依賴于D14-SCFD3的D53降解作用對獨腳金內(nèi)酯的信號傳導(dǎo)起調(diào)節(jié)作用

1、依賴于D14-SCFD3的D53降解作用對獨腳金內(nèi)酯的信號傳導(dǎo)起調(diào)節(jié)作用摘要： 獨角金內(nèi)酯(SLs)是一類最近發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜素衍生型植物激素,這類激素對于修整植物結(jié)構(gòu)及植物與寄生性野草和共生性叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi)之間相互作用相關(guān)的發(fā)育進程是必需的。雖然在SL的生物合成途徑的詮釋方面很快取得了進展,但有關(guān)SL的植物感知以及信號傳導(dǎo)的機制仍處于未知。在此我們展示DWARF53(D53)以一種SL信號傳導(dǎo)作用抑制劑的方式起作用,而SLs則會誘導(dǎo)這一蛋白的降解。我們發(fā)現(xiàn)水稻d53突變株的表型是由于一種獲得性突變造成的,而且這種株系對于外源性SL的處理

2、表現(xiàn)不敏感,與野生型相比,d53突變株通常產(chǎn)生大量的分蘗。D53基因產(chǎn)物與I類Clp ATP酶蛋白具有共同的預(yù)測過的特征,D53蛋白可以與/ 水解酶蛋白DWARF14(D14)還有F-box蛋白DWARF3(D3)一起形成復(fù)合物,D14和D3是兩種以前確認出來的可能對于植物感知SL起作用的信號傳導(dǎo)組分。我們證實SLs以一種依賴于D14和D3的方式通過蛋白酶體誘導(dǎo)D53蛋白的降解并通過這種方式終止D53促進側(cè)芽生長的活性。我們這些結(jié)合了遺傳學(xué)和生物化學(xué)方面的數(shù)據(jù)揭示出D53在SL信號傳導(dǎo)途徑中以抑制劑的方式起作用，而D53的這種由激素誘導(dǎo)的降解作用則代表了在SL的植物感知與回應(yīng)之間的關(guān)鍵性分子聯(lián)

3、系。 出芽分枝（農(nóng)作物中稱為分蘗）是植物結(jié)構(gòu)以及農(nóng)作物產(chǎn)量的一個主要決定因素，而這一作用則是由激素、發(fā)育和環(huán)境因素共同控制的。雖然早在70年前就已經(jīng)假設(shè)植物根部存在可傳輸抑制分枝作用的信號，但一直到現(xiàn)在也沒有確認出這種信號。最近在幾種不同種屬的分枝植物中進行的研究證實了SLs，一類特異性的萜類內(nèi)酯，是一直尋找的抑制分枝作用的激素，它的功能在單子葉植物和雙子葉植物中呈現(xiàn)保守性。除了抑制出芽分枝作用之外，SLs還在調(diào)節(jié)植物的根部生長、葉子的老化以及花朵形成方面起作用。另外SLs還在促進陸生植物與叢枝菌根真菌之間的共生過程中充當(dāng)外源性信號，還可以刺激寄生性野草巫婆草（Striga）和列當(dāng)草（Orob

4、anche）的種子萌發(fā)，這兩種野草在世界上許多地區(qū)對農(nóng)業(yè)造成嚴重的危害。以前的研究結(jié)果顯示水稻中的DWARF3(D3)、D10、D14(亦稱為HIGH-TILLERING DWARF2、HTD2和D88)、D17(亦稱為HTD1)和D27;擬南芥中的MORE AXILLARY GROWTH 1(MAX1)、MAX2、MAX3和MAX4；豌豆中的RAMOSUS1(RMS1)、RMS4和RMS5；還有矮牽牛中的DECREASED APICAL DOMINANCE 1(DAD1)、DAD2和DAD3都參與了SLs的生物合成或信號傳導(dǎo)作用。在這些基因中，MAX3/RMS5/D17/DAD3、MAX4/

5、RMS1/D10/DAD1、擬南芥中的MAX1和水稻中的D27分別編碼切割類胡蘿卜素的雙加氧酶7(CCD7)、CCD8、CYP711A1(細胞色素P450)以及一種新型-胡蘿卜素異構(gòu)酶，并參與后續(xù)對-胡蘿卜素的切割以及SLs的合成。相反，MAX2/RMS4/D3和D14/DAD2則分別編碼一種F-box蛋白和一種/水解酶超家族成員的蛋白，這兩種蛋白可能在SL信號傳導(dǎo)中起作用。MAX2/RMS4/D3蛋白與植物激素受體TRANSPORTINHIBITOR RESPONSE 1 (TIR1)以及茉莉酸受體CORONATINEINSENSITIVE 1 (COI1)之間，還有D14/DAD2蛋白與赤

