微生物的培養(yǎng)與應用

1、1課題課題1 1 微生物的實驗室培養(yǎng)微生物的實驗室培養(yǎng)2 了解有關(guān)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識，進行無了解有關(guān)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識，進行無菌技術(shù)的操作，進行微生物的培養(yǎng)。菌技術(shù)的操作，進行微生物的培養(yǎng)。 一、課題目標：一、課題目標： 掌握掌握培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌高壓蒸氣滅菌和和平板劃線法平板劃線法等基本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范等基本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范地進行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。地進行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。無菌技術(shù)的操作。無菌技術(shù)的操作。二、課題重點和難點：二、課題重點和難點：三、技能目標：三、技能目標：課題課題1 1 微生物的實驗室培養(yǎng)微生物的實驗室培養(yǎng)3一、基礎(chǔ)知識 微生物微生物

2、: :1.1.特點：結(jié)構(gòu)都相當簡單特點：結(jié)構(gòu)都相當簡單, ,個體多數(shù)十分微小個體多數(shù)十分微小. .通常要通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結(jié)構(gòu)有細胞結(jié)構(gòu). .且體內(nèi)一般不含有葉綠素且體內(nèi)一般不含有葉綠素. .不能進行光不能進行光合作用合作用. .2.微生物包括五類微生物包括五類病病 毒毒細細 菌菌放線菌放線菌真真 菌菌原生動物原生動物4菌落： 單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體，叫形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體

3、，叫做菌落做菌落。 不同的細菌的菌落特征不同不同的細菌的菌落特征不同 菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)5固體培養(yǎng)基：菌落，菌苔固體培養(yǎng)基：菌落，菌苔61、定義、定義 為人工培養(yǎng)微生物而制備的、提供適合為人工培養(yǎng)微生物而制備的、提供適合微生物生長、繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基微生物生長、繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。質(zhì)。2、分類、分類 天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基培養(yǎng)基中化學成分分：培養(yǎng)基中化學成分分： 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 半合成培養(yǎng)基半合成培養(yǎng)基(二二)、培養(yǎng)基、培養(yǎng)基7 液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基按物理形態(tài)分：按物理形態(tài)分： 固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基 、常用的固體培養(yǎng)

4、基、常用的固體培養(yǎng)基: 瓊脂固體培養(yǎng)基瓊脂固體培養(yǎng)基. 、微生物在固體培微生物在固體培養(yǎng)基表面生長養(yǎng)基表面生長,可以形可以形成成 肉眼可見的肉眼可見的菌落菌落. 基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基按培養(yǎng)基功能分：按培養(yǎng)基功能分： 選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基 鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基 8選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基: : 分離酵母菌、霉菌等真菌分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: : 分離金黃色葡萄球菌分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基不加氮源的無氮培養(yǎng)基: : 分離固氮菌分離固氮菌 不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基: : 分離自養(yǎng)型微生物分離自

5、養(yǎng)型微生物 加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基: : 分離導入了目的基因的受體細胞分離導入了目的基因的受體細胞 加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的核苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)基: : 分離雜交瘤細胞分離雜交瘤細胞93、培養(yǎng)基內(nèi)所含的基本物質(zhì)、培養(yǎng)基內(nèi)所含的基本物質(zhì)(1)、水(2)、碳源 (3)、氮源(4)、無機鹽10(2)碳源碳源可作為碳源的物質(zhì)有可作為碳源的物質(zhì)有:含碳無機物含碳無機物: 、 、含碳有機物：含碳有機物：蛋白蛋白質(zhì)質(zhì) 脂肪酸脂肪酸返回返回 不同微生物所利用的碳源不同不同微生物所利用的碳源不同 異養(yǎng)型微生物的碳源為異養(yǎng)型微生物的碳源為 自

6、養(yǎng)型微生物的碳源為自養(yǎng)型微生物的碳源為碳酸鹽碳酸鹽碳酸氫鹽碳酸氫鹽二氧化碳二氧化碳糖類（主要）糖類（主要）含碳有機物（有機碳）含碳有機物（有機碳）含碳無機物（無機碳）含碳無機物（無機碳）11(3)氮源氮源可作為氮源的物質(zhì)有可作為氮源的物質(zhì)有:含氮無機物：含氮無機物： 、 、 、含氮有機物：含氮有機物：蛋白胨蛋白胨牛肉膏牛肉膏尿素尿素返回返回 固氮微生物所利用的氮源是固氮微生物所利用的氮源是氮氣氮氣 氨氣氨氣硝酸鹽硝酸鹽氨鹽氨鹽氮氣氮氣12(1)、pH值如:培養(yǎng)霉菌需酸性、培養(yǎng)細菌需中性或微堿性(2)、特殊營養(yǎng)物質(zhì)- ?如：培養(yǎng)乳酸桿菌需要在培養(yǎng)基中添加維生素(3)、氧氣的含量如:培養(yǎng)厭氧微生物

