遺傳轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌Z

1、 實(shí)驗(yàn)八實(shí)驗(yàn)八 植物的遺傳轉(zhuǎn)化植物的遺傳轉(zhuǎn)化主要方法有：主要方法有： DNA直接導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)化直接導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)化 1 化學(xué)誘導(dǎo)化學(xué)誘導(dǎo)DNA直接轉(zhuǎn)化直接轉(zhuǎn)化 2 物理法誘導(dǎo)物理法誘導(dǎo)DNA直接轉(zhuǎn)化直接轉(zhuǎn)化 種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 1 花粉管通道法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化花粉管通道法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 2 生殖細(xì)胞浸泡法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化生殖細(xì)胞浸泡法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 3 胚囊、子房注射法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化胚囊、子房注射法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 生物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化生物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化 1 植物病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化植物病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化 2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): 操作簡(jiǎn)單，不需要特殊的儀器，獲得轉(zhuǎn)基因

2、植株操作簡(jiǎn)單，不需要特殊的儀器，獲得轉(zhuǎn)基因植株 周期短，轉(zhuǎn)化效率高等周期短，轉(zhuǎn)化效率高等農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移1 農(nóng)桿菌簡(jiǎn)介農(nóng)桿菌簡(jiǎn)介 革蘭氏陰性土壤桿菌。根癌農(nóng)桿菌根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacteriumtumefaciens):Ti質(zhì)粒,能誘導(dǎo)被侵染的植物細(xì)胞形成腫瘤,即誘發(fā)冠癭瘤;發(fā)根農(nóng)桿菌發(fā)根農(nóng)桿菌 (Agrobacteriumrhizogenes):Ri質(zhì)粒,能夠誘導(dǎo)被侵染的植物細(xì)胞產(chǎn)生毛發(fā)狀根。根癌農(nóng)桿菌屬于根瘤菌科,農(nóng)桿菌屬,革蘭氏陰性菌。好氧，最適生長(zhǎng)溫度為25-30，最佳生長(zhǎng)pH為6.0-9.0，研究表明，雙子葉植物中有93屬643種對(duì)農(nóng)桿菌敏感，而單子葉植物則普遍不敏感。2.

3、根癌農(nóng)桿菌致瘤的機(jī)制根癌農(nóng)桿菌致瘤的機(jī)制根癌農(nóng)桿菌Ti的致瘤過(guò)程需要如下條件：植物的損傷信號(hào)及環(huán)境因子。菌體的識(shí)別和附著位點(diǎn)。Ti質(zhì)粒的必需組成元件，包括TDNA區(qū)域和致毒基因(Virgene)。位于根癌農(nóng)桿菌染色體上的一些其他遺傳座位植物損傷信號(hào)及環(huán)境因子植物損傷信號(hào)及環(huán)境因子植物損傷信號(hào)植物損傷信號(hào)（糖類(lèi)和酚類(lèi)化合物）可指導(dǎo)農(nóng)（糖類(lèi)和酚類(lèi)化合物）可指導(dǎo)農(nóng)桿菌對(duì)植物細(xì)胞的趨化性移動(dòng)，并可誘導(dǎo)農(nóng)桿菌桿菌對(duì)植物細(xì)胞的趨化性移動(dòng)，并可誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir基因的表達(dá)?；虻谋磉_(dá)。 化學(xué)誘導(dǎo)信號(hào)化學(xué)誘導(dǎo)信號(hào)中最強(qiáng)的為酚類(lèi)化合物，包括兒茶中最強(qiáng)的為酚類(lèi)化合物，包括兒茶酚、沒(méi)食子酸、香草醛，乙酰丁香酮等酚、沒(méi)

4、食子酸、香草醛，乙酰丁香酮等, 以以乙酰丁香乙酰丁香酮酮的誘導(dǎo)效果最佳。的誘導(dǎo)效果最佳。 。菌體識(shí)別和附著位點(diǎn)菌體識(shí)別和附著位點(diǎn) 在植物細(xì)胞壁上存在著由碳水化合物、蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞壁上存在著由碳水化合物、蛋白質(zhì)和果膠組成的農(nóng)桿菌附著的受體位點(diǎn)，位于完整細(xì)和果膠組成的農(nóng)桿菌附著的受體位點(diǎn)，位于完整細(xì)胞的表面。在農(nóng)桿菌細(xì)胞壁上也存在著吸附到植物胞的表面。在農(nóng)桿菌細(xì)胞壁上也存在著吸附到植物細(xì)胞壁的結(jié)合位點(diǎn)，由位于細(xì)菌外膜的蛋白質(zhì)和脂細(xì)胞壁的結(jié)合位點(diǎn)，由位于細(xì)菌外膜的蛋白質(zhì)和脂多糖構(gòu)成。農(nóng)桿菌附著到植物細(xì)胞上后，分泌出果多糖構(gòu)成。農(nóng)桿菌附著到植物細(xì)胞上后，分泌出果膠酶等物質(zhì)，消化植物細(xì)胞壁，從而形成農(nóng)

