生物信息的傳遞

1、第三章第三章 生物信息的傳遞生物信息的傳遞從從DNA到到RNA 1.RNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄2. 啟動子與轉(zhuǎn)錄其始啟動子與轉(zhuǎn)錄其始3. 原核生物與真核生物原核生物與真核生物mRNA的特征比較的特征比較4. 終止與抗終止終止與抗終止5.內(nèi)含子的剪接、編輯及化學(xué)修飾內(nèi)含子的剪接、編輯及化學(xué)修飾 基本要求： 掌握RNA轉(zhuǎn)錄的基本過程及相關(guān)的酶類 掌握原核生物與真核生物mRNA、啟動子的特征 了解真核生物內(nèi)含子的剪接、編輯及化學(xué)修飾 本章重點(diǎn)：本章重點(diǎn)： RNA的轉(zhuǎn)錄過程的轉(zhuǎn)錄過程:模板識別、起始、延長、終止四模板識別、起始、延長、終止四個階段，原核生物及真核生物的轉(zhuǎn)錄起始。個階段，原核生物及真核生物的轉(zhuǎn)錄

2、起始。 真核生物的真核生物的mRNA前體的剪接機(jī)制。前體的剪接機(jī)制。 第一節(jié)第一節(jié) RNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)翻譯翻譯轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制復(fù)制復(fù)制DNARNA是基因表達(dá)的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。是基因表達(dá)的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。 以以Double Strand DNA中的一條單鏈作為轉(zhuǎn)錄模板中的一條單鏈作為轉(zhuǎn)錄模板1. 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄(transcription):是指以是指以DNA為模板，在依賴于為模板，在依賴于DNA的的 RNA聚和酶催化下，以聚和酶催化下，以4中中NTP（ATP、 CTP、GTP和和UTP）為原料，合成）為原料，合成RNA 的過程。的過程。 有義鏈有義鏈 又稱

3、編碼鏈又稱編碼鏈 coding strand: 指不作模板的指不作模板的DNA單鏈單鏈反義鏈反義鏈 又稱模板鏈又稱模板鏈 template srand : 指作為模板進(jìn)行指作為模板進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄的鏈轉(zhuǎn)錄的鏈t 在依賴在依賴DNA的的RNA聚合酶作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄聚合酶作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄t AU、CG 合成合成RNA分子分子t 轉(zhuǎn)錄合成轉(zhuǎn)錄合成RNA鏈的方向?yàn)殒湹姆较驗(yàn)?3，模板單鏈模板單鏈DNA的極性的極性 方向?yàn)榉较驗(yàn)?5， 而非模板單鏈的極性方向與而非模板單鏈的極性方向與RNA鏈相鏈相 同，均為同，均為53。（書寫）。（書寫） t 基因轉(zhuǎn)錄方式為不對稱轉(zhuǎn)錄基因轉(zhuǎn)錄方式為不對稱轉(zhuǎn)錄(一條單鏈一條單鏈

4、DNA 為模板為模板,RNA 聚合酶的結(jié)合聚合酶的結(jié)合) RNA轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄與DNA復(fù)制比較有何異同？復(fù)制比較有何異同？ ？t2.轉(zhuǎn)錄的基本過程轉(zhuǎn)錄的基本過程 ： 模板識別、轉(zhuǎn)錄起始、延伸、終止模板識別、轉(zhuǎn)錄起始、延伸、終止 從啟動子從啟動子 (promoter)到終止子到終止子(terminator)稱為轉(zhuǎn)錄單稱為轉(zhuǎn)錄單 位位 (transcription unit) (轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)) 轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)即轉(zhuǎn)錄原點(diǎn)記為轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)即轉(zhuǎn)錄原點(diǎn)記為1，其，其5上游記為負(fù)值，下游上游記為負(fù)值，下游 記為正值記為正值 upstream start point downstream101101.模板識別 RN

5、A聚合酶與啟動子DNA雙鏈相互作用并與之相互相結(jié)合的過程(封閉型啟動子復(fù)合物封閉型啟動子復(fù)合物_ 開放型啟動子復(fù)合物開放型啟動子復(fù)合物) 轉(zhuǎn)錄泡：轉(zhuǎn)錄泡： RNApol 結(jié)合和轉(zhuǎn)錄的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄的DNA模板區(qū)域，模板區(qū)域，有有17bp左右左右 DNA形成解鏈區(qū)形成解鏈區(qū) 2. 轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始 就是就是RNARNA鏈上第一個核苷酸鍵的產(chǎn)生。鏈上第一個核苷酸鍵的產(chǎn)生。RNARNA聚合酶離開啟動子，沿著聚合酶離開啟動子，沿著DNADNA鏈移動并使新生鏈移動并使新生RNARNA鏈不斷鏈不斷延長的過程。延長的過程。 始終保持三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)始終保持三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu) RNARNA聚合酶與產(chǎn)物聚合酶與產(chǎn)物R

6、NARNA不解離不解離 底物底物NTPNTP不斷加到不斷加到RNARNA鏈的鏈的 3-OH 3-OH 端，端，RNARNA鏈不斷延伸鏈不斷延伸 形成一個磷酸二酯鍵后，核心酶向前滑動形成一個磷酸二酯鍵后，核心酶向前滑動 4. 4. 轉(zhuǎn)錄終止：轉(zhuǎn)錄終止： 當(dāng)當(dāng)RNARNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)時，鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)時，RNARNA聚合酶不再形成新的磷酸二脂鍵，聚合酶不再形成新的磷酸二脂鍵，RNA-DNARNA-DNA雜合物分離，雜合物分離，轉(zhuǎn)錄泡瓦解，轉(zhuǎn)錄泡瓦解，RNARNA鏈釋放下來。鏈釋放下來。3、 延伸過程延伸過程RNA鏈的延伸圖解鏈的延伸圖解3 5 RNA-DNA雜交螺旋雜交螺旋聚合酶的移

7、動方向聚合酶的移動方向新生新生RNA復(fù)鏈復(fù)鏈解鏈解鏈有義鏈有義鏈模板鏈（反義鏈）模板鏈（反義鏈）延長部位延長部位RNARNA合成過程合成過程起起始始雙鏈雙鏈DNA局部解開局部解開磷酸二酯磷酸二酯鍵形成鍵形成終止階段終止階段解鏈區(qū)到達(dá)解鏈區(qū)到達(dá)基因終點(diǎn)基因終點(diǎn)延長階段延長階段5 3 RNA 啟動子啟動子 終止子終止子5 RNA聚合酶聚合酶 5 3 5 3 5 5 3 離開離開識別識別3.RNA聚合酶聚合酶一、原核生物的一、原核生物的RNA polymerase (E. coli)1、全酶、全酶 (Holo Enzyme)和核心酶和核心酶(Core Enzyme)Core Enzyme Holo

