創(chuàng)新性實驗中藥對肝臟的保護作用

1、創(chuàng)新性實驗：創(chuàng)新性實驗：中藥對肝臟的保護作用中藥對肝臟的保護作用山東師范大學生命科學學院 邢維賢實驗目的要求 學習查閱與研究內容相關的文獻資料。 結合完成的基礎性實驗和綜合性實驗，學習自行設計實驗方案。 學習撰寫實驗論文實驗背景在傳統(tǒng)的中藥中有許多補肝保肝的單方與復方，但是，對它們的作用機理研究卻明顯不足，在正常生理狀態(tài)下，細胞中的成分和維持正常生理活動的酶活性相對穩(wěn)定。但是，在細胞受到損害或者不同的生理條件下，細胞中的成分會發(fā)生變化。利用動物肝損傷模型，采用細胞學的實驗技術，測定肝細胞中相關指標的變化，為探討相關中藥的作用及其機理提供基礎實驗數(shù)據(jù)。文獻查閱 常用文獻查閱的網(wǎng)站和搜索方法。 P

2、ubmed:美國國立醫(yī)學圖書館期刊文獻 Sciencedirect: 萬方數(shù)據(jù)： 清華同方CNKI-中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 重慶維普科技期刊全文數(shù)據(jù)庫Pubmed Pubmed Pubmed Pubmed Pubmed z?db=pubmedPubmed使用教程 復旦大學網(wǎng)站關于Pubmed使用方法的詳細講解： /flash/pubmed/page3-3.htmSciencedirect： Sciencedirect： 中文電子資源：圖書館中文電子資源：電子資源中文電子資源：中文電子資源中文電子資源：萬方數(shù)據(jù)：萬方數(shù)據(jù)：萬方數(shù)據(jù)：萬方數(shù)據(jù)：Adobe Acrobat Reader實驗技術路線： 實

3、驗對象：益肝靈 益肝靈具有抗肝毒作用，對四氯化碳、半乳糖、硫化乙酰胺、乙醇等引起的肝損傷，可以通過穩(wěn)定感細胞膜的作用而保護肝細胞及改善肝臟功能，具有降低血清谷丙氨基轉移酶的作用。實驗技術路線：四氯化碳肝損傷動物模型的制備：(1)取昆明種小鼠60只，隨機分成空白對照組、四氯化碳模型組、益肝靈藥物處理組3個劑量組以及陽性對照組，每組10只。.益肝靈藥物處理組每天灌胃(ig)給藥1次，四氯化碳組和空白對照組以等容積自來水灌胃，1 d，于末次給藥后1 h，除空白對照組外，其余各組均腹腔注射01四氯化碳油容液10 mlkg，空白對照組則腹腔注射等量花生油24 h后測定指標，取肝臟勻漿，按照試劑盒操作說明

4、檢測肝臟勻漿總谷胱甘肽、GSSG和GSH含量。.反應原理GSH和GSSG檢測試劑盒可以分別檢測出GSH和GSSG含量的檢測試劑盒。通過谷胱甘肽還原酶把GSSG還原成GSH，而GSH可以和生色底物DTNB反應產生黃色的TNB和GSSG。適當配制反應體系，前后兩個反應合并起來，總谷胱甘肽（GSSG+GSH）就相當于一個顏色產生的限速因素，總谷胱甘肽的量就決定了黃色的TNB形成量。從而通過測定412nm光吸收值就可以計算出總谷胱甘肽的量。用適當試劑先清除樣品中的GSH，然后利用上述反應原理就可以測出GSSG的含量，用總谷胱甘肽（ GSSG+GSH ）的量扣除GSSG的含量，就可以計算出GSH的含量。

5、反應原理：試劑盒清單 總谷胱甘肽檢測緩沖液 60ml 谷胱甘肽還原酶 12微升 氧化型谷胱甘肽(GSSG) 5mg DTNB 4.5mg 蛋白去除試劑M 1g NADPH 4mg DMSO 1.5ml GSH清除輔助液 0.8ml GSH清除試劑 160微升 說明書1份GSSG儲備液的配制：將試劑盒中5mgGSSG中加入816微升純水溶解并混勻，即得到濃度10mM的備用液，分裝-20保存。DTNB儲備液的配制：將試劑盒中4.5mgDTNB溶解于1.5mlDMSO，即得備用液，分裝-20 保存。蛋白去除試劑M溶液的配制：稱取0.2g蛋白去除試劑M，加入4ml總谷胱甘肽檢測緩沖液，配制成5%的溶液

