毒理學(xué)新技術(shù)

1、會(huì)計(jì)學(xué)1毒理學(xué)新技術(shù)毒理學(xué)新技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件無(wú)菌條件：無(wú)菌條件：凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高效過濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺(tái)，紫外燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素 細(xì)胞生長(zhǎng)條件：細(xì)胞生長(zhǎng)條件：純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶， CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清細(xì)胞檢測(cè)條件：細(xì)胞檢測(cè)條件：倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀 ，微孔板震蕩器，高速離心機(jī)，移液器 細(xì)胞保存條件：細(xì)胞保存條件：液氮罐實(shí)驗(yàn)室安全：實(shí)驗(yàn)室安全：生物實(shí)驗(yàn)室安全，P1,P2,P3實(shí)驗(yàn)室安全風(fēng)淋室風(fēng)淋室:風(fēng)淋室是生物潔凈室的理想配套設(shè)備，它不僅可以清除人體和物品表面附著的塵埃，減少帶入潔凈室的灰塵量，而且兼有氣閘室的功能

2、，可防止非潔凈空氣的侵入。傳遞窗傳遞窗:該裝置是一種潔凈室的輔助設(shè)備，主要用于潔凈區(qū)與潔凈區(qū)，潔凈區(qū)與非潔凈區(qū)之間小件物品的傳遞，以減少潔凈室的開門次數(shù)，把對(duì)潔凈區(qū)的污染降低到最低程度。超凈工作臺(tái)的工作超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣，通過高驅(qū)動(dòng)空氣，通過高效濾器除去空氣中效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化氣得到凈化。凈化空氣徐空氣徐徐通過工作徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。 培培 養(yǎng)養(yǎng) 板板酶標(biāo)儀 微孔板震蕩器培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件l1 細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要l2 細(xì)胞的生存環(huán)境l 溫度: 37

3、 ，O2l CO2: 5%，CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-l pH: 7.2-7.4l 滲透壓l 3 無(wú)污染l 4 無(wú)毒細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無(wú)平衡鹽溶液：無(wú)Ca2+、Mg2+的緩沖液的緩沖液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至加水至1000 mll胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從

4、而使細(xì)胞分離。胰蛋白酶液濃度胞分離。胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過一越高，作用越強(qiáng)，但超過一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。定限度會(huì)損傷細(xì)胞。l胰蛋白酶是一種黃白色胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無(wú)粉末，用無(wú)Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+的的PBSPBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.250.25 。用濾。用濾器過濾除菌。器過濾除菌。l胰蛋白酶液消化時(shí)間：胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-102-10分鐘。分鐘。l用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用 消化液消化液：培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：l培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，培養(yǎng)基（培

5、養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。l天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基：l天然培養(yǎng)基有血清、血漿和組織提取液（如雞胚和牛胚天然培養(yǎng)基有血清、血漿和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。浸液）。l優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好l缺點(diǎn)：來(lái)源受限。缺點(diǎn)：來(lái)源受限。 成分復(fù)雜，成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染。易發(fā)生支原體污染合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。其它一

6、些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低 。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 缺少某些成分不能完全滿足細(xì)胞生長(zhǎng)需要。缺少某些成分不能完全滿足細(xì)胞生長(zhǎng)需要。如 TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。等。 無(wú)血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣無(wú)血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時(shí)。目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時(shí)還需添加血清。還需添加血清。 一般說來(lái)，含一般說來(lái)，含5小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死，但支持細(xì)胞多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死，但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加生長(zhǎng)一般需加 1

7、0血清血清l血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。l常用血清有胎牛血潔、小牛血情、兔血清、馬血清等常用血清有胎牛血潔、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。l優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。、支原體、病毒污染。l血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ，30 分鐘分鐘l血清的消毒：過濾除菌血清的消毒：過濾除菌l抗菌素的使用：抗菌素的使用：l 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可

8、能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。l 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。單位。l 慶大霉素：每毫升慶大霉素：每毫升100單位單位方便、廣譜、穩(wěn)定方便、廣譜、穩(wěn)定。l基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基 8080一一9595l血清血清 5 5一一2020l碳酸氫鈉碳酸氫鈉 2.0 g/L2.0 g/Ll青、鏈霉素青、鏈霉素 各各100100單位毫升單位毫升完全培養(yǎng)基的組成完全培養(yǎng)基的組成 RPMI-1640RPMI-1640培養(yǎng)粉培養(yǎng)粉 1 1袋袋 碳酸氫鈉碳酸氫鈉 2.0 g2.