5、桿菌侵膠酶等物質(zhì)，消化植物細(xì)胞壁，從而形成農(nóng)桿菌侵入植物細(xì)胞的通道。入植物細(xì)胞的通道。 T-DNA區(qū)：區(qū)：轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移DNA，農(nóng)桿菌侵染細(xì)胞時(shí)，農(nóng)桿菌侵染細(xì)胞時(shí)， 從從Ti質(zhì)質(zhì) 粒上切割下來(lái)轉(zhuǎn)移到植物粒上切割下來(lái)轉(zhuǎn)移到植物 細(xì)胞上的一段細(xì)胞上的一段DNAVir區(qū)：區(qū)：毒性區(qū)，激活毒性區(qū)，激活T-DNA轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移。Con區(qū)：區(qū)：接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)，該區(qū)存在著與細(xì)菌間接接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)，該區(qū)存在著與細(xì)菌間接 合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控），調(diào)控Ti質(zhì)粒在質(zhì)粒在 農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。Ori區(qū)：區(qū)：復(fù)制起始區(qū)復(fù)制起始區(qū) 染色體上的一些其他遺傳座位染色體上的一些其他遺傳座位

6、這些基因在致瘤過(guò)程中具有決定農(nóng)桿菌細(xì)胞表面特性和調(diào)控這些基因在致瘤過(guò)程中具有決定農(nóng)桿菌細(xì)胞表面特性和調(diào)控Ti質(zhì)粒質(zhì)粒Vir基因的表達(dá)的作用?；虻谋磉_(dá)的作用。Ti質(zhì)粒的必需組成元件質(zhì)粒的必需組成元件土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化 主要步驟：主要步驟： (1)細(xì)菌在植物敏感細(xì)胞上吸附；細(xì)菌在植物敏感細(xì)胞上吸附； (2 )農(nóng)桿菌中農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的Vir區(qū)基因被激活區(qū)基因被激活；損傷細(xì)胞分泌物損傷細(xì)胞分泌物Vir自身磷酸化自身磷酸化 VirG(轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子) (3)T-DNA切割和切割和T-DNA復(fù)合物形成；復(fù)合物形成； virD基因產(chǎn)物對(duì)基因產(chǎn)物對(duì)T-DNA進(jìn)行剪切進(jìn)行剪切

7、virE2蛋白分子（為蛋白分子（為DNA單鏈結(jié)合蛋白）相結(jié)合，形成單鏈結(jié)合蛋白）相結(jié)合，形成T鏈復(fù)合物（鏈復(fù)合物（T-complex）。）。 (4)T-DNA復(fù)合物由農(nóng)桿菌進(jìn)入植物細(xì)胞；復(fù)合物由農(nóng)桿菌進(jìn)入植物細(xì)胞； T鏈復(fù)合物在鏈復(fù)合物在virD2和和virE2核定位信號(hào)（核定位信號(hào)（NLS）引導(dǎo)下以）引導(dǎo)下以virD2為先導(dǎo)被轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核為先導(dǎo)被轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核 (5)T-DNA整合到植物染色體上并且進(jìn)行表達(dá)。整合到植物染色體上并且進(jìn)行表達(dá)。1. 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)培養(yǎng)基：培養(yǎng)基： LB, YEM, YEB 生長(zhǎng)周期生長(zhǎng)周期: 固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)1-2天，液體培養(yǎng)天，液體培養(yǎng)2-3天。天。

