蛋白質純化及常用設備簡介

1、匯報人：李保健 牛瑩瑩1蛋白質純化原則2蛋白質純化的前處理3蛋白質純化的粗分離4蛋白質純化的細分離5純化過程的注意事項CONTENTS目錄蛋白純化要利用不同蛋白間內在的相似性與差異，利用各種蛋白間的相似性來除去非蛋白物質的污染，而利用各蛋白質的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學活性都會有差異，利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來得到重組蛋白。(一)材料的預處理及細胞破碎 分離提純某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來并保持原來的天然狀態(tài)，不喪失活性。所以要采用適當的方法將組織和細胞破碎。機械破碎法機械破碎法滲

2、透破碎法滲透破碎法這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。反復凍融法反復凍融法酶法酶法超聲波法超聲波法自溶法自溶法表面活性劑處表面活性劑處理法理法這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設備有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。生物組織經凍結后，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜采用此法。使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。如用溶菌酶破壞微生物細胞。利用組織細胞和微生物的自身酶系，在一定的pH值和溫度下，使細胞裂解在適當的溫度、pH值和低離子強度的條件下，表面活性劑能與脂蛋白形成微泡，使細胞膜通透性改變而導致細胞溶解破碎組

3、織細胞的常用方法破碎組織細胞的常用方法反復凍融法： 將待破碎的細胞置-20冰箱內完全凍結，然后在室溫融化，如此反復2-3次，大部分組織細胞及細胞內顆粒可被融破，此法主要適用于對組織細胞的處理。如果要提取細菌或病毒中的蛋白或核酸，可用類似的冷熱交替法，先將細胞置于沸水浴中，90左右維持數分鐘，然后立即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分細胞被破碎。超聲破碎法： 利用超聲波的機械振動使流體形成局部減壓發(fā)生內部流動、漩渦生成和消失，產生足以使細胞破碎的壓力。超聲波所使用的頻率為1-20kHz不等。一次超聲處理1-2分鐘，總時間為10-15分鐘。 優(yōu)點:超聲破碎法操作簡單、省時且作用較溫和，一般組織細胞皆

4、易破碎，而細菌，尤其是真菌的厚膜孢子則較難打破。超聲破碎時需間歇進行，以避免長時間產熱使抗原破壞自溶法： 利用組織細胞和微生物的自身酶系，在一定的pH值和溫度下，使細胞裂解。動物組織細胞自溶的溫度常選用0-4，對微生物常選用室溫。自溶時需加入少量防腐劑，如甲苯、氯仿等疊氮鈉能抑制美的活力，不宜使用。酶處理法： 溶菌酶在堿性條件下，能溶解革蘭陽性菌的細胞壁，有EDTA存在時，溶菌酶也能溶解某些革蘭氏陰性菌的細胞壁；纖維素酶主要溶解真菌細胞壁；蝸牛酶能溶解酵母菌細胞壁和植物細胞壁。優(yōu)點：酶處理法具有作用條件溫和，內含物成分不易受破壞，細胞壁損壞程度可以控制等特點表面活性劑處理法： 在適當的溫度、p

5、H值和低離子強度的條件下，表面活性劑能與脂蛋白形成微泡，使細胞膜通透性改變而導致細胞溶解。常用的表面活性劑有SDS、去氧膽酸鈉、二乙基十六烷基溴、吐溫、Triton-100等。本法作用較溫和，多用于細菌的破碎組織搗碎機：使用時，將材料配成稀組織搗碎機：使用時，將材料配成稀糊狀液，放置于筒內約糊狀液，放置于筒內約1/3體積，蓋緊體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關后，逐步加速至所需速度。一般開關后，逐步加速至所需速度。一般用于動物組織、植物肉質種子、柔嫩用于動物組織、植物肉質種子、柔嫩的葉芽等，轉速可高達的葉芽等，轉速可高達10000rpm/M以以上。由