9、0 g 青、鏈霉素青、鏈霉素 各各100100單位毫升單位毫升 加三蒸水加三蒸水 至至 1000ml, 1000ml, 過濾除菌；過濾除菌； 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHpH值至值至7.27.2； 加血清（終濃度加血清（終濃度 1010）。）。 培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制主要培養(yǎng)基主要培養(yǎng)基MEM：低限量：低限量Eagle培養(yǎng)基培養(yǎng)基DMEM：貼壁細(xì)胞：貼壁細(xì)胞IMDM：密度低、生長(zhǎng)困難細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞：密度低、生長(zhǎng)困難細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞RPMI1640：懸浮、腫瘤、原代、傳代等細(xì)胞：懸浮、腫瘤、原代、傳代等細(xì)胞199、109培養(yǎng)基：原代培養(yǎng)、難以培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基：原代培養(yǎng)、難以培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)

10、基本技術(shù)無(wú)菌操作技術(shù)無(wú)菌操作技術(shù) 體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件?！九囵B(yǎng)前準(zhǔn)備培養(yǎng)前準(zhǔn)備】 在開始實(shí)驗(yàn)前要在開始實(shí)驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點(diǎn)無(wú)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點(diǎn)無(wú)誤后將其放置操作場(chǎng)所誤后將其放置操作場(chǎng)所( (培養(yǎng)室、超凈臺(tái)培養(yǎng)室、超凈臺(tái)) )內(nèi)，然后內(nèi)，然后開始消毒。避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取開始消毒。避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)。而增加污染機(jī)會(huì)?！静僮髋c消毒操

11、作與消毒】 無(wú)菌培養(yǎng)室每天都要用無(wú)菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%0.2%的新潔爾滅拖洗地的新潔爾滅拖洗地面面次次( (專用拖布專用拖布) )，紫外線照射消毒，紫外線照射消毒30-50min30-50min，超，超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用7575酒精擦洗。然后紫酒精擦洗。然后紫外線消毒外線消毒30min30min。在工作臺(tái)面消毒時(shí)切勿將培養(yǎng)細(xì)胞在工作臺(tái)面消毒時(shí)切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外線，物品不要重疊放置。和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外線，物品不要重疊放置。移移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%75%酒精擦洗后酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫

12、外線消毒。置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒?！净鹧嫦净鹧嫦尽?首先要點(diǎn)燃酒精燈。按裝吸管帽、打開或首先要點(diǎn)燃酒精燈。按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。進(jìn)行。 【操作操作】 進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)。必太快，以防空氣流動(dòng)。培養(yǎng)細(xì)胞的觀察培養(yǎng)細(xì)胞的觀察肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)細(xì)胞計(jì)數(shù)：細(xì)胞計(jì)數(shù)： 1 1、將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。、將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。 2 2

13、、吸少許細(xì)胞懸液，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋、吸少許細(xì)胞懸液，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。片和計(jì)數(shù)板之間。 3 3、靜置、靜置3 3分鐘。分鐘。 4 4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)只計(jì)左側(cè)和上方左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：的。然后按下式計(jì)算：細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)/ml/ml4 4大格細(xì)胞總數(shù)大格細(xì)胞總數(shù)/ 4/ 41000010000注意：若兩個(gè)以上的細(xì)胞團(tuán)，按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)注意：若兩個(gè)以上的細(xì)胞團(tuán)，按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占胞團(tuán)占10%10%以上，需重新制備細(xì)胞懸液。以上，需重新制備細(xì)胞懸液。細(xì)胞傳代方法細(xì)胞