8、Enzyme用于轉(zhuǎn)錄的起始，用于轉(zhuǎn)錄的起始，專一性地與專一性地與DNA序序列列(啟動子啟動子)結(jié)合結(jié)合 作用于轉(zhuǎn)錄的延伸過作用于轉(zhuǎn)錄的延伸過程（終止）程（終止）E. coli RNA polymerase用于起始和延伸用于起始和延伸只用于起始只用于起始36.5 KD36.5 KD151 KD155 KD11 KD70 KD使使RNA聚合酶全酶聚合酶全酶 識識別啟動子的別啟動子的Sextama Box(35區(qū)區(qū)),Editing 功能功能有義有義DNA鏈結(jié)合位點(diǎn)鏈結(jié)合位點(diǎn)促使促使RNApol 與與DNA模板鏈結(jié)合模板鏈結(jié)合由于各亞基的功能，使全酶本身含有五個功能位點(diǎn)由于各亞基的功能，使全酶本身含

9、有五個功能位點(diǎn) 有義有義DNA鏈結(jié)合位點(diǎn)（鏈結(jié)合位點(diǎn)（ 亞基提供）亞基提供） DNA/RNA雜交鏈結(jié)合位點(diǎn)（雜交鏈結(jié)合位點(diǎn)（亞基提供）亞基提供） 雙鏈雙鏈DNA解鏈位點(diǎn)（前端解鏈位點(diǎn)（前端 亞基提供）亞基提供） 單鏈單鏈DNA重旋位點(diǎn)（后端重旋位點(diǎn)（后端亞基提供）亞基提供） 因子作用位點(diǎn)因子作用位點(diǎn)第 二 節(jié)啟 動子與轉(zhuǎn)錄起始 一、啟動子（一、啟動子（promoter）的結(jié)構(gòu)與功能）的結(jié)構(gòu)與功能啟動子啟動子(promoter)：是指：是指DNA分子上被分子上被RNA聚合酶識別聚合酶識別 并結(jié)合形成起始轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的區(qū)域并結(jié)合形成起始轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的區(qū)域 ，它還包括一些調(diào)節(jié)，它還包括一些調(diào)節(jié) 蛋白因子

10、的結(jié)合位點(diǎn)蛋白因子的結(jié)合位點(diǎn) 轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)即轉(zhuǎn)錄原點(diǎn)記為轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)即轉(zhuǎn)錄原點(diǎn)記為1，其上游，其上游5記為負(fù)值，下游記為負(fù)值，下游 記為正值記為正值 upstream start point downstream10110 1.原核生物原核生物 RNA聚合酶的進(jìn)入位點(diǎn)聚合酶的進(jìn)入位點(diǎn) （1） Sextama 框（框（Sextama Box） -35序列，序列，RNA聚合酶的松弛（聚合酶的松弛（初始初始）結(jié)合位點(diǎn)，）結(jié)合位點(diǎn)， RNA聚合酶依靠其聚合酶依靠其亞基識別該位點(diǎn)亞基識別該位點(diǎn) 大多數(shù)啟動子中共有序列為大多數(shù)啟動子中共有序列為 T82T84G78A65C54A45 重要性重要性:很大程度上決定了

11、啟動子的強(qiáng)度很大程度上決定了啟動子的強(qiáng)度（2） Pribonow 框（框（Pribonow Box） -10序列，序列，RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點(diǎn)聚合酶的牢固結(jié)合位點(diǎn) 一致序列：一致序列：T80A95T45A60A50T96 （TATPUAT）因此又稱因此又稱TATA Box（3） 起始位點(diǎn)（起始位點(diǎn)（initiation site）：）：1位點(diǎn)位點(diǎn) RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)聚合酶的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 起始起始NTP多為多為ATP或或GTP 起始過程起始過程 ：1. 全酶與啟動子結(jié)合的封閉型啟動子復(fù)合物的形成全酶與啟動子結(jié)合的封閉型啟動子復(fù)合物的形成 （ R位點(diǎn)被位點(diǎn)被因子發(fā)現(xiàn)并結(jié)合因子發(fā)現(xiàn)并結(jié)合

12、 ） 2、 開放型啟動子復(fù)合物的形成開放型啟動子復(fù)合物的形成 RNApol的一個適合位點(diǎn)到達(dá)的一個適合位點(diǎn)到達(dá)10序列區(qū)域，誘導(dǎo)富序列區(qū)域，誘導(dǎo)富 含含AT的的Pribnow 框的框的“熔解熔解”， 形成形成1217bp的泡的泡狀狀 物，同時酶分子向物，同時酶分子向10序列轉(zhuǎn)移并與之牢固結(jié)合序列轉(zhuǎn)移并與之牢固結(jié)合 開放型啟動子復(fù)合物使開放型啟動子復(fù)合物使RNApol聚合酶定向聚合酶定向 兩種復(fù)合物均為二元復(fù)合物（全酶和兩種復(fù)合物均為二元復(fù)合物（全酶和DNA ）1217bp 3. 在開放型的啟動子復(fù)合物中，在開放型的啟動子復(fù)合物中，RNApol的的I位點(diǎn)和位點(diǎn)和E位點(diǎn)的位點(diǎn)的 核苷酸前體間形成第

13、一個磷酸二酯鍵（核苷酸前體間形成第一個磷酸二酯鍵（ 亞基）亞基） 三元復(fù)合物形成三元復(fù)合物形成 +1位多為位多為CAT模式模式,位于離開保守位于離開保守T 69 個核苷酸處個核苷酸處 -6-9 bp- GC T ATTGACATATAAT-16-18 bp-+1-35 sequence-10 sequence4. 因子解離因子解離 核心酶與核心酶與DNA的親和力下降的親和力下降 起始過程結(jié)束起始過程結(jié)束核心酶移動進(jìn)入延伸過程核心酶移動進(jìn)入延伸過程核心酶核心酶1217bp 5、 啟動子各位點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系啟動子各位點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系 （1）35 序列與序列與10 序列與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系序列與轉(zhuǎn)錄