6、，該試劑必須新鮮配置，當天使用。NADPH儲備液的配制：將4mgNADPH假如100微升純水，溶解混勻，分裝后-70 保存。試劑的配制試劑的配制 40倍稀釋谷胱甘肽還原酶的配制：取1微升谷胱甘肽還原酶，假如39微升總谷胱甘肽檢測緩沖液，混勻。 總谷胱甘肽檢測工作液的配制：根據(jù)待檢樣品數(shù)參考下表配制適當量的總谷胱甘肽檢測工作液，三種試劑按照比例混合，即為總谷胱甘肽檢測工作液。1 1個樣品個樣品1010個樣品個樣品2020個樣品個樣品40倍稀釋谷胱甘肽還原酶4.2微升43微升86微升DTNB儲備液的配制2.2微升22微升44微升總谷胱甘肽檢測緩沖液150微升1.5毫升3毫升試劑的配制 0.16mg

7、/mlNADPH的配制：取2微升NADPH儲備液，加入500微升總谷胱甘肽檢測緩沖液，混勻即為0.16mg/mlNADPH，每檢測1個樣品需50微升該液體。 稀釋的GSH清除輔助液的配制：在47微升的純水中加入53微升GSH清除輔助液，立即混勻。稀釋后的清除輔助液不穩(wěn)定，需新鮮配制，當天使用。 GSH清除試劑工作液的配制：10.8微升GSH清除試劑中加入89.2微升無水乙醇，立即混勻。新鮮配制，當天使用。標準品的準備 把10mMGSSG儲備液用蛋白去除試劑M溶液稀釋成15MGSSG,再依次稀釋成10、5、2、1、0.5MGSSG溶液，取15、10、5、2、1、0.5六個點做標準曲線。待測總谷胱

8、甘肽含量樣品的準備 組織樣品的準備： 取組織用液氮速凍，然后研成粉末，每10毫克研碎的組織粉末加入30微升蛋白去除試劑M，然后充分渦旋混勻。 再加入70微升蛋白去除試劑M溶液，用玻璃勻漿器勻漿（對于比較容易勻漿的組織可以不用液氮速凍處理，而直接加入蛋白去除試劑勻漿）。 對處理好的組織樣品通常用蛋白去除試劑M溶液稀釋5-20倍再進行測定。待測GSSG含量樣品的準備 取部分上述準備好的待測總谷胱甘肽含量的樣品，按照每100微升樣品加入5微升稀釋的GSH清除輔助液,混勻。再按照每100微升加入1微升GSH清除試劑工作液的比例加入GSH清除工作液，立即混勻。室溫反應60分鐘。樣品、標準品的測定 使用9

9、6孔板，依次加入樣品、標準品。加入150微升總谷胱甘肽檢測工作液后，混勻，室溫孵育5分鐘。加入50微升0.16mg/ml NADPH，25分鐘后，490nm下檢測光吸收值。空白對照空白對照標準曲線標準曲線樣品樣品樣品或標準品0微升10微升X微升蛋白去除試劑M溶液10微升0微升10-x微升總谷胱甘肽檢測工作液150微升150微升150微升室溫孵育5分鐘5分鐘5分鐘0.16mg/mlNADPH0.16mg/mlNADPH50微升50微升50微升GSSG含量的測定 進行GSSG含量的測定時，標準品也必須平行的進行去除GSH的相關操作，以減小誤差。 如果樣品需要同時測定總谷胱甘肽含量和GSSG含量，由于兩者的檢測體系不同，必須分別單獨做標準曲線。樣品中GSH含量的測定 單點測定法：反應25分鐘后只測定一次吸光度，根據(jù)不同濃度標準品測定的不同吸光度做出標準曲線。樣品對照標準曲線即可計算出總谷胱甘肽以及GSSG的含量。 實際計算出來的總谷胱甘肽的含量相當于把氧化型谷胱甘肽的含量乘以2再加上還