6、于旋轉刀片的機械切力很大上。由于旋轉刀片的機械切力很大,制制備一些較大分子如核酸則很少使用備一些較大分子如核酸則很少使用。組織勻漿機：使用時將材料剪成小組織勻漿機：使用時將材料剪成小塊或顆粒狀加入適量緩沖液，放置塊或顆粒狀加入適量緩沖液，放置于勻漿機下玻璃杯內不超過于勻漿機下玻璃杯內不超過2 /3體體積，固定好將刀頭伸入液面之下，積，固定好將刀頭伸入液面之下，逐步加速至所需速度，使用用時應逐步加速至所需速度，使用用時應間接使用時間以連續(xù)間接使用時間以連續(xù)3分鐘為限，分鐘為限，連續(xù)工作連續(xù)工作3分鐘后，停止分鐘后，停止5分鐘后方分鐘后方可使用。可使用。蛋白質粗制品的獲得 選用適當的方法將所要的蛋

7、白質與其它雜蛋白分離開來。 比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離。蛋白質粗制品的獲得常用方法透析萃取鹽析法等電點沉淀法離心有機溶劑沉淀法 離心： 是經常和其它方法聯合使用的一種分離蛋白質的方法。當蛋白質和雜質的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開。分為差速離心法和密度梯度離心法1. 差速沉降離心法： 這是最普通的離心法。即采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進行離心，使沉降速度不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。此法一般用于分離沉降系數相差較大的顆粒。 差速離心首先要選擇好顆粒沉降所需的離心力和離心時間。當以一定的離心力在一定的離心時間內進行離心時，

8、在離心管底部就會得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉速下再進行離心，又得到第二部分較大較重顆粒的沉淀及含較小和較輕顆粒的上清液，如此多次離心處理，即能把液體中的不同顆粒較好地分離開。此法所得的沉淀是不均一的，仍雜有其它成分，需經過23次的再懸浮和再離心，才能得到較純的顆粒。 此法主要由于組織勻漿液中分離細胞器和病毒，其優(yōu)點是：操作簡易，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉子。缺點是：須多次離心，沉淀中有夾帶，分離效果差，不能一次得到純顆粒，沉淀于管底的顆粒受擠壓，容易變性失活2. 密度梯度區(qū)帶離心法（簡稱區(qū)帶離心法）： 區(qū)帶離心法是將樣品加在惰性梯度介質中進

9、行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。此法的優(yōu)點是：分離效果好，可一次獲得較純顆粒；適應范圍廣，能象差速離心法一樣分離具有沉降系數差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒；顆粒不會擠壓變形，能保持顆?；钚?，并防止已形成的區(qū)帶由于對流而引起混合。 此法的缺點是：離心時間較長；需要制備惰性梯度介質溶液；操作嚴格，不易掌握。 離心管先裝好密度梯度介質溶液，樣品液加在梯度介質的液面上，離心時，由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層，按不同沉降速度向管底沉降，離心一定時間后，沉降的顆粒逐漸分開，最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶，沉降系數越大，往下沉

10、降越快，所呈現的區(qū)帶也越低，離心必須在沉降最快的大顆粒到達管底前結束，樣品顆粒的密度要大于梯度介質的密度。梯度介質通常用蔗糖溶液，其最大密度和濃度可達1.28 kg/cm3和60。 此離心法的關鍵是選擇合適的離心轉速和時間 。透析法： 是利用小分子物質在溶液中可通過半透膜，而大分子物質不能通過半透膜的性質，達到分離的方法。例如分離和純化皂甙、蛋白質、多肽、多糖等物質時，可用透析法以除去無機鹽、單糖、雙糖等雜質。反之也可將大分子的雜質留在半透膜內，而將小分子的物質通過半透膜進入膜外溶液中，而加以分離精制透析是否成功與透析膜的規(guī)格關系極大。透析膜的膜孔有大有小，要根據欲分離成分的具體情況而選擇。透

