天然藥物化學(xué)第四章

1、第四章第四章柱色譜分離技術(shù)柱色譜分離技術(shù)教學(xué)目標(biāo)教學(xué)目標(biāo)1、理解吸附色譜和分配色譜的基本原理,掌握常用吸附劑的特點(diǎn)及適用范圍.2、掌握聚酰胺色譜，凝膠過(guò)濾色譜的原理、特點(diǎn)及應(yīng)用。3、掌握中藥有效成分結(jié)構(gòu)鑒定的一般方法。4、掌握大孔樹(shù)脂法的原理及應(yīng)用。20世紀(jì)初由俄國(guó)的植物學(xué)家世紀(jì)初由俄國(guó)的植物學(xué)家Tswett創(chuàng)立。創(chuàng)立。讓從綠葉中提取出來(lái)的色素石油醚溶液，讓從綠葉中提取出來(lái)的色素石油醚溶液，通過(guò)一根填滿通過(guò)一根填滿CaCO3的細(xì)長(zhǎng)玻璃柱，然的細(xì)長(zhǎng)玻璃柱，然后用純凈的石油醚加以沖洗，結(jié)果在玻后用純凈的石油醚加以沖洗，結(jié)果在玻璃柱內(nèi)的植物綠葉色素就被分離成幾個(gè)璃柱內(nèi)的植物綠葉色素就被分離成幾個(gè)具有

2、不同顏色的譜帶，然后按譜帶顏色具有不同顏色的譜帶，然后按譜帶顏色對(duì)混合物進(jìn)行鑒定分析，稱之為色譜。對(duì)混合物進(jìn)行鑒定分析，稱之為色譜。色譜法是目前被廣泛應(yīng)用的分離純化和鑒色譜法是目前被廣泛應(yīng)用的分離純化和鑒定化合物的一種有效方法。定化合物的一種有效方法。優(yōu)點(diǎn)：試料用量少，分離效率高。用一般優(yōu)點(diǎn)：試料用量少，分離效率高。用一般分離方法無(wú)法分離的化合物，如天然產(chǎn)物分離方法無(wú)法分離的化合物，如天然產(chǎn)物中結(jié)構(gòu)相似，性質(zhì)相似的成分，色譜分離中結(jié)構(gòu)相似，性質(zhì)相似的成分，色譜分離能獲得很好的分離效果。已成為化學(xué)領(lǐng)域能獲得很好的分離效果。已成為化學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)重要的分離、分析工具。中一個(gè)重要的分離、分析工具。色譜

3、法的分類：1、按固定相或支持劑的種類可分為氧化鋁色譜；硅膠色譜；聚酰胺色譜；凝膠色譜等。2、按移動(dòng)相種類可分為氣相色譜；液相色譜。3、按操作方式可分為柱色譜；紙色譜；薄層色譜。4、按分離原理可分為吸附色譜；分配色譜；離子交換色譜、凝膠色譜。第一節(jié)第一節(jié) 吸附柱層析吸附柱層析一、基本概念：一、基本概念： 利用作為固定相的吸附劑對(duì)混合物中各利用作為固定相的吸附劑對(duì)混合物中各種成分吸附力的大小不同，使各成分得種成分吸附力的大小不同，使各成分得到相互分離的方法。適用于分離中等分到相互分離的方法。適用于分離中等分子量的脂溶性物質(zhì)。子量的脂溶性物質(zhì)。二、基本原理二、基本原理 化學(xué)吸附化學(xué)吸附(不可逆不可逆

4、) 半化學(xué)吸附半化學(xué)吸附(氫鍵氫鍵,可逆可逆) 物理吸附物理吸附(可逆可逆)（1）有較大表面積和足夠的吸附力）有較大表面積和足夠的吸附力（2）對(duì)不同化學(xué)組分有不同的吸附量，）對(duì)不同化學(xué)組分有不同的吸附量，能較好的分離能較好的分離（3）化學(xué)惰性，不與溶劑及樣品中各組）化學(xué)惰性，不與溶劑及樣品中各組分起反應(yīng)分起反應(yīng)（4）不溶于溶劑和洗脫劑）不溶于溶劑和洗脫劑（5）顆粒均勻，有一定機(jī)械強(qiáng)度和細(xì)度）顆粒均勻，有一定機(jī)械強(qiáng)度和細(xì)度物理吸附物理吸附:三、吸附劑三、吸附劑 硅膠：硅膠： 聚硅酸分子經(jīng)過(guò)不同程度的脫水而聚硅酸分子經(jīng)過(guò)不同程度的脫水而形成的干燥多孔性物質(zhì)，微呈酸性的。形成的干燥多孔性物質(zhì)，微呈酸