6、霉素受體GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1(GID1)之間存在的結(jié)構(gòu)相似性所引發(fā)的推測是MAX2/RMS4/D3和D14/DAD2都可能成為SL的受體，而通過D14/DAD2對SLs的結(jié)合和水解可能是激發(fā)由含有Skp1-Cullin-F-box(SCF)MAX2復(fù)合物對某種未知抑制因子實施以蛋白酶體為中介的降解作用所必需的。然而對于這種未知抑制因子的確認以及它在SL信號傳導(dǎo)中的調(diào)節(jié)機制還都處于未知的狀態(tài)。在我們的這項研究中，我們確認出了一種功能獲得性突變，d53突變，這種突變顯示出對SL作用的不敏感性以及分蘗數(shù)量增加的表型?；趫D譜的克隆發(fā)現(xiàn)D53基因編碼一種與I類C

7、lp ATP酶具有相同預(yù)測特征的蛋白，這種蛋白可以與/水解酶蛋白D14和F-box蛋白D3形成復(fù)合物。我們還展示SLs通過蛋白酶體-泛素途徑以一種依賴于D14和D3的方式誘導(dǎo)D53的降解作用。我們的研究結(jié)果確立了D53在SL信號傳導(dǎo)途徑中作為一種抑制劑的作用，而這種由激素誘導(dǎo)的蛋白降解作用是SL信號傳導(dǎo)所必需的。d53是一種對SL不敏感的水稻突變株 之前的研究確認出幾種在SL生物合成或信號傳導(dǎo)中缺失的水稻突變株系。由于這些株系的高度分枝以及矮稈的表型，它們被稱為“d 突變株”,如d3、d10、d14、d17和d27。水稻d53突變株也顯示出高度降低和分蘗增加的表型，與野生型相比還有莖部較薄以及

8、跟冠較短的表型(圖1a,b,擴展數(shù)據(jù)圖1a,b)。動力學(xué)分析結(jié)果顯示在水稻的出穗期,d53突變株的總分蘗數(shù)大約為野生型的三倍,導(dǎo)致同時形成高次分蘗和高位分蘗(圖1c,擴展數(shù)據(jù)圖1c,d)。組織學(xué)分析結(jié)果顯示野生型和d53突變株的節(jié)間的維管束和薄壁細胞(parenchymacell)大致相當(dāng)，說明d53突變株莖部較薄較短主要是由于細胞數(shù)量減少形成的(擴展數(shù)據(jù)圖1e-h)。雜合性F1植物的表型處于純合性親本的中間(擴展數(shù)據(jù)圖2a-g)。對d53突變株與野生型親本(Norin 8)雜交衍生的F2群體進行遺傳學(xué)分析的結(jié)果表明正常、中間和矮稈植物的比例為1:2:1(33:58:28,2= 0.09,P

9、> 0.05)，說明d53突變行為是一種半顯性方式(擴展數(shù)據(jù)圖2h)。d53突變株與之前報道過的水稻d突變株表型的相似性啟發(fā)我們對d53突變是否在SL介導(dǎo)的對于側(cè)芽生長抑制作用中處于缺失狀態(tài)進行檢測。結(jié)合反轉(zhuǎn)錄的定量PCR分析結(jié)果顯示在d53突變株中基因D10(編碼CCD8)的表達由于在SL途徑中的反饋調(diào)節(jié)作用而與在其他d突變株中同樣被上調(diào)了(圖1d)。此外，一種側(cè)芽生長抑制劑FINE CULM1(FC1)的表達在d53、d14和d27突變株中都發(fā)生了下調(diào)(圖1d),這一基因是玉米種TEOSINTE BRANCHED1(TB1)和擬南芥中BRANCHED 1 (BRC1)的直系同源物，因

10、此說明D53基因可能涉及到SL的生物合成或信號傳導(dǎo)。還有,外源性使用SL類似物GR24會有效地抑制d27突變株的側(cè)芽生長，但對d14或d53突變株則沒有這種效應(yīng)(圖1e,擴展數(shù)據(jù)圖3a-c)。還有,在植物根部滲出物中隊SLs的測定顯示d53突變株要比野生型水稻Norin 8品系積累了高得多的2'-表-5-脫氧獨角金醇(epi-5DS),這是一種在水稻中天然的SL類化合物(圖1f)。這些結(jié)果說明d53突變株是一種對SL不敏感的突變株。圖1 d53突變株的表型a,b,4周大小的野生型(WT)和d53突變幼苗期(a)或出穗期(b)的表型。白色箭頭表示在d53突變株中的首次分蘗，這在野生型中是

