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的篩選； 為活體動物模型實驗提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液；解決的問題 對于一些較難轉(zhuǎn)染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導效率，而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加，這就為RNAi,cDNA克隆以及報告基因的研究提供了一個有利的途徑。 進行穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的篩選； 為活體動物模型實驗提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液；在細胞相關(guān)的實驗操作中，對于一些按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無法轉(zhuǎn)染的細胞，通過病毒介導的實驗?zāi)軌虼蟠筇岣呋虻霓D(zhuǎn)導

9、效率，以達到目的基因的高效瞬時表達。細胞相關(guān)的實驗實驗?zāi)康膶τ谝恍┌闯Ｒ?guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無法轉(zhuǎn)染的細胞，通過病毒介導的實驗?zāi)軌虼蟠筇岣呋虻霓D(zhuǎn)導效率，以達到目的基因的高效瞬時表達。實驗流程1 .根據(jù)目的基因相關(guān)信息（序列，序列號等），構(gòu)建含有外源基因或siRNA的重組載體；2 .對于測序正確的重組質(zhì)粒，提取和純化高質(zhì)量的不含內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒；3 .使用高效重組載體和病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，進行病毒包裝和生產(chǎn)，收集病毒液；4 .濃縮、純化病毒液；5 .用高質(zhì)量的病毒液感染細胞；6 .通過定量PCR精確測定病毒滴度（高精確滴定方法）和Western分析實驗結(jié)果；7 .用高質(zhì)量的病毒液感染宿

10、主細胞；檢測基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用藥物進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選，通常狀況下，篩選的細胞克隆株具有長期的表達穩(wěn)定性。病毒液足夠用于一般的動物活體實驗。慢病毒使用操作手冊1慢病毒使用操作2慢病毒安全使用規(guī)范3懸浮細胞感染方法概要4相關(guān)專業(yè)術(shù)語5細胞培養(yǎng)器皿的相關(guān)參數(shù)1、慢病毒使用操作手冊1.1 慢病毒的儲存與稀釋：1.1.1 病毒的儲存：用戶收到病毒液后在很短時間內(nèi)即使用慢病毒進行實驗，可以將病毒暫時放置于4C保存；如需長期保存請放置于-80C（病毒置于凍存管，并使用封口膜封口）A.病毒可以存放于-80C6個月以上；但如果病毒儲存時間超過6個月，我們建議在使用前需要重新滴定病毒滴

11、度8 .反復凍融會降低病毒滴度：每次凍融會降低病毒滴度10%;因此在病毒使用過程中應(yīng)僅盡量避免反復凍融，為避免反復凍融我們強烈建議客戶收到病毒后按照每次的使用量進行分裝。9 .1.2病毒的稀釋：用戶需要稀釋病毒時，請將病毒取出置于冰浴融解后，使用培養(yǎng)目的細胞用PBS或無血清培養(yǎng)基（含血清或含雙抗不影響?zhàn)薅靖腥荆┗靹蚍盅b后4c保存（請盡量在三天內(nèi)用完）分裝后使用1.2慢病毒用于體外（InVitro）實驗：感染培養(yǎng)原代細胞和建系細胞1.2.1 慢病毒對各種細胞和組織的親嗜性不同，用戶使用Invabio提供的慢病毒之前可以通過查閱相關(guān)文獻，了解慢病毒對您的目的細胞的親嗜性，感染復數(shù)（MOI值）以及在

12、體（InVivo）注射所需要的病毒量。如果沒有相關(guān)文獻支持，可以通過感染預實驗得到合適的感染復數(shù)（MOI值）（使用24孔板檢測病毒對目的細胞的親嗜性）1.2.2 慢病毒感染目的細胞預實驗1.2.2.1 慢病毒感染目的細胞預實驗注意事項A.測定慢病毒對目的細胞的親嗜性時，需要同時設(shè)置對慢病毒親嗜性較高的細胞（HEK293T,Hela）作為平行實驗的對照細胞。B.在進行慢病毒感染實驗時，可以用完全培養(yǎng)基（培養(yǎng)目的細胞用）稀釋；理論上，含有血清，雙抗或者其他營養(yǎng)因子的完全培養(yǎng)基不影響慢病毒的感染效率。C.Invabio提供的病毒單位為TU/ml,即每毫升中含有具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。如：病毒滴度為

13、1X108TU/ml即每毫升病毒液中至少含有1X108個具有生物活性的慢病毒顆粒。1.2.2.2以24孔培養(yǎng)板為例，進行目的細胞和HEK293T細胞的感染預實驗實驗前按照不同的MOI設(shè)置不同的感染孔，并根據(jù)MOI和細胞數(shù)量計算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者無血清培養(yǎng)基稀釋病毒原液第一天,準備細胞：在24孔培養(yǎng)板接種若干孔，每個孔內(nèi)接種35X104個目的細胞，鋪板時細胞的融合率為50%左右，每孔培養(yǎng)基體積為100冏進行病毒感染時細胞的融合度約為70%左右。第二天,準備病毒：取出4c保存的病毒，使用臺式離心機離心20秒（使病毒完全懸于離心管底部即可）；如果是凍存在-80C的病毒需要