5、性的。 SiO2XH2O為硅氧烷交鏈結(jié)構(gòu)：為硅氧烷交鏈結(jié)構(gòu)：有硅醇基，吸附力強(qiáng)弱，取決于硅醇基有硅醇基，吸附力強(qiáng)弱，取決于硅醇基 的多少的多少。通過(guò)氫鍵吸水，吸附性下降，通過(guò)氫鍵吸水，吸附性下降，105120可除去絕大部分水?？沙ソ^大部分水。200時(shí)，時(shí)，水失殆盡。表面活性最大，吸附力最強(qiáng)。水失殆盡。表面活性最大，吸附力最強(qiáng)。O O S Si iO OO OO O S Si iO OO OO OH H分離范圍廣：分離范圍廣：柱層析：柱層析：120160目目薄層用薄層用180目目氧化鋁氧化鋁 180烘烘6個(gè)小時(shí)，含水個(gè)小時(shí)，含水3 （1）酸性：適用于有機(jī)酸）酸性：適用于有機(jī)酸,不能分離堿性物質(zhì)

6、不能分離堿性物質(zhì). （2）堿性：分離碳?xì)浠衔?、生物堿、甾族類化合物。不）堿性：分離碳?xì)浠衔?、生物堿、甾族類化合物。不適合醛、酮、酯及有機(jī)酸的分離，可發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。適合醛、酮、酯及有機(jī)酸的分離，可發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 （3）中性：中性的、堿性、脂溶性化合物的分離。）中性：中性的、堿性、脂溶性化合物的分離。 聚酰胺：聚酰胺： 由酰胺聚合而成的一類高分子化合物。由酰胺聚合而成的一類高分子化合物。尼龍，錦綸尼龍，錦綸H H2 2C CN NH HC CC CH H2 2H H2 2C CC CH H2 2H H2 2C CO OO OC CC CH H2 2N NH H2 2C CC CH H2 2H

7、H2 2C CH HC CH H2 2H H2 2C CC CO OH HO OO OH H3 3C CC CH H3 3H H3 3C CC CH H3 3O O固定相固定相移動(dòng)相移動(dòng)相形成氫鍵的能力受以下因素影響形成氫鍵的能力受以下因素影響 溶劑的種類溶劑的種類（聚酰胺在水中形成氫鍵的能力最強(qiáng)，在（聚酰胺在水中形成氫鍵的能力最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中較弱，在堿性溶液中最弱。有機(jī)溶劑中較弱，在堿性溶液中最弱?；衔锓肿咏Y(jié)構(gòu)化合物分子結(jié)構(gòu) A：化合物分子中能形成氫鍵的基團(tuán)數(shù)目越多，被聚酰：化合物分子中能形成氫鍵的基團(tuán)數(shù)目越多，被聚酰胺吸附越強(qiáng)。胺吸附越強(qiáng)。 B：成鍵基團(tuán)的位置不同，被聚酰胺吸附的強(qiáng)度也

8、不同。：成鍵基團(tuán)的位置不同，被聚酰胺吸附的強(qiáng)度也不同。 C：分子中芳香核、共軛雙鍵多者被吸附強(qiáng)度小。：分子中芳香核、共軛雙鍵多者被吸附強(qiáng)度小。 D：能形成分子內(nèi)氫鍵者被吸附強(qiáng)度?。耗苄纬煞肿觾?nèi)氫鍵者被吸附強(qiáng)度小.活性炭：活性炭：屬于非極性吸附劑屬于非極性吸附劑,對(duì)極性物質(zhì)的吸附力弱對(duì)極性物質(zhì)的吸附力弱,對(duì)非極性物質(zhì)的吸附力強(qiáng)對(duì)非極性物質(zhì)的吸附力強(qiáng). 粉末狀粉末狀(吸附力強(qiáng),適合于極性大的化合物的分離) 顆粒狀顆粒狀(吸附力居中,適合于極性不太大的化合物的分離)錦綸活性碳錦綸活性碳(以錦綸錦綸為粘合劑,吸附力弱,適合極性小的化合物的分離)活性炭的吸附規(guī)律活性炭的吸附規(guī)律1、極性基團(tuán)多時(shí)，在活性碳