14、效率的關(guān)系 標(biāo)準(zhǔn)啟動子標(biāo)準(zhǔn)啟動子 35 TTGACA 10 TATAAT（2） 35序列與序列與10序列的間隔區(qū)與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系序列的間隔區(qū)與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系 堿基序列并不重要堿基序列并不重要 間距非常重要間距非常重要，17bp的間距轉(zhuǎn)錄效率最高的間距轉(zhuǎn)錄效率最高 間距上的突變種類：間距上的突變種類： 間距趨向于間距趨向于17bp 上升突變上升突變 間距遠(yuǎn)離間距遠(yuǎn)離17bp 下降突變下降突變 則不同的啟動子則不同的啟動子 a. 與標(biāo)準(zhǔn)啟動子序列同源性越高與標(biāo)準(zhǔn)啟動子序列同源性越高 啟動強(qiáng)度越大啟動強(qiáng)度越大 b. 與標(biāo)準(zhǔn)啟動子同源性越低與標(biāo)準(zhǔn)啟動子同源性越低 啟動強(qiáng)度越小啟動強(qiáng)度越小 c. 與標(biāo)準(zhǔn)

15、啟動子差異很大時與標(biāo)準(zhǔn)啟動子差異很大時 由另一種由另一種因子啟動因子啟動原因原因: 35序列通過被序列通過被 因子識別的容易因子識別的容易 決定啟動子強(qiáng)度決定啟動子強(qiáng)度 10序列影響開放型啟動子復(fù)合物形成的速度序列影響開放型啟動子復(fù)合物形成的速度 決定啟動子強(qiáng)度決定啟動子強(qiáng)度 E.Coli各識別的啟動子的序列識別的啟動子的序列上節(jié)課總結(jié)上節(jié)課總結(jié):1、RNA的的 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄2、RNA聚合酶：原核生物聚合酶：原核生物RNApol：3、原核啟動子的結(jié)構(gòu)：、原核啟動子的結(jié)構(gòu)： RNApol進(jìn)入位點(diǎn)進(jìn)入位點(diǎn) 起始過程起始過程真核生物真核生物RNA聚合酶聚合酶真核生物真核生物RNA轉(zhuǎn)錄的啟動子轉(zhuǎn)錄的啟動子

16、 一、真核生物的一、真核生物的RNApol 1、 三種三種RNApol： 根據(jù)對根據(jù)對 - 鵝膏蕈堿的敏感性不同而分類鵝膏蕈堿的敏感性不同而分類 RNApol 最不敏感最不敏感 （動、植、昆）（動、植、昆） RNApol 最敏感最敏感 RNApol 不同種類的敏感性不同不同種類的敏感性不同 2、 位置和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物位置和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 RNApol 核仁核仁 活性所占比例最大活性所占比例最大 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄rRNA（5.8S、18S、 28S） RNApol 核質(zhì)核質(zhì) 主要負(fù)責(zé)主要負(fù)責(zé) hnRNA、snRNA 的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄 hnRNA（mRNA 前體，核不均一前體，核不均一RNA heterogeneous

17、nuclear RNA） snRNA（核內(nèi)小分子（核內(nèi)小分子 RNA small nulear RNA) RNApol 核質(zhì)核質(zhì) 負(fù)責(zé)負(fù)責(zé) tRNA、5S rRNA、Alu序列和序列和 部分部分 snRNA 目前在線粒體和葉綠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)少數(shù)目前在線粒體和葉綠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)少數(shù) RNApol（活性較低）（活性較低）3、亞基組成：、亞基組成： 分子量分子量500KDa,含兩個大亞基和含兩個大亞基和 712 個小亞基個小亞基 RNApol： 大亞基中有大亞基中有 C 末端結(jié)構(gòu)域末端結(jié)構(gòu)域 (carboxy terminal domain CTD) CTD中含一保守氨基酸序列的多個重復(fù)中含一保守氨基酸序列的多

18、個重復(fù) TyrSerProThrSerProSer C 端重復(fù)七肽端重復(fù)七肽 不同生物中重復(fù)數(shù)目不一樣（酶活性）不同生物中重復(fù)數(shù)目不一樣（酶活性）CTD參與轉(zhuǎn)錄參與轉(zhuǎn)錄 B A 使使 RNApol易于離開易于離開 啟動子進(jìn)入延伸過程（啟動子進(jìn)入延伸過程（10倍）倍）二、二、 真核生物的啟動子真核生物的啟動子 三種三種 RNApol 三種轉(zhuǎn)錄方式三種轉(zhuǎn)錄方式 三種啟動子三種啟動子 三類基因，三類基因，類類 類類 類類 A GCGCCCTATAAT-+1 -110 sequence -20-30 sequenceCAAT區(qū)區(qū)-40 1、 RNApol的啟動子的啟動子 結(jié)構(gòu)最復(fù)雜結(jié)構(gòu)最復(fù)雜 位于轉(zhuǎn)錄

19、起始點(diǎn)的上游位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游,有多個短序列元件組成有多個短序列元件組成 通用型啟動子（無組織特異性）通用型啟動子（無組織特異性） （1） 帽子位點(diǎn)（帽子位點(diǎn)（cap site）：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)）：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 與與Prok.的的“CAT模式模式”相似相似 （2） TATA框（框（Hogness 框或框或 Goldberg-Hogness 框）框） 位于位于30處處 一致序列為一致序列為T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37） 定位轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的功能定位轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的功能 （類似原核的（類似原核的Pribnow框）框） TATA是絕大多數(shù)真核基因的正確表達(dá)所必需的是絕大多數(shù)真

20、核基因的正確表達(dá)所必需的（3） CAAT框（框（CAAT box） 位于位于75bp處處 一致序列為一致序列為GGC/TCAATCT 前兩個前兩個 G 的作用十分重要的作用十分重要(轉(zhuǎn)錄效率轉(zhuǎn)錄效率) 增強(qiáng)啟動子的效率、頻率，不影響啟動子的特異性增強(qiáng)啟動子的效率、頻率，不影響啟動子的特異性 （距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的距離，正反方向）（距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的距離，正反方向） 以上三個保守序列在絕大多數(shù)啟動子中都存在以上三個保守序列在絕大多數(shù)啟動子中都存在 （4） 增強(qiáng)子（增強(qiáng)子（enhancer） 在在100以上以上 SV40的兩個正向重復(fù)研究得最清楚（的兩個正向重復(fù)研究得最清楚（DR） -107178 、179

21、 250 各各 72bp 該增強(qiáng)子的特點(diǎn)如下：該增強(qiáng)子的特點(diǎn)如下： 對依賴于對依賴于TATA框的轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)效應(yīng)高于不依賴框的轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)效應(yīng)高于不依賴 的情況的情況 距離效應(yīng)距離效應(yīng): 離離72bp越近的容易起始轉(zhuǎn)錄越近的容易起始轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄方向離開轉(zhuǎn)錄方向離開72bp的起始序列優(yōu)先轉(zhuǎn)錄的起始序列優(yōu)先轉(zhuǎn)錄 細(xì)胞類型的選擇：不同類型中作用有差異細(xì)胞類型的選擇：不同類型中作用有差異 表明其作用具有細(xì)胞或組織特異性（調(diào)節(jié)蛋白）表明其作用具有細(xì)胞或組織特異性（調(diào)節(jié)蛋白）（5） GC框框 （GC box） 位于位于90附近，較常見的成分附近，較常見的成分 核心序列為核心序列為GGGCGG 可有多個拷貝，也可