11、不存在的，紅色箭頭顯示第二次分蘗。c,對于不同發(fā)育階段分蘗動力學(xué)的比較。d,在d突變株中通過qRT-PCR顯示D10表達情況。e,對于GR24處理后水稻幼苗的回應(yīng)。紅色和白色箭頭分別表示第一和第二次分蘗。f,根部滲出物中通過液相色譜與質(zhì)譜串聯(lián)對epi-5DS水平的測量。gfw,每克濕重；ND,沒有檢測到。比例尺為a-5cm；b-30cm；e-2cm。數(shù)值表示均值±s.d.(c組圖n=30株植物；d和f組圖n為三次重復(fù))。Student t-檢驗表示存在顯著性差異(與野生型相比,*P<0.05,*P<0.01)。D53作為SL信號傳導(dǎo)作用的一種抑制劑行使其功能 D53基因之

12、前被制譜于11號染色體短臂的末端區(qū)域中。為了說明在d53突變株中的分子缺失情況，我們通過基于圖譜的克隆技術(shù)將D53基因分離出來。通過使用KetanNangka品系與突變株的雜交所產(chǎn)生的約12000株F2群體，我們進一步將D53基因位點限定在細菌人工染色體(BAC)克隆OSJNBa00032J07上的34kb DNA區(qū)域，這一區(qū)域中含三個假定基因(圖2a)。序列分析顯示在d53突變株中LOC_Os11g01330的第三個外顯子有一個單核苷酸取代和一個15個核苷酸的刪除，產(chǎn)生一個單氨基酸取代(R812T)和五個氨基酸缺失(813GKTGI817)的蛋白產(chǎn)物(圖2b)。為了驗證這一突變導(dǎo)致了矮稈分蘗

13、表型，我們培育出了在水稻ACTIN1啟動子(pAct1)控制下在野生型遺傳背景中轉(zhuǎn)基因表達野生型或突變D53基因的水稻。值得注意的是，所有表達突變d53基因的轉(zhuǎn)基因植物都顯示出要比表達野生型D53基因更多分蘗的表型。在這些轉(zhuǎn)基因植物中分蘗表型的嚴重性與轉(zhuǎn)基因表達水平呈相關(guān)性。值得注意的是，過量表達野生型D53基因也會引起與載體對照植物相比中等程度的分蘗增加現(xiàn)象(圖2c-e)。這些結(jié)果說明D53蛋白在SL介導(dǎo)的分枝作用抑制途徑中起一種抑制劑的作用，而d53突變株中主要的分蘗表型更像是由于d53突變株中功能獲得性遺傳造成的。為了進一步證實這一點，我們使用RNA干擾(RNAi)技術(shù)培育出了D53表達

14、降低的轉(zhuǎn)基因植物。不出所料，在d53背景下減少D53表達明顯減少了分蘗的數(shù)量(擴展數(shù)據(jù)圖3d,e)。綜上，這些數(shù)據(jù)支持這樣一種假設(shè)即d53的突變增加了D53在抑制SL信號傳導(dǎo)中的活性。圖2 基于圖譜的D53克隆及其特征a,D53被詳細繪制在圖譜第11號染色體上。重組數(shù)量顯示在括號中。b,在d53突變中的分子損傷。c,對pAct1:D53-GFP 和pAct1:d53-GFP轉(zhuǎn)基因植物的表型比較。載體(Vec.),pAct1:GFP對照。L為獨立轉(zhuǎn)基因譜系。比例尺10cm。d,e,在組圖c中的分蘗數(shù)量(d)和相對D53表達情況(e)。OE,過表達。f,在各組織中D53的表達，未成熟稻穗(YP)、

15、幼根(YR)、分枝(S)、葉片(LB)、葉鞘(LS)、莖(C)和體節(jié)(N)。g,GR24處理誘導(dǎo)D53表達。h,在兩種野生型品系Norin8(N)和Shiokari(S)以及6種d突變的水稻中D53的相對表達水平。在d-h組圖中的數(shù)值代表均值±s.d.(d以及f-h組圖中n為三次重復(fù)；e組圖中n為20株植物)。Studentt-檢驗分析結(jié)果顯示與對照相比具有顯著差異性(*P<0.05，*P<0.01)。D53基因預(yù)測會編碼1131個氨基酸的蛋白。進行BLAST搜尋確認出水稻基因組中與D53具有96.6%氨基酸序列相同的D53相關(guān)同源物(命名為類D53，LOC_Os12g0

