常規(guī)培養(yǎng)基的制作

1、常規(guī)培養(yǎng)基制作常規(guī)培養(yǎng)基制作 疾控中心疾控中心 歲歲 源源E-mail：Tel：13656101610QQ： 37316315第一節(jié)第一節(jié) 基本理論基本理論l培養(yǎng)基的定義：l培養(yǎng)基是按照微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物所需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，由人工配制而成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，它專供微生物培養(yǎng)、分離、鑒別、研究和保存用。l培養(yǎng)基的用途：l主要用于繁殖及分離純化細(xì)菌、傳代和保存菌種、鑒別細(xì)菌種屬、研究細(xì)菌生理及生化特性、制造菌苗、疫苗和其他微生物制劑等。一、培養(yǎng)基的分類一、培養(yǎng)基的分類l1.按用途分類：l基礎(chǔ)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、增菌培養(yǎng)基 、選擇性培養(yǎng)基 、鑒別培養(yǎng)基 、顯色培養(yǎng)基 l

2、基礎(chǔ)培養(yǎng)基 含細(xì)菌所需最基本營(yíng)養(yǎng)成分，可供大多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)。常用的如含適量蛋白胨、氯化鈉、磷酸鹽、pH7.2-7.6的營(yíng)養(yǎng)肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂。l營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基再加入一些其他營(yíng)養(yǎng)成分，如葡萄糖、血液、血清、酵母浸膏、生長(zhǎng)因子等，以滿足營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需要的營(yíng)養(yǎng)。l增菌培養(yǎng)基 多為液體培養(yǎng)基，主要目的是增加標(biāo)本中目的菌數(shù)量，以提高目的菌檢出率。l選擇性培養(yǎng)基 在培養(yǎng)基中加入抑制物質(zhì)，使之具有選擇性，有利于目的菌檢出和識(shí)別，而抑制其他非目的菌生長(zhǎng)或者使其生長(zhǎng)不佳。加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基：分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基：分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基：分離固氮菌

3、不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基：分離自養(yǎng)型微生物加入氨基嘌呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基：分離雜交瘤細(xì)胞l鑒別培養(yǎng)基 利用各種細(xì)菌分解糖類和蛋白質(zhì)的能力及其代謝產(chǎn)物的不同，即生化反應(yīng)能力不同，在培養(yǎng)基中加入特定的作用底物和指示劑，以此來(lái)區(qū)別各種細(xì)菌。主要用于檢查各種細(xì)菌的生化反應(yīng)。l如伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基可鑒別大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物有機(jī)酸與伊紅美藍(lán)結(jié)合，使菌落呈現(xiàn)綠色金屬大腸桿菌大腸桿菌EMB平板平板沙門氏菌沙門氏菌BS瓊脂瓊脂沙門氏菌沙門氏菌XLD（木糖賴氨酸去氧膽酸鹽）瓊脂（木糖賴氨酸去氧膽酸鹽）瓊脂l顯色培養(yǎng)基 細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中可合成和釋放某些特異性酶，按酶的特性，選用相應(yīng)底物和指示劑，將其

4、配制在相關(guān)培養(yǎng)基中。根據(jù)細(xì)菌反應(yīng)后出現(xiàn)的菌落顏色變化，確定待分離可疑菌株，有助于細(xì)菌快速診斷。副溶血性弧菌副溶血性弧菌副溶副溶API 20E2.按物理性狀分類按物理性狀分類液體培養(yǎng)基流體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基：不含凝固劑，利于菌體的快速繁殖、代謝和積累產(chǎn)物流體培養(yǎng)基：含0.05-0.07%瓊脂粉，可降低空氣中氧進(jìn)入培養(yǎng)基的速度，利于一般厭氧菌的生長(zhǎng)繁殖半固體培養(yǎng)基：含0.2-0.8%瓊脂粉，多用于細(xì)菌的動(dòng)力觀察、菌種傳代保存及貯運(yùn)細(xì)菌標(biāo)本材料；固體培養(yǎng)基：含1.5-2%瓊脂，用于細(xì)菌的分離、鑒定、菌種保存及細(xì)菌疫苗制備等多方面液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基