14、傳代方法培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特征培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特征植物輸導(dǎo)水分的細(xì)胞植物輸導(dǎo)水分的細(xì)胞哺乳類的肌肉細(xì)胞哺乳類的肌肉細(xì)胞人類脊髓神經(jīng)細(xì)胞人類脊髓神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型 （一）貼附型：（一）貼附型： 大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，大致分成以下四型：培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過程培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過程 （一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期（Life Span of Culture Cells）所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。 1 1原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)期期即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段

15、，一般持續(xù)代階段，一般持續(xù)1一一4周。與體內(nèi)原組織周。與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。各細(xì)在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，依存性強(qiáng)，獨(dú)立胞的遺傳性狀互不相同，依存性強(qiáng)，獨(dú)立生存性差。生存性差。2 2傳代期：傳代期：初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)細(xì)胞系胞系。呈二倍體核型的細(xì)胞稱。呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞二倍體細(xì)胞系系。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當(dāng)傳代當(dāng)傳代1050次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢

16、，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。 3衰退期：衰退期：生存，但增殖慢或不增殖；最后衰退凋亡。生存，但增殖慢或不增殖；最后衰退凋亡。由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性永生性即細(xì)胞獲持久即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無(wú)限細(xì)胞系無(wú)限細(xì)胞系，主要，主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成后，核型大多變成異倍體異倍體。（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期（二）組織培養(yǎng)

17、細(xì)胞一代生存期所謂細(xì)胞“一代”一詞，系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代（Generation）或倍增Doubling）不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增36次。細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個(gè)階段：2指數(shù)增生期（指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase）：）：這是細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多這是細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛與否的一個(gè)重

18、要標(biāo)志。一般以旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂指數(shù)細(xì)胞分裂指數(shù)表表示，即細(xì)胞群中每示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%0.5%，初代細(xì)胞分裂指，初代細(xì)胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)數(shù)低，連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%5%。 在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)35天天后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長(zhǎng)空間漸趨減少、最后細(xì)胞后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長(zhǎng)空間漸趨減少、最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸

19、后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱接觸抑制接觸抑制（Contact Inhibition）。）。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營(yíng)養(yǎng)充細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營(yíng)養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生生密度抑制密度抑制（De

20、nsity Inhibition），導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。），導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。 3停滯期（停滯期（Stagnate Phase）：）：細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺(tái)期平臺(tái)期（Plateau）。）。此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。傳代過晚變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)。在這種（已有中毒跡象）能影響下一

21、代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)。在這種情況下，雖進(jìn)行了傳代，因細(xì)胞已受損，需要恢復(fù)，至少情況下，雖進(jìn)行了傳代，因細(xì)胞已受損，需要恢復(fù)，至少還要再傳還要再傳12兩代，通過換液淘汰死細(xì)胞和使受損輕微的兩代，通過換液淘汰死細(xì)胞和使受損輕微的細(xì)胞得以恢復(fù)后，才能再用。細(xì)胞得以恢復(fù)后，才能再用。 體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)在動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營(yíng)養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新營(yíng)養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代（Passage或Subculture）。 體外培養(yǎng)細(xì)胞的種類體外培養(yǎng)細(xì)胞的種類 （一）初代培養(yǎng) 初代培養(yǎng)又稱原代培養(yǎng)，即

22、直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進(jìn)行傳代培養(yǎng)（Subculture）的細(xì)胞，便不再稱為初代培養(yǎng)，而改稱為細(xì)胞系。 （二）細(xì)胞系 初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱之為細(xì)胞系。如細(xì)胞系的生存期有限，則稱之為有限細(xì)胞系（Finite Cell Line）；已獲無(wú)限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系，稱連續(xù)細(xì)胞系或無(wú)限細(xì)胞系（Infinite Cell Line）。無(wú)限細(xì)胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細(xì)胞，因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。無(wú)限細(xì)胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接觸抑制和無(wú)異體接種致癌性；有的不僅有永生性，異體接種也有致瘤性，