11、析膜有動物性膜、火棉膠膜、羊皮紙膜（硫酸紙膜）、蛋白質膠膜、玻璃紙膜等。常多用市售的玻璃紙或動物性半透膜扎成袋狀，外面用尼龍網袋加以保護，小心加入欲透析的樣品溶液，懸掛在清水容器中。經常更換清水使透析膜內外溶液的濃度差加大，必要時適當加熱，并加以攪拌，以利透析速度加快。為了加快透析速度，還可應用電透析法，即在半在半透膜旁邊純溶劑兩端放置二個電極，接通電路，則透析膜中的帶有正電荷的成分如無機陽離子、生物堿等向陰極移動，而帶負電共荷的成分如無機陰離子、有機酸等則向陽極移動，中性化合物及高分子化合物則留在透析膜中。透析是否完全，須取透析膜內溶液進行定性反應檢查。萃?。狠腿?，又稱溶劑萃取或液液萃取，亦

12、稱抽提，是利用系統中組分在溶劑中有不同的溶解度來分離混合物的單元操作。即，是利用物質在兩種互不相溶（或微溶）的溶劑中溶解度或分配系數的不同，使溶質物質從一種溶劑內轉移到另外一種溶劑中的方法。是分離和提純有機化合物常用的一種方法,而雙水相萃取和反膠團萃取可以用來分離蛋白質。雙水相萃取技術：是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,由于被分離物在兩相中分配的不同,便可實現分離,被廣泛用于生物化學、細胞生物學和生物化工等領域的產品分離和提取。此方法可以在室溫環(huán)境下進行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質的穩(wěn)定性,收率較高。對于細胞內的蛋白質,需要先對細胞進行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到濃縮

13、,細胞碎片等固體物分布在下相中。采用雙水相系統濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強度、鹽類型及濃度的影響反膠團萃取法：是利用反膠團將蛋白質包裹其中而達到提取蛋白質的目的。反膠團是當表面活性劑在非極性有機溶劑溶解時自發(fā)聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體。這種方法的優(yōu)點是萃取過程中蛋白質因位于反膠團的內部而受到反膠團的保護。鹽析法 向某些蛋白質溶液中加入某些無機鹽溶液后，可以降低蛋白質的溶解度，使蛋白質凝聚而從溶液中析出,這種作用叫作鹽析，是物理變化，可復原。向某些蛋白質溶液中加入某些重金屬鹽，可以使蛋白質性質發(fā)生改變而凝聚，進而從溶液中析出，這種作用叫作變性，性質改變，是化學反應

14、，無法復原。 不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質仍保持其天然性質，并能再度溶解而不變性。 機理：通過破壞蛋白質分子表面水膜或中和蛋白質分子表面水膜使蛋白質凝聚沉淀。鹽析用中性鹽的選擇 （1）常用的中性鹽常用的中性鹽有MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4、NaH2PO4。 （2）選擇中性鹽應注意的問題使酶沉淀完全、收率高；且有利于酶的提純，而本身又易去除。對酶無毒性，應用不受影響。價格低廉。廢水處理容易。 鹽析法的優(yōu)點成本低，不需要什么特別昂貴的設備；操作簡單，安全；對許多生物活性物質具有穩(wěn)定作用。鹽析法的缺點沉淀物中含有大

15、量的鹽析劑。 有機溶劑沉淀法 有機溶劑的沉淀作用主要是降低水溶液的介電常數，溶液的介電常數減少就意味著溶質分子異性電荷庫侖引力的增加從而使溶解度減少。機理:中性有機溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數比水低。能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低，進而從溶液中沉淀出來，因此可用來沉淀蛋白質。此外，有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層，促使蛋白質分子變得不穩(wěn)定而析出。由于有機溶劑會使蛋白質變性，使用該法時，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機溶劑濃度。有機溶劑的選擇有機溶劑沉淀蛋白質的能力隨蛋白質種類及有機溶劑的種類而異。對曲霉淀粉酶而言，有機溶劑沉淀能力，依次為丙酮異丙醇乙醇甲醇。這個順序還受溫度、