22、以正反兩方向排列可有多個拷貝，也可以正反兩方向排列（6）其他元件）其他元件 八聚核苷酸元件八聚核苷酸元件（octamer element OCT元件元件） 一致序列為一致序列為 ATTTGCAT KB元件元件 一致序列為一致序列為 GGGACTTTCC ATF元件元件 一致序列為一致序列為 GTGACGT 還有一些位于起始點(diǎn)下游的相關(guān)元件還有一些位于起始點(diǎn)下游的相關(guān)元件（7） 不同元件的組合情況不同元件的組合情況 不同元件的不同元件的數(shù)目、位置、和排列方向數(shù)目、位置、和排列方向均有差異均有差異 例如：例如：SV40的早期啟動子中有的早期啟動子中有6個個GC框框小結(jié)小結(jié)： 不同啟動子中不同啟動子

23、中每種元件與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的距離不同每種元件與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的距離不同 不同啟動子中的相應(yīng)元件互相交換不同啟動子中的相應(yīng)元件互相交換,形成的雜交形成的雜交 啟動子功能沒有變化啟動子功能沒有變化 各種元件將相應(yīng)的蛋白因子結(jié)合到啟動子上，各種元件將相應(yīng)的蛋白因子結(jié)合到啟動子上， 組成起始復(fù)合物，組成起始復(fù)合物，蛋白因子間的相互作用決定蛋白因子間的相互作用決定 了轉(zhuǎn)錄的起始了轉(zhuǎn)錄的起始 2、 RNApol 啟動子結(jié)構(gòu)啟動子結(jié)構(gòu) （1） 分為三類，每種識別方式不同分為三類，每種識別方式不同 a、 下游啟動子（內(nèi)部啟動子）下游啟動子（內(nèi)部啟動子） 位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的下游位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的下游 5SRNA 和和 tR

24、NA基因基因 可分為兩類可分為兩類 b、 上游啟動子上游啟動子 snRNA（2）內(nèi)部啟動子的發(fā)現(xiàn)）內(nèi)部啟動子的發(fā)現(xiàn) 最早發(fā)現(xiàn)于非洲爪蟾的最早發(fā)現(xiàn)于非洲爪蟾的5S rRNA基因基因 試驗(yàn)設(shè)置：試驗(yàn)設(shè)置： 非洲爪蟾的卵母細(xì)胞提取液作為體外轉(zhuǎn)錄體系，非洲爪蟾的卵母細(xì)胞提取液作為體外轉(zhuǎn)錄體系， 進(jìn)行缺失試驗(yàn)進(jìn)行缺失試驗(yàn) 以不同長度的以不同長度的5S rRNA基因?yàn)槟０暹M(jìn)行轉(zhuǎn)錄基因?yàn)槟０暹M(jìn)行轉(zhuǎn)錄 結(jié)果：結(jié)果： 缺失缺失55以前和缺失以前和缺失80以后的序列都能正常轉(zhuǎn)錄以后的序列都能正常轉(zhuǎn)錄 缺失缺失55到到80序列不能轉(zhuǎn)錄序列不能轉(zhuǎn)錄 結(jié)論：結(jié)論： 5S rRNA基因的啟動子位于基因內(nèi)部基因的啟動子位于

25、基因內(nèi)部 該啟動子可使該啟動子可使RNApol在其上游的在其上游的55bp處起始轉(zhuǎn)錄處起始轉(zhuǎn)錄（3） 內(nèi)部啟動子分為兩類內(nèi)部啟動子分為兩類 均含兩個短序列元件，中間由其他序列隔開均含兩個短序列元件，中間由其他序列隔開 第一類：第一類： 含含A框和框和C框框 （5S rRNA基因）基因） 第二類：第二類： 含含A框和框和B框框 （tRNA基因、基因、VARNA基因）基因） 間隔序列長短差異很大間隔序列長短差異很大 其中內(nèi)部啟動子起被其中內(nèi)部啟動子起被 RNApol 識別的作用識別的作用 三、三、 真核生物轉(zhuǎn)錄的起始真核生物轉(zhuǎn)錄的起始 三種三種RNApol均沒有對啟動子特異序列的識別能力均沒有對啟

26、動子特異序列的識別能力 轉(zhuǎn)錄起始過程需要很多的輔助因子轉(zhuǎn)錄起始過程需要很多的輔助因子(轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子)參與參與, 并且按一定順序與并且按一定順序與DNA形成復(fù)合物形成復(fù)合物,協(xié)助協(xié)助RNApol定定 位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)RNApol TBP因子因子RNApol p74 RNApol 的轉(zhuǎn)錄起始的轉(zhuǎn)錄起始 兩種內(nèi)部啟動子的轉(zhuǎn)錄起始需要三種輔助因子兩種內(nèi)部啟動子的轉(zhuǎn)錄起始需要三種輔助因子 TFA 一種含鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白一種含鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白 TFB 由由TBP和和BRT、B” TFC 至少至少5個亞基以上個亞基以上 TBP 的作用的作用 所有所有 RNApol 的轉(zhuǎn)錄起始都需要的轉(zhuǎn)錄起始都需

27、要TBP 在在 RNApol的轉(zhuǎn)錄起始過程中的轉(zhuǎn)錄起始過程中,TBP是是SL1的的 組份，起定位組份，起定位RNApol的作用的作用 RNApol的轉(zhuǎn)錄起始由的轉(zhuǎn)錄起始由TBP識別識別TATA框框 TBP 起定位作用起定位作用,所以又稱定位因子所以又稱定位因子 （positioning factor）上節(jié)課內(nèi)容回顧上節(jié)課內(nèi)容回顧:1、RNApol在在DNA上結(jié)合位點(diǎn)的鑒定上結(jié)合位點(diǎn)的鑒定2、啟動子的各部位與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系、啟動子的各部位與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系3、真核生物、真核生物RNApol： 種類及各自轉(zhuǎn)錄的基因種類及各自轉(zhuǎn)錄的基因習(xí)題：習(xí)題：1.以E.coli為例，說出Prok.啟動子結(jié)構(gòu)及各部