8、農(nóng)桿菌接種后，一般需要在農(nóng)桿菌接種后，一般需要在25-30 的條件下，的條件下，1-2小時(shí)才開(kāi)始小時(shí)才開(kāi)始分裂。因此當(dāng)用抗生素篩選菌株時(shí)，需要在液體培養(yǎng)液中分裂。因此當(dāng)用抗生素篩選菌株時(shí)，需要在液體培養(yǎng)液中2小時(shí)后小時(shí)后再加入抗生素，以便讓抗性基因充分表達(dá)。再加入抗生素，以便讓抗性基因充分表達(dá)。 2Vir區(qū)基因活化誘導(dǎo)物的使用區(qū)基因活化誘導(dǎo)物的使用乙酰丁香酮乙酰丁香酮(AS) ，羥，羥 基乙酰丁香酮基乙酰丁香酮(OH-AS) 使用方法：使用方法： 1, 在農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中加入在農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中加入AS。 2, 共培養(yǎng)基中加入。共培養(yǎng)基中加入。 3，在農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中和共培養(yǎng)基都加入，在農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中

9、和共培養(yǎng)基都加入AS。 使用的使用的pH值：值： 5.0-5.6, Vir區(qū)基因的誘導(dǎo)達(dá)到最高水平。區(qū)基因的誘導(dǎo)達(dá)到最高水平。3外植體的選擇外植體的選擇 轉(zhuǎn)化只發(fā)生在細(xì)胞分裂的一個(gè)較短的時(shí)期轉(zhuǎn)化只發(fā)生在細(xì)胞分裂的一個(gè)較短的時(shí)期 細(xì)胞分裂周期的的細(xì)胞分裂周期的的S期（期（ DNA合成期）合成期） 合子胚、體細(xì)胞胚或者胚性細(xì)胞。合子胚、體細(xì)胞胚或者胚性細(xì)胞。 性質(zhì)未定細(xì)胞：性質(zhì)未定細(xì)胞： 分生組織，分生組織， 微管形成層，靜微管形成層，靜止薄壁組織及胚，雌、雄配子體，這些組織的細(xì)止薄壁組織及胚，雌、雄配子體，這些組織的細(xì)胞具有很強(qiáng)的分生能力，而且發(fā)育性質(zhì)未定，當(dāng)胞具有很強(qiáng)的分生能力，而且發(fā)育性質(zhì)未

10、定，當(dāng)這些組織發(fā)生創(chuàng)傷或者環(huán)境因素誘導(dǎo)時(shí)，則加速這些組織發(fā)生創(chuàng)傷或者環(huán)境因素誘導(dǎo)時(shí)，則加速分裂，形成愈傷組織或者迅速分化，趨向某一器分裂，形成愈傷組織或者迅速分化，趨向某一器官的發(fā)育、處于轉(zhuǎn)化的敏感期。官的發(fā)育、處于轉(zhuǎn)化的敏感期。 4外植體的農(nóng)桿菌接種外植體的農(nóng)桿菌接種 將外植體先切成小塊，然后浸泡在制備好的農(nóng)桿將外植體先切成小塊，然后浸泡在制備好的農(nóng)桿菌菌液中，浸泡一定時(shí)間后，然后用無(wú)菌濾紙吸干菌菌液中，浸泡一定時(shí)間后，然后用無(wú)菌濾紙吸干 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 1，浸泡時(shí)間：浸泡時(shí)間：時(shí)間太長(zhǎng)，外植體因農(nóng)桿菌的毒害時(shí)間太長(zhǎng)，外植體因農(nóng)桿菌的毒害缺氧而軟腐，一般缺氧而軟腐，一般不超過(guò)不超過(guò)30

11、分鐘分鐘。 2，菌液濃度：菌液濃度：OD600 為為0.05-0.70之間。之間。5. 農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)共培養(yǎng)共培養(yǎng): 接種后的外植體培養(yǎng)在誘導(dǎo)愈傷組織接種后的外植體培養(yǎng)在誘導(dǎo)愈傷組織或不定芽分化的固體培養(yǎng)基上，在外植體細(xì)胞分或不定芽分化的固體培養(yǎng)基上，在外植體細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)的同時(shí)，農(nóng)桿菌在外植體切面也增殖生裂、生長(zhǎng)的同時(shí)，農(nóng)桿菌在外植體切面也增殖生長(zhǎng)，這二者共培養(yǎng)的過(guò)程。長(zhǎng)，這二者共培養(yǎng)的過(guò)程。 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)，并不侵入到植物細(xì)胞中，而農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)，并不侵入到植物細(xì)胞中，而是把是把T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，農(nóng)桿菌附著后不轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，農(nóng)桿菌附著后不能立即轉(zhuǎn)化，