23、說明已惡性化。 （三）細(xì)胞株 從一個(gè)經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì)胞株。再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱之為亞株（Substrain） （四）二倍體細(xì)胞 細(xì)胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細(xì)胞染色體數(shù)相同細(xì)胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細(xì)胞染色體數(shù)相同或基本相同（或基本相同（2n細(xì)胞占細(xì)胞占75或或80以上）的細(xì)胞群，稱以上）的細(xì)胞群，稱二二倍體細(xì)胞培養(yǎng)倍體細(xì)胞培養(yǎng)。如僅數(shù)目相同，而核型不同的即染色體形。如僅數(shù)目相同，而核型不同的即染色體形態(tài)有改變者為態(tài)有改變者為假二倍體假二倍體。二倍體細(xì)胞在正常情況下具有限。二倍

24、體細(xì)胞在正常情況下具有限生命期，故屬有限細(xì)胞系。但隨供體年齡和組織細(xì)胞的不生命期，故屬有限細(xì)胞系。但隨供體年齡和組織細(xì)胞的不同，二倍體細(xì)胞的壽命長(zhǎng)短各異。同，二倍體細(xì)胞的壽命長(zhǎng)短各異。人胚肺成纖維細(xì)胞可傳人胚肺成纖維細(xì)胞可傳50代土代土10代，人胚腎只有代，人胚腎只有810代，人胚神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞代，人胚神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞1530代代。由不同年齡供體取材建立的二倍體細(xì)胞系可供研。由不同年齡供體取材建立的二倍體細(xì)胞系可供研究衰老之用。為保持二倍體細(xì)胞能長(zhǎng)期被利用，一般在初究衰老之用。為保持二倍體細(xì)胞能長(zhǎng)期被利用，一般在初代或代或25代即大量?jī)龃孀鳛榇创罅績(jī)龃孀鳛樵N（原種（Stook Cells），用時(shí)

25、再，用時(shí)再進(jìn)行繁殖，用后再繼續(xù)凍存，可供長(zhǎng)期使用或延緩細(xì)胞的進(jìn)行繁殖，用后再繼續(xù)凍存，可供長(zhǎng)期使用或延緩細(xì)胞的衰老。衰老。 （五）遺傳缺陷細(xì)胞 從有先天遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細(xì)胞）培養(yǎng)的細(xì)胞，或用人工方法誘發(fā)突變的細(xì)胞，都屬遺傳缺欠細(xì)胞。這類細(xì)胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。 （六）腫瘤細(xì)胞系或株（六）腫瘤細(xì)胞系或株 這是現(xiàn)有細(xì)胞系中最多的一類，我國(guó)已建這是現(xiàn)有細(xì)胞系中最多的一類，我國(guó)已建細(xì)胞系主要為這類細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤細(xì)胞系主要為這類細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細(xì)胞，常已傳幾十代或百建成，多呈類上皮型細(xì)胞，常已傳幾十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。

26、代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。 細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名 HeLa：為供體患者的姓名（來(lái)源于宮頸癌）：為供體患者的姓名（來(lái)源于宮頸癌）CHO：中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞（：中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞（Chinese Hamster Ovary）宮宮-743：宮頸癌上皮細(xì)胞，：宮頸癌上皮細(xì)胞，1974年年3月建立月建立NIH3T3：美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（：美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institute of Health）建立；每）建立；每3天傳代，每次接種天傳代，每次接種3105細(xì)胞毫升。細(xì)胞毫升。肉眼見不到的污染可影響細(xì)胞的代謝。%100植入細(xì)胞數(shù)目克隆數(shù)目 肝勻槳離心，10000g 20 min

27、上清液 沉淀離心，10500g 1h沉淀 （微粒體） 上清液棄去肝勻槳 離心，460g 10 min上清液 沉淀(包括細(xì)胞核，紅細(xì)胞離心，12500g 10 min 及大的細(xì)胞碎片)沉淀 （含有線粒體） 上清液 棄去整個(gè)制備過程應(yīng)在1h內(nèi)完成 細(xì)胞碎片和紅細(xì)胞 大量完整的線粒體和一些溶酶體大量完整的線粒體和一些溶酶體 一些破的線粒體和微粒體 normal，l血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。l常用血清有胎牛血潔、小牛血情、兔血清、馬血清等常用血清有胎牛血潔、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。l優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)