14、先在冰上融化后使用。亦可以根據(jù)實驗室的實際情況將按照MOI準確計算好的慢病毒稀釋到培養(yǎng)基中，并盡可能保證所獲得的含有慢病毒的培養(yǎng)基的總體積為最小體積，以期獲得最佳的感染效率。第二天，感染目的細胞：病毒準備好之后，從培養(yǎng)箱中拿出細胞，首先觀察細胞生長狀態(tài)，如細胞狀態(tài)較好則開始實驗a使用移液器吸取準確體積的病毒液加入準備好的培養(yǎng)基b吸去培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿中的培養(yǎng)基（如果細胞生長良好，密度適宜，則不用換液）c在目的細胞和對照細胞中分別加入計算好的病毒液d混勻后放于二氧化碳培養(yǎng)箱（37C、5%CO2）孵育過夜注：感染前細胞的狀態(tài)好壞對最終的感染效果高低影響很大，所以務(wù)必保證加病毒之前細胞處于良好的生長狀

15、態(tài)亦可以將預先準備好的培養(yǎng)基和慢病毒的混合液直接加入培養(yǎng)器皿中慢病毒對目的細胞的感染效率較低，通過提高MOI值可以提高病毒的感染效率，但是當MOI高于20時，我們建議客戶在培養(yǎng)基中加入ploybrene（8g/ml左右）來提高病毒的感染效率。A.第三天，更換培養(yǎng)液：一般在24小時候后將含有慢病毒的培養(yǎng)液更換成正常培養(yǎng)液；在感染后觀察細胞狀態(tài)，如果慢病毒對細胞有明顯毒性作用而影響細胞生長狀態(tài)，可以最短在加病毒4小時候更換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)（建議在8-12小時更換為宜）。第一次換液后，如果慢病毒對細胞沒有明顯毒性作用，按照正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)換液。B.第六天,感染效率檢測：在倒置熒光顯微鏡觀察熒光、

16、估計慢病毒感染目的細胞的效率；如何由于目的基因較大而造成選擇的載體不能攜帶MarkerGene的，可以通過Real-timeRT-PCR檢測目的基因的表達來拍評估感染效率。注意：Invabio提供的病毒載體上帶有GFP綠色熒光蛋白，用戶可以在病毒感染96小時后用倒置熒光顯微鏡觀察GFP綠色熒光，以觀察病毒對目的細胞的感染情況。如果慢病毒載體攜帶其他MarkerGene如RFPBFP可以用熒光顯微鏡在對應(yīng)的激發(fā)光波長下觀察熒光表達的情況慢病毒表達時間較慢，熒光表達所需時間較長，建議感染后96小時后觀測熒光表達。感染后的細胞可以連續(xù)培養(yǎng)一周，通過觀察熒光的表達時間和表達強度來確定慢病毒對目的細胞的

17、感染情況。感染期間請根據(jù)細胞生長的情況對細胞進行及時換液，以保證細胞良好的生長狀態(tài)。2、慢病毒使用安全使用規(guī)范Invabio提供的慢病毒為自殺”性病毒，即病毒感染目的細胞后不會再感染其他細胞，也不會利用宿主細胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。慢病毒中的毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒因此沒有毒性作用。但該病毒仍然具有可能的潛在的生物學危險，Invabio建議不要使用編碼已知或可能會致癌的基因的假型病毒。除非已經(jīng)完全公認某個基因肯定沒有致癌性，否則均不建議采用假型病毒進行生物學實驗。如有疑問,請與我們聯(lián)系。使用時請參照如下所示進行實驗：2.1 .病毒操作時最好使用生物安全柜。如果使用普

18、通超凈工作臺操作病毒，請不要打開排風機。2.2 .病毒操作時請穿實驗服，帶口罩和手套。2.3 .操作病毒時特別小心不要產(chǎn)生氣霧或飛濺。如果操作時超凈工作臺有病毒污染，請立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干凈。接觸過病毒的槍頭，離心管，培養(yǎng)板，培養(yǎng)液請于84消毒液或1%SDS中浸泡過夜后棄去。2.4 ,用顯微鏡觀察細胞感染情況時應(yīng)遵從以下步驟：擰緊培養(yǎng)瓶或蓋緊培養(yǎng)板。用70%乙醇清理培養(yǎng)瓶外壁后到顯微鏡處觀察拍照。離開顯微鏡實驗臺之前，用70%乙醇清理顯微鏡實驗臺。2.5 .如需要離心，應(yīng)使用密封性好的離心管，或者用封口膜封口后離心，而且盡量使用組織培養(yǎng)室內(nèi)的離心機。2.6 .脫掉手套后，用