7、時需要提供無氧的條件4、培養(yǎng)基內(nèi)所需的其他條、培養(yǎng)基內(nèi)所需的其他條件件生長因子生長因子13無菌技術(shù)包括的四大方面無菌技術(shù)包括的四大方面1、對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，、對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。進行清潔和消毒。2、將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培、將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌。養(yǎng)基等器具進行滅菌。3、為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操、為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行。作應在酒精燈火焰附近進行。4、實驗操作時應避免已經(jīng)滅菌處理的餓材料、實驗操作時應避免已經(jīng)滅菌處理的餓材料用具與周圍的物品相接觸。用具與

8、周圍的物品相接觸。返回返回14(三三)、無菌技術(shù)、無菌技術(shù)1、獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵、獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵: 2、無菌技術(shù)包括的四大方面無菌技術(shù)包括的四大方面3、消毒與滅菌、消毒與滅菌(1)消毒：消毒：概念：使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體概念：使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物。包括芽孢表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物。包括芽孢和孢子嗎？和孢子嗎？方法方法:煮沸消毒法煮沸消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法:如牛奶的消毒如牛奶的消毒化學藥劑消毒化學藥劑消毒:酒精、氯氣、石碳酸、煤酚皂溶液等酒精、氯氣、石碳酸、煤酚皂溶液等 紫外線消毒紫外線消毒(不包括芽孢和孢

9、子不包括芽孢和孢子)防止外來雜菌的入侵防止外來雜菌的入侵15（2）滅菌）滅菌概念：使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的概念：使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。微生物，包括芽孢和孢子。方法：方法：a 灼燒滅菌灼燒滅菌 b 干熱滅菌干熱滅菌 c 高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌 灼燒滅菌灼燒滅菌微生物的接種工具微生物的接種工具 (接接種環(huán)、接種針種環(huán)、接種針)或其或其他金屬用具直接在火他金屬用具直接在火焰的充分燃燒層灼燒焰的充分燃燒層灼燒注意適用范圍注意適用范圍16 干熱滅菌干熱滅菌 160170 ；12h能耐高溫的需要保持干能耐高溫的需要保持干燥的物品燥的物品( 玻璃器皿玻璃器

10、皿) 高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌 100kPa 121 15-30min通常用于培養(yǎng)基的滅通常用于培養(yǎng)基的滅以手提式滅菌鍋最為常用以手提式滅菌鍋最為常用 .171.1.無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？外來微生物污染外，還有什么目的？2.2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。如果需要，請選擇合適的方法。（1 1） 培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2 2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管玻棒、試管、燒瓶和吸管（3 3） 實驗操作者

11、的雙手實驗操作者的雙手答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（答：（1）、（）、（2）需要滅菌；（）需要滅菌；（3）需要消毒。）需要消毒。18思考:1)無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？生物污染外，還有什么目的？ 2)消毒和滅菌有何不同？消毒和滅菌有何不同？3)為什么消毒牛奶要用巴氏消毒法為什么消毒牛奶要用巴氏消毒法?4)請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。需要，請選擇合

12、適的方法。培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿玻棒、試管、燒瓶和吸管玻棒、試管、燒瓶和吸管實驗操作者的雙手實驗操作者的雙手消毒消毒滅菌滅菌條件條件溫和溫和強烈強烈作用作用范圍范圍物體表面或內(nèi)部一部物體表面或內(nèi)部一部分分,不包括芽孢和孢子不包括芽孢和孢子物體內(nèi)外所有微生物物體內(nèi)外所有微生物,包括芽孢和孢子包括芽孢和孢子無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。滅菌滅菌 滅菌滅菌 消毒消毒營養(yǎng)成分不被破壞營養(yǎng)成分不被破壞19 二、實 驗 操 作 制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.1.牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方物質(zhì)物

13、質(zhì)牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨NaClNaCl瓊脂瓊脂水水重量重量5g5g10g10g5g5g20g20g定溶至定溶至1000mL1000mL2.2.稱量稱量 按比例稱取各種物質(zhì)。按比例稱取各種物質(zhì)。注意：牛肉膏要放在稱量紙上稱量，牛肉膏、蛋白胨注意：牛肉膏要放在稱量紙上稱量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，稱取時動作要迅速，稱后及時蓋上瓶蓋。都易吸潮，稱取時動作要迅速，稱后及時蓋上瓶蓋。203.3.溶化：溶化：4.4.滅菌：滅菌：5.5.倒平板：倒平板： 制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基 先將牛肉膏連同稱量紙一起放入燒杯，加少量先將牛肉膏連同稱量紙一起放入燒杯，加少量水，加熱至牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻

14、璃水，加熱至牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻璃棒取出稱量紙。加入蛋白胨和氯化鈉，用玻璃棒攪棒取出稱量紙。加入蛋白胨和氯化鈉，用玻璃棒攪拌使之溶解，再加入瓊脂，攪拌，待溶解后，加水拌使之溶解，再加入瓊脂，攪拌，待溶解后，加水定溶至定溶至100mL100mL。 將配制好培養(yǎng)基放到錐形瓶中（瓶口加棉塞，將配制好培養(yǎng)基放到錐形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮紙），連同培養(yǎng)皿（包上牛皮紙），連同培養(yǎng)皿（3 35 5套，用幾層報紙?zhí)?，用幾層報紙包好）一起放到高壓鍋?nèi)滅菌。包好）一起放到高壓鍋內(nèi)滅菌。 待培養(yǎng)基冷卻到待培養(yǎng)基冷卻到5050左右時倒平板。左右時倒平板。2122倒平板操作的討論 1. 1.培養(yǎng)基滅菌后

15、要冷卻到培養(yǎng)基滅菌后要冷卻到5050時倒平板。時倒平板。用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？ 2. 2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？ 用手觸摸錐形瓶，溫度下降到剛剛不燙手用手觸摸錐形瓶，溫度下降到剛剛不燙手時即可開始倒平板。時即可開始倒平板。 通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。養(yǎng)基。23 3.3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，為什么要將平板倒置？ 4.4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培

16、養(yǎng)微生皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？物嗎？為什么？ 平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。 空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。微生物。倒平板操作的討論24 純化大腸桿菌

17、微生物接種方法常見的有平板劃線法和稀微生物接種方法常見的有平板劃線法和稀釋涂布平板法。釋涂布平板法。1.1.平板劃線法平板劃線法 通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。基的表面。 在數(shù)次劃線后可以分離到由一個細胞繁殖在數(shù)次劃線后可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體稱而來的肉眼可見的子細胞群體稱菌落菌落。261、為什么在操作的第一步以及劃線之前都要灼燒接種、為什么在操作的第一步以及劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)？環(huán)？在劃線操作結(jié)束

18、時，仍然需要灼燒接種環(huán)？ 第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；的微生物污染培養(yǎng)物；平板劃線法的討論 每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。便得到菌落。 劃線結(jié)束后仍然要灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種劃線

19、結(jié)束后仍然要灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。272.2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？進行劃線？平板劃線法的討論3.3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？總是從上一次劃線的末端開始劃線？ 以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。 劃線后，線條末端細菌數(shù)比線條起始處劃線后，線條末端細菌數(shù)比線條起始處要少，每次從上一次劃線末端開始，能使細要少，每次從上一次劃線末端開

20、始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。2.2.稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法292.2.稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法 將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面進行培養(yǎng)。表面進行培養(yǎng)。 在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表微生物將分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。面形成單個的

21、菌落。稀釋涂布平板法操作過程分兩個步驟稀釋涂布平板法操作過程分兩個步驟: :系列稀釋操作系列稀釋操作涂布平板操作涂布平板操作系列稀釋操作系列稀釋操作101102103104105106(1)(1)將分別盛有將分別盛有9mL9mL水的試管滅菌并編號。水的試管滅菌并編號。(2)(2)用移液管吸取用移液管吸取1mL1mL培養(yǎng)的菌液，注入第二支試管中，培養(yǎng)的菌液，注入第二支試管中，輕壓橡皮頭，吹吸三次使之充分混勻。輕壓橡皮頭，吹吸三次使之充分混勻。(3)(3)從從10101 1倍稀釋的試管中吸取倍稀釋的試管中吸取1mL1mL稀釋液，注入第三支稀釋液，注入第三支試管中，重復步驟試管中，重復步驟2 2，直

22、至到第六支試管。，直至到第六支試管。32涂布平板操作涂布平板操作(1)(1)將涂布器浸在盛有將涂布器浸在盛有7070的酒精的燒杯中。的酒精的燒杯中。(2)(2)取少量菌液（不超取少量菌液（不超0.1mL0.1mL），滴加到培養(yǎng)基表），滴加到培養(yǎng)基表面。面。(3)(3)將沾有酒精的涂布器將沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄在火焰上引燃，火熄后冷卻后冷卻8 810s10s。(4)(4)用涂布器將菌液均勻用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。地涂布在培養(yǎng)基表面。2.2.稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法34涂布平板操作討論 涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結(jié)合平

23、板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第二步應如何進行無菌操作？一想，第二步應如何進行無菌操作？ 將接種后和未接種（作為對照組）的培養(yǎng)基將接種后和未接種（作為對照組）的培養(yǎng)基均放到均放到3737的恒溫箱中，培養(yǎng)的恒溫箱中，培養(yǎng)121224h24h后觀察并后觀察并記錄結(jié)果。記錄結(jié)果。 應從操作的各個細節(jié)保證應從操作的各個細節(jié)保證“無菌無菌”。如。如: :酒酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。35 1.1.未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有菌落生長，說明了什么？菌落生長，說明了什么？ 2.2.在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀察到獨立在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀察到獨立的菌落？它們的大小、形狀、顏色相似？的菌落？它們的大小、形狀、顏色相似？ 未接種