16、1360)。還有，在其他單子葉和雙子葉植物中也發(fā)現(xiàn)了類似于D53的蛋白，但在更低等的植物、動物或微生物中沒有發(fā)現(xiàn)類似物，說明類D53的分化枝是高等植物所特有的(擴展數(shù)據(jù)圖4)。通過HHpred結(jié)構(gòu)預(yù)測服務(wù)器進行的序列分析結(jié)果顯示，雖然初級序列同源性很低，但D53與I類Clp ATP酶家族具有相似的二級結(jié)構(gòu)組成，其結(jié)構(gòu)特征為一個N端結(jié)構(gòu)域、一個D1 ATP酶結(jié)構(gòu)域、一個M結(jié)構(gòu)域和一個D2 ATP 酶結(jié)構(gòu)域。值得注意的是，D53的D2結(jié)構(gòu)域含有一個高度保守的線性序列Phe-Asp-Leu-Asn-Leu，這一序列與乙烯回應(yīng)性元件結(jié)合因子相關(guān)兩性抑制(EAR)基序非常相似(擴展數(shù)據(jù)圖5)，已知這一基

17、序與TOPLESS蛋白家族具有相互作用并參與轉(zhuǎn)錄的抑制。實時qPCR分析顯示D53在所檢測的水稻組織中廣泛表達(圖2f)。一種由D53啟動子驅(qū)動的GUS(-葡萄糖苷酸酶)報道基因(pD53:GUS)檢測結(jié)果顯示在水稻的根部、分枝處、葉子、葉鞘、體節(jié)、體節(jié)之間以及未成熟稻穗中都有GUS染色陽性結(jié)果，特別是在圍繞木質(zhì)的薄壁細胞中GUS的染色更為明顯(擴展數(shù)據(jù)圖6a-h)。還有，在野生型植物中D53的表達通過GR24的處理被上調(diào)，但在6種d突變株中呈下調(diào)，說明D53的表達受到SL信號傳導(dǎo)作用的調(diào)節(jié)(圖2g,h)。D53-GFP融合蛋白專性定位于水稻的原生質(zhì)體中細胞核中以及pAct:D53-GFP轉(zhuǎn)基

18、因植物的根細胞中(擴展數(shù)據(jù)圖6i-p)。SLs促進D53-D14和D14-D3的相互作用 之前的研究確認出F-box蛋白D3和/水解酶D14是水稻中SL信號傳導(dǎo)中兩個關(guān)鍵的組分,其中D14及其在阿拉伯芥中的直系同源物AtD14和矮牽牛中的直系同源物DAD2被認為直接參與了SL的感知作用。酵母雙雜交檢測(Y2H)顯示D53和d53在GR24存在的條件下都可以與D14形成物理性相互作用(圖3a)。圖3 GR24促進D53-D14和D14-D3的相互作用a,酵母雙雜交顯示在GR24存在時D53和d53都與D14存在相互作用。酵母轉(zhuǎn)化物在對照培養(yǎng)基(SD-Leu/-Trp(_LT)和選擇性培養(yǎng)基(SD

19、-Leu/-Trp/-His/-Ade(-LTHA)+X-gal)形成斑點菌落。AD,激活結(jié)構(gòu)域；BD,結(jié)合結(jié)構(gòu)域；SD,合成缺陷型。b,D53和D14的BiFC檢測。細胞核的位置由DAPI染色顯示。eYFP,改進型黃色熒光蛋白。NY和CY代表eYFP的N端和C端。BF,明視野成像。比例尺10um。c,重組麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）-D3或MBP使用含GST-D14樹脂進行的體外下拉實驗。星號表示全長的MBP-D3蛋白。d,使用GST-D3-OSK1作為餌從d3突變植物抽提物中將D14免疫共沉淀出來的下拉實驗?！癐nput”表示所使用的總植物蛋白量大致相同。結(jié)構(gòu)域刪除分析結(jié)果說明D53的D1結(jié)構(gòu)

20、域是依賴于GR24的D53-D14相互作用所必需的。有趣的是,其結(jié)合活性被M和D2結(jié)構(gòu)域所抑制,雖然它們的負性效應(yīng)可以被N結(jié)構(gòu)域所克服(擴展數(shù)據(jù)圖7)。我們通過雙分子熒光補償(BiFC)檢測方法在有或無外源性GR24的條件下在本氏煙(Nicotiana benthamiana)植物葉細胞核中證實了D53-D14的相互作用(圖3b)。在沒有外源性施加GR24的條件下觀察到的D53和D14之間的相互作用可能是由于煙草葉細胞中內(nèi)源性SLs存在所造成的。與之前報道的酵母中DAD2和PhMAX2A(矮牽牛中D3直系同源物)的相互作用依賴于GR24的現(xiàn)象相一致,我們的體外下拉實驗也顯示在D14和D3之間存