19、肥皂和水清洗雙手。3、懸浮細胞感染方法概要1.1 根據(jù)細胞的量將細胞在1.5ml管中離心收集然后用100-200U1的無血清培養(yǎng)液稀釋細胞沉淀，以細胞完全浸沒在培養(yǎng)基中為準1.2 按照MOI換算病毒顆粒數(shù)量，吸取病毒液加入細胞中，將1.5ml管放在37C度培養(yǎng)箱中孵育30分鐘1.3 將管中混合溶液吸出加到培養(yǎng)皿中或孔里1.4 加入足夠量的新鮮培養(yǎng)液1.512 小時后換液1.696小時后觀察細胞陽性率4、相關(guān)專業(yè)術(shù)語（詳情可參考公司網(wǎng)站FAQ）常用術(shù)語：MOI:病毒感染復數(shù)傳統(tǒng)的MOI概念起源于噬菌體感染細菌的研究。其含義是感染時噬菌體與細菌的數(shù)量比值，也就是平均每個細菌感染噬菌體的數(shù)量。噬菌體

20、的數(shù)量單位為pfu。一般認為MOI是一個比值，沒有單位，其實其隱含的單位是pfunumber/cell。后來MOI被普遍用于病毒感染細胞的研究中，含義是感染時病毒與細胞數(shù)量的比值，本手冊中提到的MOI都是沿用這個概念。然而，由于病毒的數(shù)量單位有不同的表示方式，從而使MOI產(chǎn)生了不同的含義。能產(chǎn)生細胞裂解效應(yīng)的病毒例如單純皰疹疝毒等習慣上仍用pfu表示病毒數(shù)量，因此其MOI的含義與傳統(tǒng)的概念相同。MOIstandsfor"MultiplicityofInfection."Itistheratioofinfectiousvirusparticlestothenumberofce

21、llsbeinginfected.TherecommendedMOIisintherangeof0.1(meaningthatyouinoculate1virusparticleforevery10cells)to0.01.ThegeneraltheorybehindMOIistointroduceoneinfectiousvirusparticletoeveryhostcellthatispresentintheculture.However,morethanonevirusmayinfectthesamecellwhichleavesapercentageofcellsuninfected

22、.ThisoccurrencecanbereducedbyusingahigherMOItoensurethateverycellisinfected.5、細胞培養(yǎng)器皿的相關(guān)參數(shù)Flask/DishSurface(mm)CellnumberMediaVolume96wellplate501.5-5.010100a148wellplate1003.0>104-1.0X0200a124wellplate2008.0>104-2.0X0500a112wellplate4011.6-4.0101.0ml6wellplate9623.0-8.0102.0ml35mm9623.0-8.0102

23、.0ml60mm28271.0-2.5106.0ml100mm78542.5-6.41010.0ml慢病毒載體的包裝與純化1實驗流程制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，四種質(zhì)粒載體分別進行高純度無內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染后8h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上精液，對其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，感染Hela細胞后定量PCR檢測病毒滴度。體內(nèi)和體外實驗對慢病毒滴度的要求不同，生產(chǎn)過程中可以通過濃縮得到不同滴度的慢病毒顆粒。2實驗材料2.1 慢病毒載體、包裝細胞和菌株慢病毒載體系統(tǒng)（Tronolab）該病毒包裝系統(tǒng)為四質(zhì)粒系統(tǒng)，組成為pRsv-RE

24、V,pMDlg-pRRE,pMD2G,目的干擾質(zhì)粒。其中目的干擾質(zhì)粒能表達綠色熒光蛋白（GFP）.pRsv-REV,pMDlg-pRRE,pMD2G含有病毒包裝所必須的元件.細胞株293T,慢病毒的包裝細胞，為貼壁依賴型成上皮樣細胞，生長培養(yǎng)基為DMEM（含10%FBS）。貼壁細胞經(jīng)培養(yǎng)生長增殖形成單層細胞。菌株大腸桿菌菌株DH5xo用于擴增慢病毒載體和輔助包裝載體質(zhì)粒。2.2 主要試劑試劑名稱生產(chǎn)廠家貨號包裝細胞293T細胞株中科院上海細胞所大腸桿菌菌株DH5xInvitrogen公司胎牛血清Invitrogen公司胰蛋白酶Invitrogen公司限制性內(nèi)切酶FermentasT4DNA連接酶NEB公司M0202V質(zhì)粒DNA提取試劑盒Axygen公司制備感受態(tài)試劑盒BIOSCIENCES凝膠回收試劑盒Qiagen公司1kb/100bpladderFermentas2.3 主要儀器儀器名稱生產(chǎn)廠家貨號PCR儀AppliedBiosystems公司電泳儀Bio-rad公司熒光倒置顯微鏡奧林帕斯冷凍超速離心機Hitachi細胞培養(yǎng)箱healforce凝膠成像儀穩(wěn)壓DNA電泳儀Tianneng恒溫搖床上海博訊儀器