16、pH、鹽離子濃度的影響。丙酮沉淀能力最強，但揮發(fā)損失多，價格相對較高，工業(yè)上一般采用乙醇。 有機溶劑優(yōu)點分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質或其他溶質只有在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內沉淀。沉淀不用脫鹽，過濾比較容易。在生化制備中應用比鹽析法廣泛。有機溶劑缺點容易引起蛋白質變性失活，操作常需在低溫下進行。且有機溶劑易燃、易爆、安全要求較高。 等電點沉淀法： 不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉淀法使它們相互分離。機理：等電點沉淀法主要利用兩性分子上的電中性時溶解度最低，而各種兩性分子具有不同等電點而進行分離的一種方法。兩性分子在處于等電點時的pH值，再加上其他沉淀因素，則很易沉淀析出。 等電點沉

17、淀法的優(yōu)點 很多蛋白質的等電點都在偏酸性范圍內，而無機酸通常價較廉，井且某些酸，如磷酸、鹽酸和硫酸的應用能為蛋白質類食品所允許。同時，?？芍苯舆M行其他純化操作，無需將殘余的酸除去。等電點沉淀法的缺點 酸化時，易使蛋白質失活，這是由于蛋白質對低pH比較敏感。 蛋白質細制品的獲得常用方法結晶結晶親和層析親和層析凝膠過濾凝膠過濾離子交換層析離子交換層析吸附層析吸附層析蛋白電泳蛋白電泳色譜色譜凝膠過濾層析 凝膠過濾層析法又稱排阻層析或分子篩方法，主要是根據蛋白質的大小和形狀，即蛋白質的質量進行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯的聚糖（如葡聚糖或瓊脂糖）類物質，使蛋白質混合

18、物中的物質按分子大小的不同進行分離。也叫做分子排阻層析。緩沖液緩沖液大分子不能進入凝膠顆粒內部，直大分子不能進入凝膠顆粒內部，直接沿凝膠顆粒間隙流出，流程短，接沿凝膠顆粒間隙流出，流程短，故先洗脫出來故先洗脫出來;小分子則擴散進入凝膠微孔，流程小分子則擴散進入凝膠微孔，流程長，在柱內保留時間長，則后洗脫長，在柱內保留時間長，則后洗脫出來出來G-25凝膠顆粒凝膠顆粒大分子大分子小分子小分子機理機理:凝膠過濾法的分子篩效應凝膠過濾法的分子篩效應樣本樣本大分子大分子小分子小分子凝膠顆粒凝膠顆粒凝膠柱的使用及層析過程凝膠的選擇：根據實驗目的不同選擇不同型號的凝膠。如果實驗目的是將樣品中的大分子物質和小

19、分子物質分開，由于它們在分配系數上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用SephadexG-25和G-50。 柱的直徑與長度根據經驗，組別分離時，大多采用2-30cm長的層析柱凝膠柱的制備凝膠型號選定后，將干膠顆粒懸浮于5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細的小顆粒傾瀉出去。加樣和洗脫凝膠床經過平衡后，在床頂部留下數亳升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。 凝膠柱的重復使用、凝膠回收與保存一次裝柱后可以反復使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。凝膠過濾層析的優(yōu)點 它的突出優(yōu)點是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當廣的溫度范圍下進行，

20、不需要有機溶劑，并且對分離成分理化性質的保持有獨到之處。對于高分子物質有很好的分離效果。凝膠過濾層析的缺點 從凝膠過濾的原理可知，蛋白質分子通過凝膠柱的速度(即洗脫體積的大小)并不直接取決于分子的質量，而是它的斯篤克半徑，利用凝膠過濾法測定蛋白質分子量時，標準蛋白質(已知分子量和斯篤克半徑)和待測蛋白質必須具有相同的分子形狀(接近球體)，否則不能得到比較準確的分子量。分子形狀為線形的或與凝膠能發(fā)生吸附作用的蛋白質，則不能用此方法測定分子量。而且柱子成本比較高，整個實驗過程耗時很長。色譜： 又稱色層法或層析法，是一種物理化學分析方法，它利用不同溶質（樣品）與固定相和流動相之間的作用力（分配、吸附