12、只有在創(chuàng)傷部位生存能立即轉(zhuǎn)化，只有在創(chuàng)傷部位生存16小時(shí)之后的小時(shí)之后的菌株才能誘發(fā)腫瘤，共培養(yǎng)時(shí)間必須長(zhǎng)于菌株才能誘發(fā)腫瘤，共培養(yǎng)時(shí)間必須長(zhǎng)于16個(gè)小個(gè)小時(shí)。共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，農(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)，植物細(xì)時(shí)。共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，農(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)，植物細(xì)胞受到毒害而死亡。胡蘿卜一般為胞受到毒害而死亡。胡蘿卜一般為3天。天。6外植體的脫菌及選擇培養(yǎng)外植體的脫菌及選擇培養(yǎng) 脫菌培養(yǎng)脫菌培養(yǎng)，即把共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)移到含有，即把共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)移到含有脫菌抗生素的培養(yǎng)基上，以殺死或者抑制農(nóng)桿菌的脫菌抗生素的培養(yǎng)基上，以殺死或者抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。生長(zhǎng)。 常用的抗生素有：常用的抗生素有： 羧芐青霉素，頭孢霉素等使用

13、羧芐青霉素，頭孢霉素等使用濃度一般為濃度一般為500mg/L。選擇培養(yǎng)，選擇培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育存在著競(jìng)爭(zhēng)，如果轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)不起來(lái)，轉(zhuǎn)化就不存在著競(jìng)爭(zhēng)，如果轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)不起來(lái)，轉(zhuǎn)化就不能成功。因此選擇培養(yǎng)是轉(zhuǎn)基因必須的步驟。能成功。因此選擇培養(yǎng)是轉(zhuǎn)基因必須的步驟。常用的選擇壓力有常用的選擇壓力有：Km，Hyg,除草劑除草劑ppt等。等。 l將根癌農(nóng)桿菌菌株接入含有將根癌農(nóng)桿菌菌株接入含有50 g/L的的Km的的YEB培養(yǎng)基，培養(yǎng)基，28，200rpm/min搖搖床旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過(guò)夜，取床旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過(guò)夜，取02m1接種接種20 ml新鮮新鮮 YEB培養(yǎng)基

14、（含培養(yǎng)基（含 Km 50gml），旋），旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)至轉(zhuǎn)培養(yǎng)至 OD值為值為 06 左右。左右。離心離心10 min，棄上清，用，棄上清，用2-3mL的的附加乙酰丁香的的附加乙酰丁香酮酮 （AS）的）的MS共培養(yǎng)基共培養(yǎng)基(200uL乙酰丁香酮乙酰丁香酮 加入加入20mL MS共培養(yǎng)基共培養(yǎng)基)懸浮菌體，懸浮菌體，將菌液移入三角瓶，待用。將菌液移入三角瓶，待用。l在超凈工作臺(tái)上，將胡蘿卜愈傷組織切成小塊。在超凈工作臺(tái)上，將胡蘿卜愈傷組織切成小塊。l將愈傷組織小塊浸入步驟將愈傷組織小塊浸入步驟2所制備成的新鮮根癌農(nóng)桿菌菌液所制備成的新鮮根癌農(nóng)桿菌菌液中，并不時(shí)搖動(dòng)，中，并不時(shí)搖動(dòng)，20 min后吸

15、取菌液，并將愈傷組織置于無(wú)后吸取菌液，并將愈傷組織置于無(wú)菌濾紙上吸去多余菌液。菌濾紙上吸去多余菌液。l 隨即將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含隨即將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含 0.5mg/L 2，4-D MS固體培養(yǎng)基上，固體培養(yǎng)基上，26共培養(yǎng)共培養(yǎng)2-3 d，取出愈傷，用無(wú)菌濾紙吸去組織表面的菌，取出愈傷，用無(wú)菌濾紙吸去組織表面的菌液，并轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基，篩選抗性愈傷組織。液，并轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基，篩選抗性愈傷組織。l三天后進(jìn)行三天后進(jìn)行GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)。基因的瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)九實(shí)驗(yàn)九 植物體內(nèi)植物體內(nèi)GUS 基因的檢測(cè)基因的檢測(cè) 原理原理: GusA基因基因編碼編碼一葡糖苷酸酶基因一葡糖苷酸酶基因, 催化葡催化葡糖苷酸糖苷鍵水解糖苷酸糖苷鍵水解,其中很多水解產(chǎn)物具有發(fā)色團(tuán)或其中很多水解產(chǎn)物具有發(fā)色團(tuán)或形成熒光物質(zhì)，形成熒光物質(zhì)，可以用分光光度計(jì)、熒光劑和組織可以用分光光度計(jì)、熒光劑和組織化學(xué)法對(duì)其