5、半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基： 主要用于工業(yè)生產(chǎn)；固體培養(yǎng)基： 主要用于分離、鑒定等；半固體培養(yǎng)基： 主要用于觀察、保藏菌種。3.按成分分類按成分分類l合成培養(yǎng)基 由化學(xué)物質(zhì)和成分已知的各種物質(zhì)所組成，可以是無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)物質(zhì)等。l天然培養(yǎng)基 由化學(xué)物質(zhì)不完全清楚或各批物質(zhì)很難一致的天然物質(zhì)所組成，如蛋白胨、牛肉膏、血液、馬鈴薯等。l半合成培養(yǎng)基 由不明化學(xué)成分的天然物質(zhì)和 已知化學(xué)成分的物質(zhì)組成天然培養(yǎng)基 化學(xué)成分不明確，主要用于工業(yè)生產(chǎn)；合成培養(yǎng)基 化學(xué)成分明確，主要用于分類、鑒定。l天然培養(yǎng)基：優(yōu)點(diǎn)：取材便利、營(yíng)養(yǎng)豐富、配制簡(jiǎn)便；缺點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分難以控制、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性較 差。l天然培養(yǎng)基如培養(yǎng)

6、細(xì)菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。l合成培養(yǎng)基:l優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)成分及其含量明確、實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性好；l缺點(diǎn)：配制繁瑣、成本較高。二、培養(yǎng)基的主要成分及其作用二、培養(yǎng)基的主要成分及其作用l1.營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中所需要的營(yíng)養(yǎng)成分，因細(xì)菌種類不同而異，有的對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，僅需碳源、氮源即可；有的則要求較高，除碳源、氮源外，還需要雞蛋、血清、血液等。l主要有蛋白胨、牛肉浸液、牛肉浸膏、糖醇類、血液、雞蛋和動(dòng)物血清、生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽類等。l1.1蛋白胨：蛋白胨是培養(yǎng)基中作為氮源應(yīng)用最廣泛的基本成分，它用于合成菌體蛋白質(zhì)、酶類以及細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。l其特點(diǎn)是易溶于

7、水，吸水性強(qiáng)，故須干燥密封保存。l此外，蛋白胨受高熱不凝固，遇酸不沉淀，在培養(yǎng)基中具緩沖作用，并含有各種游離氨基酸，易被細(xì)菌所利用。l蛋白胨是動(dòng)物或植物蛋白質(zhì)經(jīng)酶或酸堿分解而產(chǎn)生的中間產(chǎn)物。l蛋白質(zhì)消化越徹底，含氨基酸越多，越有利于細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。由于蛋白質(zhì)來(lái)源不同，消化程度不同，制成的胨質(zhì)量相差很大。l通常的商品蛋白胨是由胃蛋白酶消化蛋白質(zhì)而制成的含胨、多肽及多種氨基酸的混合物，可供大多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)需要。其缺點(diǎn)是含某些氨基酸較少。l胰蛋白胨是胰蛋白酶在堿性條件下消化蛋白質(zhì)所獲得的分解產(chǎn)物，其中含有很多氨基酸和多肽，特別是富含色氨酸，更適合作靛基質(zhì)試驗(yàn)用的蛋白胨水。1.2牛肉浸液牛肉浸液l牛肉浸液

8、是將新鮮不含脂肪、肌膜、肌腱等精牛肉浸泡煮沸制成的肉汁。l包括兩類浸出物。一類為含氮可溶性浸出物（如肌酸、尿酸、腺苷酸、黃嘌呤、核苷酸、尿素、谷氨酸、肌肽等），另一類為非含氮浸出物質(zhì)（如肝糖、磷酸己糖、乳糖、琥珀酸、肌醇、脂肪與無(wú)機(jī)鹽等）。l牛肉浸液可作為細(xì)菌氮源和碳源，但因含氮物質(zhì)較少，尚不能滿足細(xì)菌生長(zhǎng)需要。1.3牛肉浸膏牛肉浸膏l(xiāng)為牛肉浸液經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間加熱，蒸發(fā)掉水分后濃縮而成的膏狀制品。l牛肉浸液中的不耐熱物質(zhì)如糖類等已被破壞，因而其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不如肉浸液，但其因不含糖和使用方便，故可作腸道細(xì)菌鑒別培養(yǎng)基基礎(chǔ)成分。1.4糖、醇類糖、醇類l糖類是細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需的碳源、能源的基本成分。l最常用的