28、分功能。 2、以Prok.為例簡述轉(zhuǎn)錄起始過程。第三節(jié)第三節(jié) 原核生物與真核生物原核生物與真核生物mRNAmRNA的特征比較的特征比較 mRNA的功能是把核內(nèi)DNA的堿基順序(遺傳信息),按照堿基互補(bǔ)的原則,抄錄并轉(zhuǎn)送至胞質(zhì),在蛋白質(zhì)合成中用以翻譯成蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序。一、原核生物一、原核生物mRNA mRNA 的特征的特征1.原核生物mRNA的半衰期短2.大多以多順反子的形式存在3.原核生物mRNA的5-端無帽子結(jié)構(gòu) 原核生物和真核生物mRNA結(jié)構(gòu)的比較二、真核生物二、真核生物mRNA mRNA 的特征的特征 1.大多數(shù)的真核mRNA轉(zhuǎn)錄后在5-端加一個7-甲基鳥苷,同時第一個核苷酸的

29、C2也是甲基化的,這種m7G ppp N m結(jié)構(gòu)被稱為帽子結(jié)構(gòu)(cap sequence)。 帽子結(jié)構(gòu)具有促進(jìn)核蛋白體與mRNA的結(jié)合、加速翻譯起始速度的作用,同時可以增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性。 二、二、mRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾的轉(zhuǎn)錄后修飾-帽子帽子 1、 帽子的種類帽子的種類 帽子帽子0（Cap-0） m7GpppXpYp-（共有）（共有） m7G N7甲基鳥苷甲基鳥苷 帽子帽子1 （Cap-1） m7GpppXmpYp- 第一個核苷酸的第一個核苷酸的 2-O 位上產(chǎn)生甲基位上產(chǎn)生甲基 化化 （A N6 位甲基化）位甲基化） 帽子帽子2（Cap-2） m7GpppXmpYmp 第二個核苷酸的第二個核

30、苷酸的 2-O 位上產(chǎn)生甲基位上產(chǎn)生甲基 化（化（A、G、C、U）HNCH3m7G帽子帽子0其中其中: 單細(xì)胞真核生物只有單細(xì)胞真核生物只有 Cap0 Cap1 是其余真核生物的主要帽子形式是其余真核生物的主要帽子形式 Cap2 存在于某些真核生物中存在于某些真核生物中2、 帽子結(jié)構(gòu)的生成帽子結(jié)構(gòu)的生成 甲基供體都為甲基供體都為S腺苷甲硫氨酸（腺苷甲硫氨酸（SAM） RNA鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶-戴帽酶（戴帽酶（capping enzyme） 3、 帽子結(jié)構(gòu)的功能帽子結(jié)構(gòu)的功能 （1） 對翻譯起識別作用對翻譯起識別作用-為核糖體識別為核糖體識別RNA提供信號提供信號 Cap0 的全部都是識別

31、的重要信號的全部都是識別的重要信號 Cap1,2 的甲基化能增進(jìn)識別的甲基化能增進(jìn)識別 （2） 增加增加mRNA 的穩(wěn)定性，使的穩(wěn)定性，使5端免遭外切核酸酶的攻擊端免遭外切核酸酶的攻擊 （3） 與某些與某些RNA病毒的正鏈合成有關(guān)病毒的正鏈合成有關(guān) （Cap1、 Cap2 ） 除帽子結(jié)構(gòu)外的除帽子結(jié)構(gòu)外的Euk.mRNA內(nèi)部甲基化內(nèi)部甲基化m6A形式形式三、三、mRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾的轉(zhuǎn)錄后修飾二二- 多聚（多聚（A）尾巴）尾巴 1、 3端端-約長約長200bp (大多數(shù)大多數(shù)Euk.的的mRNA) （poly(A)+ poly(A)- ） 最近研究發(fā)現(xiàn)，原核生物的最近研究發(fā)現(xiàn)，原核生物的RNA

32、轉(zhuǎn)錄后也有轉(zhuǎn)錄后也有3添加添加 poly(A) 的現(xiàn)象的現(xiàn)象 E.coli 的的poly(A)+聚合酶早在聚合酶早在1962年就已發(fā)現(xiàn)年就已發(fā)現(xiàn) 2、 poly(A) 的生成的生成 a、 RNA末端腺苷酸轉(zhuǎn)移酶（末端腺苷酸轉(zhuǎn)移酶（poly(A) 聚合酶聚合酶）催化）催化 前體前體ATP反應(yīng)如下：反應(yīng)如下： 多聚核糖核酸多聚核糖核酸 + nATP Mg+ 或或 Mn+ 多聚核糖核酸多聚核糖核酸(A)n + nPPi b、添加位點(diǎn)、添加位點(diǎn) 內(nèi)切酶內(nèi)切酶(360KDa)切除一段序列切除一段序列 由由poly(A) 聚合酶聚合酶 催化添加催化添加poly(A)內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)（有其它因子參與）內(nèi)切酶

33、的識別位點(diǎn)（有其它因子參與） 切點(diǎn)上游切點(diǎn)上游 1320bp處的處的 AAUAAA 切點(diǎn)下游的切點(diǎn)下游的 GUGUGUG （單細(xì)胞（單細(xì)胞Euk.除外）除外） 3、 poly(A) 的功能的功能 c、對含、對含 poly(A) 的的mRNA 失去失去 poly(A) 可減弱其翻譯可減弱其翻譯 （1） 可能與核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)可能與核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān) （2） 與與mRNA的壽命有關(guān)的壽命有關(guān) （3） 與翻譯有關(guān)與翻譯有關(guān) a、 缺失可抑制體外翻譯的起始缺失可抑制體外翻譯的起始 b、 胚胎發(fā)育中，胚胎發(fā)育中，poly(A) 對其對其mRNA的翻譯有影的翻譯有影 響（非響（非poly(A) 化的為儲藏形式）化的

34、為儲藏形式）（4） poly(A) 在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中有很大應(yīng)用價值在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中有很大應(yīng)用價值 a、 也可將也可將 oligo (dT) 與載體相連，從總體與載體相連，從總體RNA中分離中分離 純化純化mRNAb、 用寡聚用寡聚dT（oligo (dT)）為引物，反轉(zhuǎn)錄合成）為引物，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第四節(jié)第四節(jié) 終止和抗終止終止和抗終止 終止過程：終止過程： 酶停止添加底物酶停止添加底物釋放釋放RNA鏈鏈酶解離酶解離 終止反應(yīng)終止反應(yīng)雜合雙鏈的氫鍵斷裂，雜合雙鏈的氫鍵斷裂， 重新形成雙螺旋，酶的解離。重新形成雙螺旋，酶的解離。 終止子（終止子（terminator）：在轉(zhuǎn)錄的過程中