21、在一種依賴于GR214方式的直接相互作用(圖3c)。還有,使用重組的GST-D3-OSK1融合蛋白做餌,我們的下拉實驗顯示在施加外源性GR24的條件下可以更有效地從d3突變植物抽提物中將D14免疫共沉淀下來(圖3d)。綜上,這些結(jié)果說明SLs可能在D14、D3和D53之間復(fù)合物的形成中起促進作用,這樣將D53與SL信號傳導(dǎo)途徑激素感知組分聯(lián)系在一起。G24促進D53蛋白的降解作用 為了研究SL如何對D53進行調(diào)節(jié),我們進行一系列額外的實驗。免疫印跡和熒光顯微鏡檢測都顯示GR24處理會在野生型細胞中誘導(dǎo)D53蛋白的快速降解，但這種作用在d3或d14突變細胞中不存在(圖4a-c)。我們進一步顯示D

22、53被蛋白酶體降解，而只有一種蛋白酶體抑制劑MG132,可以有效阻斷由GR24誘導(dǎo)的D53-GFP的降解作用(圖4c,d,擴展數(shù)據(jù)圖8a,b)。值得注意的是,與野生型D53-GFP融合蛋白不同，突變的d53-GFP融合蛋白似乎在GR24存在的條件下很穩(wěn)定(圖4c,擴展數(shù)據(jù)圖8b)。有趣的是,我們注意到在d53突變細胞中D53-GFP和D53-熒光素酶(LUC)仍然會被降解,但在d3或d14突變細胞中則不會(圖4d,擴展數(shù)據(jù)圖8c),說明D53的降解途徑在d53突變株中還是可以操控的。綜上,這些結(jié)果說明SL通過一種依賴于D14和D3的方式激發(fā)蛋白酶體介導(dǎo)的對D53的降解作用。重要的是,d53蛋白

23、對于SL激發(fā)的降解作用的不敏感性與所見到的d53顯性獲得性突變的表型相一致。 為了對D53、D3和D14之間的功能性關(guān)系提供遺傳性支持，我們培育出d3d53和d14d53的雙突變株。d3突變株要比d14和d53單突變株更矮、分蘗更多(擴展數(shù)據(jù)圖9a)。d14d53雙突變株顯示出與d14和d53親本類似的矮稈多分蘗的表型,而d3d53雙突變株則顯示出與d3突變株類似的矮稈多分蘗的表型(圖4e,f,擴展數(shù)據(jù)圖9a)。這些雙突變株并沒有顯示出疊加性效應(yīng)的結(jié)果說明D3、D14和D53作用于同一個信號傳導(dǎo)途徑。為了進一步驗證這些基因之間的上位關(guān)系(epistatic relationship),我們分別

24、在d3和d14的背景下降低D53基因的表達。如圖4g和擴展數(shù)據(jù)圖9b-d中所顯示的那樣,d3和d14的突變表型恢復(fù)到接近野生型的水平,證實了D53作用于D3和D14的下游,而D53蛋白的積累對阻斷SL信號傳導(dǎo)起作用,也是這些突變株形成矮稈多分蘗表型的原因。圖4 GR24促進依賴于D14和D3的蛋白酶體對D53的降解作用a,b,免疫印跡顯示GR24在野生型(a)中促進D53蛋白的降解作用,但在d突變株中則沒有這種作用(b)。每條泳道上樣量為10ug蛋白。c,共聚焦掃描成像顯示在野生型、d3或d14背景下D53-GFP和d53-GFP融合蛋白不同降解模式。d,在野生型、d14、d3或d53原生質(zhì)體中相對的D53-LUC或d53-LUC的熒光素酶活性。數(shù)值表示均值±s.d.,來自三次獨立實驗。雙星號代表通過Student t-檢驗在P<0.01時與對照(LUC)相比的顯著性差別。NS,無顯著性。e,f,d14d53表型(e)和d3d53表型(f)。g,在d3和d14背景下使用D53-RNAi轉(zhuǎn)基因植物的表型。c組圖比例尺100um,e-g組圖比例尺20cm。討論 曾有人推測植物對于SLs的感知通過SCFMAX2的泛素連接酶復(fù)合物激發(fā)對假定抑制劑的降解，從而對出芽分枝進行抑制。在本研究中，我們確立了水稻中D53的作用是SL信號傳導(dǎo)的抑制劑。與之前