9、單糖是葡萄糖、阿拉伯糖等；雙糖是乳糖、蔗糖等；多糖有菊糖和淀粉.l醇類有甘露醇、衛(wèi)矛醇等。其他的糖類和醇類主要用于發(fā)酵反應(yīng)以及鑒定細(xì)菌。l糖不耐熱，過(guò)久的高熱會(huì)被破壞，在堿性及與氮源一起高溫情況下，破壞更快，制備這類培養(yǎng)基時(shí)，通常不用高溫，并與培養(yǎng)基中其他成分分別滅菌。1.5血液血液l培養(yǎng)基中加入血液，可增加蛋白質(zhì)、多種氨基酸、糖類、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)成分，同時(shí)還能提供輔酶、血紅素等特殊生長(zhǎng)因子，供某些對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求高的細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖之用。l此外，含血液的培養(yǎng)基還可以用于觀察細(xì)菌溶血反應(yīng)，作為細(xì)菌鑒定的一項(xiàng)指標(biāo)。血平板溶血現(xiàn)象血平板溶血現(xiàn)象1.6雞蛋和動(dòng)物血清雞蛋和動(dòng)物血清l雞蛋和動(dòng)物血清對(duì)一部分細(xì)菌來(lái)說(shuō)

10、是必須營(yíng)養(yǎng)成分，可作為養(yǎng)料直接被細(xì)菌利用。l常用于制備特殊培養(yǎng)基，如Braid-Praker瓊脂培養(yǎng)結(jié)核桿菌的羅氏培養(yǎng)基和白喉棒狀桿菌的呂氏血清培養(yǎng)基等。l此外雞蛋和血清還具有凝固劑作用，便于觀察細(xì)菌菌落形態(tài)和生長(zhǎng)情況。1.7生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)因子l在細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中，需要一定的輔助生長(zhǎng)因子。l生長(zhǎng)因子根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)及代謝功能不同分為三大類：維生素、氨基酸和嘌呤與嘧啶。l細(xì)菌對(duì)這些物質(zhì)需要量不大，但如缺少，某些細(xì)菌就不能生長(zhǎng)。通常肝浸液、肉浸液、酵母浸液和血液中含有大部分生長(zhǎng)因子，但有時(shí)需要另外加入。1.8無(wú)機(jī)鹽類無(wú)機(jī)鹽類l制備培養(yǎng)基時(shí)常加入氯化鈉和磷酸鹽，這是因?yàn)榧?xì)菌生長(zhǎng)繁殖需要無(wú)機(jī)鹽類，如K、N

11、a、Mg、Fe、磷酸鹽、氯化物等。l其中，有的需要量極微，如Mn、Cu等。這些無(wú)機(jī)離子除作為構(gòu)成菌體的成分外，還是酶的激活劑，并起維持一定滲透壓的作用。2.水分水分l細(xì)菌細(xì)胞75%-80%由水組成。l水是細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)、代謝過(guò)程中不可缺少的物質(zhì)；水又是良好的溶劑，培養(yǎng)基中許多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均需溶于水才能被細(xì)菌吸收。l蒸餾水和離子交換水不含雜質(zhì)，在制備培養(yǎng)基時(shí)，一般需使用蒸餾水和離子交換水。l無(wú)蒸餾水可以用自來(lái)水代替，因其中含有某些微量元素，有利于細(xì)菌生長(zhǎng)，但應(yīng)先煮沸使部分鹽類沉淀，過(guò)濾澄清后再使用。3.凝固物質(zhì)凝固物質(zhì)l配制固體培養(yǎng)基的凝固物質(zhì)有瓊脂、明膠和蛋白、血清等，最常用瓊脂，特殊目的也可用明膠等。

12、l瓊脂是從石花菜等海藻中提取出來(lái)的一種膠狀物質(zhì)，屬多糖類，一般不被細(xì)菌分解利用，無(wú)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。l瓊脂在98攝氏度以上融化，在低于45攝氏度時(shí)則凝固成膠凍狀態(tài)。l用途不同的培養(yǎng)基中瓊脂含量不同，固體培養(yǎng)基含量為2%-2.5%，半固體培養(yǎng)基瓊脂含量為0.3%-0.5%。4.抑制劑和指示劑抑制劑和指示劑l抑制劑和指示劑是由于選擇、鑒定和判斷結(jié)果的需要而加入到培養(yǎng)基中的物質(zhì)，并不為細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需。l4.1抑制劑加入目的是抑制非檢出菌生長(zhǎng)或其少生長(zhǎng)，以利于檢出菌生長(zhǎng)。根據(jù)所要抑制選擇不同抑制劑。l常用抑制劑有膽鹽、煌綠、玫瑰紅酸、亞硫酸鈉、四硫磺酸鹽、疊氮鈉及一些染料和某些抗生素等。在選擇抑制劑時(shí)需注意