21、、離子交換等）的差別，當兩相做相對移動時，各溶質在兩相間進行多次平衡，使各溶質達到相互分離。離子交換層析 離子交換層析是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法機理：離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂;而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。由于蛋白質有等電點，當蛋白質處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽

22、離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。離子交換層析缺點 1、會產生過量的再生廢液; 2、周期較長; 3、耗鹽量大; 4、有機物的存在會污染離子交換樹脂; 5、排出大量含鹽廢水易引起管道腐蝕。 此外，對于溶液中存在多種離子時，需要針對不同的目的離子選用不同的樹脂，普遍適用性差。吸附層析 吸附層析又稱色層法；是根據各種被分離組分在固定相和流動相的分配系數不同達到分離的目的的一種純化方法機理：利用被分離樣品中不同組分與吸附劑之間的吸附能力的差異進行分離。吸附力大的組分在柱子上保留時間長吸附力小的組分很快被洗脫，混合物在層析柱中分

23、離的過程實質上是吸附與解吸附的過程吸附層析的優(yōu)點 分離效率高、分析速度快、檢測靈敏度高、樣品用量少、易于自動化等優(yōu)點吸附層析的缺點 定性能力差親和層析 利用共價連接有特異配體的層析介質，分離蛋白質混合物中能特異結合配體的目的蛋白質或其他分子的層析技術機理：將具有特殊結構的親和分子制成固相吸附劑放置在層析柱中，當要被分離的蛋白混合液通過層析柱時，與吸附劑具有親和能力的蛋白質就會被吸附而滯留在層析柱中。那些沒有親和力的蛋白質由于不被吸附，直接流出，從而與被分離的蛋白質分開，然后選用適當的洗脫液， 改變結合條件將被結合的蛋白質洗脫下來，這種分離純化蛋白質的方法稱為親和層析。 利用共價連接有特異配體的

24、層析介質分離蛋白質混合物中能特異結合配體的目的蛋白或其它分子的層析技術。親和層析的優(yōu)點 親和色譜法具有高度的專一性，而且色譜過程簡單、快速，是一種理想的有效分離純化生物大分子的手段。親和層析具有高選擇性高活性回收率和高純度等特點。親和層析的優(yōu)點 載體 價格昂貴機械強度低配基的制備困難偶聯條件激烈需要使用劇毒的活化劑 等高效液相色譜儀： 高效液相色譜儀的系統由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱(固定相)內，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數，在兩相中作相對運動時，經過反復多次的吸附

25、-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據以圖譜形式打印出來。高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液，不受樣品揮發(fā)性的限制，流動相可選擇的范圍寬，固定相的種類繁多，因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質。 電泳：是指帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動，利用帶電粒子在電場中移動速度不同而達到分離的技術稱為電泳技術。電泳種類移動界面是將被分離的離子（如陰離子）混合物置于電泳槽的一端（如負極），在電泳開始前，樣品與載體電解質有清晰的界面。電泳開始后，帶電粒子向另一極（正極）移動，泳動速度最快的離子走在最前面，其他離子依電極速度快慢順序排列，形成不同的區(qū)帶。只有第一個區(qū)帶的界面是清晰的，達到完全分離，其中含有電泳速度最快的離子，其他大部分區(qū)帶重疊。區(qū)帶電泳是在一定的支持物上，于均一的載體電解質中，將樣品加在中部位置，在電場作用下，樣品中帶正或負電荷的離子分別向負或正極以不同速度移動，分離成一個個彼此隔開的區(qū)帶。區(qū)帶電泳按支持物的物理性狀不同，又可分為紙和其他纖維膜電泳、粉末電泳、凝膠電泳與絲線電泳。等電聚焦是將兩性電解質