35、，提供轉(zhuǎn)錄終止）：在轉(zhuǎn)錄的過程中，提供轉(zhuǎn)錄終止 信號的信號的RNA序列序列 真正起終止作用的是真正起終止作用的是RNA序列與啟動子不同序列與啟動子不同 Prok.和和Euk. 都具有一種基因表達(dá)調(diào)控的手段都具有一種基因表達(dá)調(diào)控的手段 一、原核生物的終止子一、原核生物的終止子 1、 終止子的種類終止子的種類 （1） 內(nèi)在終止子（不依賴內(nèi)在終止子（不依賴 因子的終止子）因子的終止子） 體外實(shí)驗(yàn)中，只有核心酶和終止子就足以使轉(zhuǎn)錄終止體外實(shí)驗(yàn)中，只有核心酶和終止子就足以使轉(zhuǎn)錄終止 （2） 依賴依賴因子的終止子因子的終止子 蛋白質(zhì)輔助因子蛋白質(zhì)輔助因子因子因子存在時，核心酶終止轉(zhuǎn)錄存在時，核心酶終止轉(zhuǎn)錄

36、 兩者有共同的結(jié)構(gòu)特征（序列差異）兩者有共同的結(jié)構(gòu)特征（序列差異）2、不依賴、不依賴 因子的終止子因子的終止子 結(jié)構(gòu)特征結(jié)構(gòu)特征: 一是形成一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)一是形成一個發(fā)夾結(jié)構(gòu) 莖莖. 720 bp的的IR序列形成（富含序列形成（富含G/C） 環(huán)環(huán).中間不重復(fù)序列形成中間不重復(fù)序列形成 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的突變可阻止轉(zhuǎn)錄的終止發(fā)夾結(jié)構(gòu)的突變可阻止轉(zhuǎn)錄的終止 二是二是6 8 個連續(xù)的個連續(xù)的U串（發(fā)夾結(jié)構(gòu)末端）串（發(fā)夾結(jié)構(gòu)末端）不依賴不依賴終止子結(jié)構(gòu)終止子結(jié)構(gòu)IRIR莖部富含莖部富含GC3、依賴、依賴 因子的終止子因子的終止子 （1） 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) IR序列中的序列中的 GC 對含量較少對含量較少 發(fā)夾結(jié)構(gòu)末端沒

37、有固定特征發(fā)夾結(jié)構(gòu)末端沒有固定特征 （2） 靠與靠與的共同作用而實(shí)現(xiàn)終止的共同作用而實(shí)現(xiàn)終止 無連續(xù)無連續(xù) U串串G/C含量較少含量較少 二、二、 原核生物轉(zhuǎn)錄的終止原核生物轉(zhuǎn)錄的終止 1、不依賴、不依賴因子的終止子終止轉(zhuǎn)錄因子的終止子終止轉(zhuǎn)錄 （1） 新生新生RNA鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成 與與RNApol發(fā)生作用發(fā)生作用 造成高度延宕（典型的有造成高度延宕（典型的有60秒左右）秒左右） （2） RNApol暫停為終止提供了機(jī)會暫停為終止提供了機(jī)會 ，6 8個連續(xù)的個連續(xù)的U 串可能為串可能為RNApol與模板的解離提供了信號與模板的解離提供了信號 RNADNA之間的之間的 rUdA 結(jié)

38、合力較弱結(jié)合力較弱 阻止阻止RNA鏈的釋放鏈的釋放 于是：于是： RNADNA解離解離 三元復(fù)合體解體三元復(fù)合體解體 RNApol解離解離 轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄終止（3） 真正的終止點(diǎn)不固定，在真正的終止點(diǎn)不固定，在 U串中的任何一處串中的任何一處（4） IR序列和序列和U串同等重要串同等重要 IR中的中的GC對含量的減少對含量的減少 U串的縮短或缺失串的縮短或缺失（5） DNA上與上與U串對應(yīng)的為富含串對應(yīng)的為富含AT的區(qū)域的區(qū)域 說明：說明：AT富含區(qū)在轉(zhuǎn)錄的終止和起始中均起重要的作用富含區(qū)在轉(zhuǎn)錄的終止和起始中均起重要的作用 2、依賴、依賴 因子的終止子終止轉(zhuǎn)錄因子的終止子終止轉(zhuǎn)錄 （1） 通讀（

39、通讀（read through）：）：在依賴在依賴 因子的轉(zhuǎn)錄終止因子的轉(zhuǎn)錄終止 過程中，過程中， RNApol 轉(zhuǎn)錄了轉(zhuǎn)錄了 IR 序列之后，雖發(fā)生序列之后，雖發(fā)生 一定時間的延宕，但如果沒有一定時間的延宕，但如果沒有 因子存在，則因子存在，則 RNApol 會繼續(xù)轉(zhuǎn)錄會繼續(xù)轉(zhuǎn)錄 （2） 因子因子：六聚體蛋白、水解各種核甘三磷酸促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄 促進(jìn)轉(zhuǎn)錄終止的活性，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄終止的活性，NTPase 活性活性 b、 RNA長度大于長度大于50nt時，依賴時，依賴RNA的的NTPase活性最大活性最大 說明：說明：因子識別和結(jié)合的是因子識別和結(jié)合的是RNA

40、（3） 因子對終止子的作用因子對終止子的作用 a、因子與因子與RNA結(jié)合（終止子上游的某一處，結(jié)合（終止子上游的某一處，RNA的的5端端 ） b、因子沿因子沿RNARNA從從5533移動（移動（NTPNTP水解供水解供能能） （終止子處的較長時間的延宕給（終止子處的較長時間的延宕給因子追趕的機(jī)會因子追趕的機(jī)會）c c、因子與因子與 RNApolRNApol 相互作用而造成轉(zhuǎn)錄的終止相互作用而造成轉(zhuǎn)錄的終止結(jié)合上來追趕結(jié)合上來追趕RNApol追趕上來追趕上來（暫停）（暫停） 與與RNApol相相互作用使雜交鏈互作用使雜交鏈解鏈解鏈終止子終止子三、抗終止及抗終止因子三、抗終止及抗終止因子 *抗終止

41、的機(jī)制抗終止的機(jī)制1. 破壞終止位點(diǎn)破壞終止位點(diǎn)RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖環(huán)結(jié)構(gòu) 2. 依賴于噬菌體本身的依賴依賴于噬菌體本身的依賴因子的轉(zhuǎn)錄抗終止因子的轉(zhuǎn)錄抗終止 依賴依賴因子的終止子上游有抗終止信號（因子的終止子上游有抗終止信號（p88） 抗終止蛋白和抗終止蛋白和nut位點(diǎn)的結(jié)合，等待位點(diǎn)的結(jié)合，等待RNApol經(jīng)過經(jīng)過 時修時修飾飾 RNApol的構(gòu)象，拮抗寄主編碼的終止蛋白的構(gòu)象，拮抗寄主編碼的終止蛋白的活性的活性,使之通過那些依賴使之通過那些依賴的終止子的終止子上節(jié)課內(nèi)容回顧上節(jié)課內(nèi)容回顧:1、轉(zhuǎn)錄的終止、轉(zhuǎn)錄的終止 不依賴不依賴因子的終止子終止轉(zhuǎn)錄因子的終止子終止轉(zhuǎn)錄 依賴依賴因子的終止