13、抑制劑應(yīng)具有選擇性抑制作用。l4.2指示劑是為方便了解和觀察細(xì)菌是否利用和分解培養(yǎng)基中糖、醇類物質(zhì)，而在培養(yǎng)基中加入的成分。l常用指示劑多為酸堿指示劑，如酚紅、溴甲酚紫、溴麝香草酚藍(lán)、中性紅、甲基紅、堿性復(fù)紅等，還有氧化還原指示劑，如亞甲藍(lán)。l此外，一些新的氧化還原指示劑如四氮唑鹽類等，也已廣泛用于細(xì)菌快速培養(yǎng)和鑒定以及快速藥敏試驗(yàn)方面。三、培養(yǎng)基配制原則： （1）目的要明確：根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的等確定配制培養(yǎng)基的種類，因?yàn)椴煌奈⑸飳?duì)培養(yǎng)物質(zhì)的需求不同。 （2）營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)：注意各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例。 （3）pH要適宜：各種微生物適宜生長(zhǎng)的pH范圍不同。 細(xì)菌pH為：6.5-7.5

14、； 放線菌pH為：7.5-8.5； 真菌pH為：5.0-6.0。第二節(jié)第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康膌掌握在真菌、細(xì)菌、放線菌分離培養(yǎng)工作中常用的合成和半合成培養(yǎng)基配制的一般原理、方法、程序、環(huán)節(jié)及要求和注意事項(xiàng)。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理l培養(yǎng)基的配制是進(jìn)行微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工作的重要基礎(chǔ)。由于微生物種類及代謝類型的多樣性，因而用于培養(yǎng)微生物培養(yǎng)基的種類也很多，它們的配方組成及配制方法雖各有差異,但一般培養(yǎng)基配制的常規(guī)程序卻大致相同，例如器皿的準(zhǔn)備，培養(yǎng)基的配制與分裝，棉塞的制作，培養(yǎng)基的滅菌，斜面與平板的制作以及培養(yǎng)基的無(wú)菌檢查等基本環(huán)節(jié)。l肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種廣泛用于培養(yǎng)細(xì)菌

15、的培養(yǎng)基，屬于半合成培養(yǎng)基。其主要成分是牛肉膏、蛋白胨和NaCl。它們分別提供微生物生長(zhǎng)繁殖所需要的碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子和無(wú)機(jī)鹽等。l培養(yǎng)基都是水溶液，這是因?yàn)橐磺猩锛?xì)胞都必須要有水的參與。l高氏一號(hào)培養(yǎng)基是一種用于培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中的可溶性淀粉作為碳源和能源，KNO3作為氮源，K2HPO4、MgSO4和FeSO4作為無(wú)機(jī)鹽等。l馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基被廣泛用于培養(yǎng)酵母菌和霉菌，為半合成培養(yǎng)基。食品檢測(cè)國(guó)標(biāo)使用虎紅培養(yǎng)基。1.培養(yǎng)基的配制過(guò)程培養(yǎng)基的配制過(guò)程l1.1液體培養(yǎng)基的配制l1.1.1稱量 一般可用1/100粗天平稱量配制培養(yǎng)基所需的各種藥品。先按培養(yǎng)基配方計(jì)算各成分