42、子終止轉(zhuǎn)錄因子的終止子終止轉(zhuǎn)錄2、抗終止、抗終止 第五節(jié) 內(nèi)含子的剪接、編輯及化學(xué)修飾1.RNA中的內(nèi)含子2.RNA的剪接原核生物轉(zhuǎn)錄后加工真核生物轉(zhuǎn)錄后加工3 RNA3 RNA的編輯和化學(xué)修飾的編輯和化學(xué)修飾一、概述一、概述 1、 概念概念 割裂基因（割裂基因（split gene）：指編碼某一）：指編碼某一RNA的基因中有些的基因中有些 序列并不出現(xiàn)在成熟的序列并不出現(xiàn)在成熟的RNA序列中，成熟序列中，成熟RNA 的序列在基因中被其他的序列隔開的序列在基因中被其他的序列隔開 內(nèi)元（內(nèi)元（intron）：原初轉(zhuǎn)錄物中通過）：原初轉(zhuǎn)錄物中通過RNA拼接反應(yīng)而被去拼接反應(yīng)而被去 除的除的RNA序

43、列或基因中與這些序列或基因中與這些RNA序列相應(yīng)的序列相應(yīng)的 DNA序列序列 外元（外元（excon）：）： RNA拼接（拼接（RNA splicing）：）：一個基因的外元和內(nèi)元共同一個基因的外元和內(nèi)元共同 轉(zhuǎn)錄在一條轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，將內(nèi)元去除而把外元連轉(zhuǎn)錄在一條轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，將內(nèi)元去除而把外元連 接起來形成成熟接起來形成成熟RNA分子的過程分子的過程 拼接點(diǎn)：拼接點(diǎn)： 5 拼接點(diǎn)或左拼接點(diǎn)（內(nèi)元上游）拼接點(diǎn)或左拼接點(diǎn)（內(nèi)元上游） 3 拼接點(diǎn)或右拼接點(diǎn)（拼接點(diǎn)或右拼接點(diǎn)（下游）下游）2、 內(nèi)元的分類內(nèi)元的分類 1982 Davies等人等人 中部核心結(jié)構(gòu)（中部核心結(jié)構(gòu)（central core s

44、tructure）:在有些內(nèi)元在有些內(nèi)元 中，含有中，含有4個重復(fù)的保守序列，長度為個重復(fù)的保守序列，長度為 10 20bp，4個保守序列構(gòu)成一種二級個保守序列構(gòu)成一種二級 結(jié)構(gòu)，在拼接中起重要作用結(jié)構(gòu)，在拼接中起重要作用 由于并非所有的內(nèi)元都有中部核心結(jié)構(gòu)，所以有了內(nèi)元的分類由于并非所有的內(nèi)元都有中部核心結(jié)構(gòu)，所以有了內(nèi)元的分類 類內(nèi)元（類內(nèi)元（group group ）: :含有中部核心結(jié)構(gòu)的含有中部核心結(jié)構(gòu)的 細(xì)胞器基因細(xì)胞器基因 核基因核基因 類內(nèi)元（類內(nèi)元（group ）:不含有中部核心結(jié)構(gòu)不含有中部核心結(jié)構(gòu) 細(xì)胞器線粒體基因內(nèi)細(xì)胞器線粒體基因內(nèi) 核基因核基因 類內(nèi)元類內(nèi)元 （gro

45、up ）:具有具有 GUAG 特征的邊界序列特征的邊界序列 核基因核基因mRNA前體前體 tRNA基因的內(nèi)元基因的內(nèi)元 均位于均位于 tRNA 的反密碼環(huán)上的反密碼環(huán)上四種內(nèi)元的邊界序列各有一定共同的特征四種內(nèi)元的邊界序列各有一定共同的特征3、拼接方式、拼接方式 方式一：由拼接裝置完成（核方式一：由拼接裝置完成（核mRNA內(nèi)元）內(nèi)元） 可供識別的特異序列可供識別的特異序列 拼接裝置由多種蛋白質(zhì)和核蛋白組成拼接裝置由多種蛋白質(zhì)和核蛋白組成 方式二：自我拼接（兩類內(nèi)元方式二：自我拼接（兩類內(nèi)元 、 ） 形成特定的二級結(jié)構(gòu)形成特定的二級結(jié)構(gòu) RNA具有催化拼接的能力具有催化拼接的能力 方式三：需要蛋

46、白質(zhì)酶參與的拼接（酵母方式三：需要蛋白質(zhì)酶參與的拼接（酵母tRNA） 前兩種拼接都屬于轉(zhuǎn)酯反應(yīng)前兩種拼接都屬于轉(zhuǎn)酯反應(yīng) 二、第二、第 類內(nèi)元的拼接類內(nèi)元的拼接 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 拼接屬于自我拼接拼接屬于自我拼接 形成明顯的二級結(jié)構(gòu)形成明顯的二級結(jié)構(gòu) 1 1、 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： （1 1） 5 5 拼接點(diǎn)和拼接點(diǎn)和3 3 拼接點(diǎn)拼接點(diǎn)-U G 5 exonUintronGexon3 （2 2） 有由保守序列形成的二級結(jié)構(gòu)有由保守序列形成的二級結(jié)構(gòu) a a、 保守序列為保守序列為 5 PQRS3 距拼接點(diǎn)很遠(yuǎn)，各距拼接點(diǎn)很遠(yuǎn)，各 1012bp P與與Q互補(bǔ)、互補(bǔ)、R與與S互補(bǔ)而形成中部核心結(jié)構(gòu)互補(bǔ)

47、而形成中部核心結(jié)構(gòu) b、 二級結(jié)構(gòu)中還包括內(nèi)元與外元的某一序列互補(bǔ)所形成二級結(jié)構(gòu)中還包括內(nèi)元與外元的某一序列互補(bǔ)所形成 的二級結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu) 內(nèi)部引導(dǎo)序列（內(nèi)部引導(dǎo)序列（interal guide sequence IGS）：內(nèi)）：內(nèi) 元中能與兩個拼接點(diǎn)邊界序列配對的一元中能與兩個拼接點(diǎn)邊界序列配對的一 段序列段序列 # 第一類內(nèi)元的拼接依賴于以上二級結(jié)構(gòu)第一類內(nèi)元的拼接依賴于以上二級結(jié)構(gòu) 為自我拼接的進(jìn)行提供活性位點(diǎn)為自我拼接的進(jìn)行提供活性位點(diǎn) 2、 拼接機(jī)制（以四膜蟲的大拼接機(jī)制（以四膜蟲的大rRNA前體的拼接為例）前體的拼接為例） （2） 35SRNA體外有自我拼接的能力體外有自我拼接的