16、的用量然后進(jìn)行準(zhǔn)確稱量。l注意：染料、指示劑、膽鹽等物質(zhì)何時(shí)加入？調(diào)整pH后。l1.1.2溶化 將稱好的藥品置于一燒杯中，先加入少量水，然后加熱溶解，并不斷用玻璃棒攪動(dòng)。l注意：含銅大于0.3mol/L時(shí)，細(xì)菌不易生長(zhǎng)；含鐵大于0.14mol/L妨礙細(xì)菌產(chǎn)生毒素。1.1.3定容定容l待全部藥品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需體積。l問(wèn)：如某種藥品用量太少如何稱量？l答：可先配置成較濃溶液，然后按比例吸收一定體積溶液，加入到培養(yǎng)基中。1.1.4調(diào)調(diào)PHl一般用pH試紙測(cè)定培養(yǎng)基pH。用剪刀剪出一段pH紙，然后用鑷子夾取此段pH試紙，在培養(yǎng)基中蘸一下，觀察其pH范圍，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時(shí)，可用1m

17、ol/LNaOH或1mol/LHCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。l注意：調(diào)節(jié)pH時(shí)，應(yīng)逐漸加入NaOH或HCl溶液，防止局部過(guò)酸或過(guò)堿，破壞培養(yǎng)基中成分。邊加邊攪拌，并不時(shí)用pH試紙測(cè)試，直至達(dá)到所需pH為止。l注：一般將培養(yǎng)基pH調(diào)整高出所需值的0.1-0.2個(gè)pH單位，經(jīng)高壓滅菌后，其pH要降低0.1-0.2個(gè)單位。1.1.5過(guò)濾過(guò)濾l用濾紙或多層紗布過(guò)濾培養(yǎng)基。一般無(wú)特殊要求時(shí)，此步可省去。1.2固體培養(yǎng)基的配制固體培養(yǎng)基的配制l配制固體培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)將已配好的液體培養(yǎng)基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂加入，并用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續(xù)加熱至瓊脂全部融化，最后補(bǔ)足因蒸發(fā)而失去的水分。2.培養(yǎng)基的分裝培養(yǎng)

18、基的分裝l根據(jù)不同需要，可將已配好的培養(yǎng)基分裝入試管或錐形瓶?jī)?nèi)，分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口，造成污染。l如操作不小心，培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時(shí)，可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養(yǎng)基，并將脫脂棉棄去。2.1試管的分裝試管的分裝l取一個(gè)玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時(shí)，用左手拿住空試管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內(nèi)，以右手拇指及食指開放彈簧夾，中指及無(wú)名指夾住玻璃嘴，使培養(yǎng)基直接流入試管內(nèi)。l注：分裝在不同規(guī)格三角燒瓶、試管等容器中，分裝量不宜超過(guò)容器的2/3，否則會(huì)溢出。l裝入試管培養(yǎng)基的量，視試管大小及需

19、要而定。若所用試管大小為15*150mm時(shí)，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度1/4左右為宜；l如分裝固體或半固體培養(yǎng)基時(shí)，瓊脂完全融化后，應(yīng)趁熱分裝于試管中。2.2錐形瓶的分裝錐形瓶的分裝l用于振蕩培養(yǎng)微生物時(shí)，可在250ml錐形瓶中加入50ml的液體培養(yǎng)基；l若用于制作平板培養(yǎng)基時(shí)，可在250ml錐形瓶中加入150ml培養(yǎng)基，然后再加入3g瓊脂粉（按2%計(jì)算）。滅菌時(shí)瓶中瓊脂粉同時(shí)被融化。3.棉塞的制作及試管、錐形瓶的包扎棉塞的制作及試管、錐形瓶的包扎l為了培養(yǎng)好氧性微生物，需提供優(yōu)良通氣條件，同時(shí)為防止雜菌污染，則必須對(duì)通入試管或錐形瓶?jī)?nèi)空氣先進(jìn)行過(guò)濾，除菌。通常方法是在試管及錐形瓶口加上棉花塞

20、等。3.1試管棉塞的制作試管棉塞的制作l制棉塞時(shí)，應(yīng)選取用大小，厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和食指扣成的圓孔中，用右手食指將棉花從中央壓入圓孔中制成棉塞，然后直接壓入試管或錐形瓶口。l也可借用玻璃棒塞入，也可用折疊法制作棉塞。制作的棉塞應(yīng)緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過(guò)緊或過(guò)松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準(zhǔn)。l棉塞的2/3在試管內(nèi)，1/3在試管外。l將裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或蓋好管帽的試管捆成一捆，外面包上一層牛皮紙。用鉛筆注明培養(yǎng)基名稱及配制日期。滅菌待用。3.2錐形瓶棉塞制作錐形瓶棉塞制作l通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時(shí)為了進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)

21、加大通氣量，則可用8層紗布代替棉塞包在瓶口上。在裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或包上8層紗布或蓋好培養(yǎng)容器封口膜的錐形瓶口上，再包上一層牛皮紙并用線捆好，滅菌待用。4.培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基的滅菌l下一章節(jié)詳述。5.斜面和平板的制作斜面和平板的制作l5.1斜面的制作l將已滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管，趁熱傾斜固定，凝固后即成斜面。斜面長(zhǎng)度不超過(guò)試管長(zhǎng)度1/2為宜。如制作半固體或固體深層培養(yǎng)基時(shí)，滅菌后則應(yīng)垂直放置至冷凝。1.葡萄糖：乳糖1：92.下黃上不黃 為分解葡萄糖，不分解乳糖3.上下均黃 為分解葡萄糖、乳糖4.上下均不黃 為非發(fā)酵菌5.中 間 變 為 黑 色 為 產(chǎn)H2S5.2平板的制作平板的制作l將裝在

22、錐形瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基融化后，冷卻至50攝氏度左右傾入無(wú)菌培養(yǎng)皿中。l溫度過(guò)高時(shí)，皿蓋上冷凝水太多，溫度低于50攝氏度，培養(yǎng)基易于凝固而無(wú)法制作平板。l平板的制作應(yīng)在酒精燈旁進(jìn)行，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿錐形瓶的底部或試管，左手同時(shí)用小指和手掌將棉塞打開，灼瓶口。l用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫。置于桌上，輕輕旋轉(zhuǎn)平皿。使培養(yǎng)基均勻分布于整個(gè)平皿中，冷凝后即成平板。三、實(shí)驗(yàn)材料三、實(shí)驗(yàn)材料l3.1藥品l牛肉膏、蛋白胨、NaCl、酵母膏、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、MgSO47H2O和FeSO47H2O、馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂等。3.2溶液溶液l1mol/LNaOH、1mol/LHC

23、l。3.3儀器儀器l天平、高壓蒸汽滅菌器。3.4玻璃器皿玻璃器皿l移液管、試管、量筒、錐形瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。3.5其他常用器皿其他常用器皿l藥匙、pH試紙、稱量紙、記號(hào)筆、棉花、紗布、線繩、塑料試管蓋、牛皮紙、報(bào)紙等。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容l4.1肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制l4.1.1培養(yǎng)基成分l牛肉膏 5gl蛋白胨 10glNaCl 5gl瓊脂 15-20gl水 1000mllPh 7.24.1.2配制方法配制方法l（1）稱量及融化l分別稱取蛋白胨和NaCl的所需量，置于燒杯中，加入所需水量的2/3左右的蒸餾水，用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一燒杯中，進(jìn)行稱量。然后加入少量蒸餾水于小燒杯中，加

24、熱融化。倒入上述燒杯中。將燒杯置于石棉網(wǎng)上加熱，用玻璃棒攪拌，使藥品全部融化。l（2）調(diào)Ph 待溶液冷卻至室溫時(shí)，用1mol/lNaOH溶液調(diào)pH至7.2。l（3）定容 將溶液倒入量筒中，補(bǔ)充水量至所需體積。l（4）加瓊脂 加入所需量的瓊脂，加熱融化，補(bǔ)充失水。l（5）分裝、加塞、包扎。l（6）高壓蒸汽滅菌0.1MPa滅菌20min。l4.2高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基l4.3馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基4.4培養(yǎng)基使用注意事項(xiàng)l配制培養(yǎng)基所用的化學(xué)藥品，均應(yīng)化學(xué)純凈。l配制培養(yǎng)基時(shí)各種成分應(yīng)準(zhǔn)確稱量。l培養(yǎng)基的酸堿度，必須準(zhǔn)確測(cè)定，特別對(duì)含有指示劑的培養(yǎng)基；測(cè)定酸堿度須于冷卻后測(cè)定為準(zhǔn)。l制備的培養(yǎng)基必須保持澄清，以便細(xì)菌生長(zhǎng)后，容易觀察。液體培養(yǎng)基沉淀法和濾紙法；固體培養(yǎng)基可用脫脂棉花濾清。培養(yǎng)基使用注意事項(xiàng)l培養(yǎng)基必須達(dá)到完全無(wú)菌的目的。要注意有些培