48、能力 反應(yīng)需要：一價和二價離子反應(yīng)需要：一價和二價離子 鳥苷酸輔助因子（鳥苷酸輔助因子（GTP GDP GMP和和 鳥嘌呤核苷）鳥嘌呤核苷） 不需能量的供給不需能量的供給 （3） 拼接反應(yīng)后，拼接反應(yīng)后，G與內(nèi)元（與內(nèi)元（414base） 5端以磷酸二酯端以磷酸二酯 鍵相連鍵相連 （放射性標(biāo)記試驗(yàn)）（放射性標(biāo)記試驗(yàn)） （4） 具體的拼接過程具體的拼接過程 P94 第一步：第一步： 游離游離G發(fā)動的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)發(fā)動的轉(zhuǎn)酯反應(yīng) G 的的 3-OH 攻擊內(nèi)元的攻擊內(nèi)元的 5拼接點(diǎn)拼接點(diǎn) G- 內(nèi)元、左外元（有游離內(nèi)元、左外元（有游離3OH） 第二步：第二步： 游離外元（左）發(fā)動的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)游離外元（左）發(fā)

49、動的轉(zhuǎn)酯反應(yīng) 左外元的左外元的3-OH 攻擊攻擊3拼接點(diǎn)，同時釋放拼接點(diǎn)，同時釋放 線狀的內(nèi)元線狀的內(nèi)元,形成形成成熟成熟RNA分子分子 兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)是緊密偶聯(lián)的兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)是緊密偶聯(lián)的 釋放出的內(nèi)元可繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)釋放出的內(nèi)元可繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng) 而形成環(huán)狀而形成環(huán)狀 （5） 自我拼接過程主要由轉(zhuǎn)酯反應(yīng)構(gòu)成，且完全由內(nèi)元自身自我拼接過程主要由轉(zhuǎn)酯反應(yīng)構(gòu)成，且完全由內(nèi)元自身 完成完成-自我拼接的最大特點(diǎn)自我拼接的最大特點(diǎn) 轉(zhuǎn)酯反應(yīng)是轉(zhuǎn)酯反應(yīng)是. 內(nèi)元自身能形成特定的二級結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生適于拼接反內(nèi)元自身能形成特定的二級結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生適于拼接反 應(yīng)的構(gòu)象和活性位點(diǎn)應(yīng)的構(gòu)象和活性位點(diǎn),在在G的參與下完成拼接

50、反應(yīng)的參與下完成拼接反應(yīng) (內(nèi)部引導(dǎo)序列內(nèi)部引導(dǎo)序列) 三、第二類內(nèi)元的拼接三、第二類內(nèi)元的拼接 1、拼接點(diǎn)序列、拼接點(diǎn)序列 7核苷酸的保守序列核苷酸的保守序列 （Branch Site ） 3 拼接點(diǎn)上游拼接點(diǎn)上游 6bp 12bp 處處 5-exon- GUGCG-B.S-Py AU -exon-3 供點(diǎn)供點(diǎn)受點(diǎn)受點(diǎn)-Py Pu Py Py U A Py- 100% 在在Branch Site 的兩側(cè)存在一些短的序列，的兩側(cè)存在一些短的序列， 與其上游與其上游10-50Nt處互成處互成 IR,形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)(但但A 不包含在不包含在 IR序列內(nèi)序列內(nèi), 從而被排除成芽狀突起）從而

51、被排除成芽狀突起） 5-GUGCG-PyPuPyPyUAPy-PyAU3Intron IR IR 5 G AU 3 A2、拼接機(jī)制（、拼接機(jī)制（Splicing mechanism）P95 Int ron IR IR A5 G AU 3 Exon 1 Exon2 G A intron PyAU Matural RNA “Lariat” “Lariat” intronintron 套索狀內(nèi)元轉(zhuǎn)酯攻擊位點(diǎn)轉(zhuǎn)酯攻擊位點(diǎn)intron OH AU 2 A 3G四、核基因四、核基因mRNA內(nèi)元的拼接內(nèi)元的拼接 1、相關(guān)概念、相關(guān)概念 Euk.的細(xì)胞中，有許多堿基數(shù)在的細(xì)胞中，有許多堿基數(shù)在100 300之

52、間之間 的的小分子小分子RNA,每個細(xì)胞有每個細(xì)胞有 105106個個內(nèi)元拼接與其他加工同時進(jìn)行內(nèi)元拼接與其他加工同時進(jìn)行拼接點(diǎn)序列拼接點(diǎn)序列 Breathnach-Chambon rule （GUAG規(guī)則）規(guī)則） 5-exon- GU-intron-AG -exon-3供點(diǎn)供點(diǎn) 100% 94% 受點(diǎn)受點(diǎn) 7Nt branch site 3拼接點(diǎn)的上游拼接點(diǎn)的上游 py X py U pu A py 3、拼接機(jī)制（、拼接機(jī)制（Splicing mehanismSplicing mehanism ) SnRNA (or ScRNA) 與拼接點(diǎn)序列間存在互補(bǔ)區(qū)域與拼接點(diǎn)序列間存在互補(bǔ)區(qū)域 并參與

53、剪接并參與剪接, , 形成拼接體形成拼接體( spliceosomespliceosome) )。 Spliceosome 逐級組裝，逐級組裝， SnRNA（U1、U2、U5和和 U4U6）分步替代分步替代 U1通過與通過與 55拼接點(diǎn)互補(bǔ)而結(jié)合拼接點(diǎn)互補(bǔ)而結(jié)合 U2識別并結(jié)合分支識別并結(jié)合分支 點(diǎn)點(diǎn)A U1和和U2作用使內(nèi)元的作用使內(nèi)元的 5端和端和 3端帶到端帶到 一起（一起（U1與與 3拼接點(diǎn)配對）拼接點(diǎn)配對） U1、U2、mRNA與與 U4U5U6復(fù)合物形成一個完整的拼接體復(fù)合物形成一個完整的拼接體 第一次轉(zhuǎn)酯左外元、內(nèi)元剪切套索第一次轉(zhuǎn)酯左外元、內(nèi)元剪切套索 第二次轉(zhuǎn)酯第二次轉(zhuǎn)酯exons連接、套索狀內(nèi)元釋放連接、套索