9、上的吸附力弱，反之則強(qiáng)。、極性基團(tuán)多時(shí)，在活性碳上的吸附力弱，反之則強(qiáng)。2、在一定條件下，化合物母體結(jié)構(gòu)較大時(shí)，吸附力強(qiáng)，、在一定條件下，化合物母體結(jié)構(gòu)較大時(shí)，吸附力強(qiáng)，反之則弱。反之則弱。例如：對(duì)多糖的吸附力大于單糖；對(duì)多肽的吸附力大于氨基例如：對(duì)多糖的吸附力大于單糖；對(duì)多肽的吸附力大于氨基酸。酸。3、對(duì)芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物。、對(duì)芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物。4、對(duì)生物堿的吸附力，一般在堿性溶液中強(qiáng)，而在酸性溶、對(duì)生物堿的吸附力，一般在堿性溶液中強(qiáng)，而在酸性溶液中弱（呈鹽增大了極性）；相反，對(duì)于有機(jī)酸、酚類化合液中弱（呈鹽增大了極性）；相反，對(duì)于有機(jī)酸、酚類化合物的吸

10、附力，則在酸性溶液中吸附力強(qiáng)，而在堿性中弱。物的吸附力，則在酸性溶液中吸附力強(qiáng)，而在堿性中弱?；钚蕴嫉念A(yù)處理：該物質(zhì)對(duì)空氣有一定程度的吸附力，氣體活性碳的預(yù)處理：該物質(zhì)對(duì)空氣有一定程度的吸附力，氣體分子被活性碳吸附后占據(jù)了其吸附表面，使活性碳吸附活性分子被活性碳吸附后占據(jù)了其吸附表面，使活性碳吸附活性下降，即中毒。下降，即中毒。所以使用前需活化處理：在所以使用前需活化處理：在120150的烘箱中烘的烘箱中烘26小時(shí)。小時(shí)。四：溶劑選擇何種溶劑為移動(dòng)相對(duì)分離效果有極大的影響。所用溶劑應(yīng)具備純度高、不含水份；與試樣、吸附劑不起化學(xué)反應(yīng)；對(duì)被分離成分有適當(dāng)?shù)娜芙舛?；黏度??；易揮散。對(duì)于極性吸附劑，若

11、選擇的流動(dòng)相溶劑極性越大，則其展開(kāi)或洗脫能力就越強(qiáng)；反之，則剛好相反；在選擇時(shí)要考慮被分離的物質(zhì)的性質(zhì)。五：被分離的物質(zhì)五：被分離的物質(zhì)被分離物質(zhì)、吸附劑、溶劑三者為組成吸附色譜必不可少的被分離物質(zhì)、吸附劑、溶劑三者為組成吸附色譜必不可少的要素。要素。對(duì)于極性吸附劑，被分離物質(zhì)的極性越大，被吸附越強(qiáng)，溶對(duì)于極性吸附劑，被分離物質(zhì)的極性越大，被吸附越強(qiáng)，溶劑進(jìn)行洗脫就越困難。劑進(jìn)行洗脫就越困難。一般來(lái)說(shuō)：一般來(lái)說(shuō)：若被分離的物質(zhì)極性大，可選用活度較低的吸附劑，而移動(dòng)若被分離的物質(zhì)極性大，可選用活度較低的吸附劑，而移動(dòng)相的極性大；相的極性大；若被分離的物質(zhì)極性小，可選用活度較高的吸附劑，而移動(dòng)若被

12、分離的物質(zhì)極性小，可選用活度較高的吸附劑，而移動(dòng)相的極性??；相的極性??；六、操作方式六、操作方式裝柱裝柱：所需的玻璃柱內(nèi)徑與柱長(zhǎng)之比是所需的玻璃柱內(nèi)徑與柱長(zhǎng)之比是1：151：20之間。之間。粒度在粒度在100目左右。分離試樣與吸附劑用量比為目左右。分離試樣與吸附劑用量比為1：301：60注意上樣體積不能太大。注意上樣體積不能太大。上樣上樣分為干法和濕法上樣兩種。分為干法和濕法上樣兩種。洗脫洗脫適當(dāng)控制流速適當(dāng)控制流速收集檢查收集檢查第二節(jié)第二節(jié) 分配柱層析分配柱層析一、基本概念：一、基本概念： 利用混合物中各成分在互不相容的兩相利用混合物中各成分在互不相容的兩相溶劑中分配系數(shù)的不同，來(lái)達(dá)到分離

13、的溶劑中分配系數(shù)的不同，來(lái)達(dá)到分離的色譜分離方法。色譜分離方法。msCC 分配系數(shù)（分配系數(shù)（K） 組分在流動(dòng)相中的濃度組分在固定相中的濃度二、基本原理：二、基本原理： 相當(dāng)于一種連續(xù)性的溶劑提取方法。兩相溶劑中的相當(dāng)于一種連續(xù)性的溶劑提取方法。兩相溶劑中的一相為固定相，常以某種惰性固體吸住該相溶劑，一相為固定相，常以某種惰性固體吸住該相溶劑，使之固定，這種惰性固體稱之為支持劑或載體或單使之固定，這種惰性固體稱之為支持劑或載體或單體。另一相為移動(dòng)相。體。另一相為移動(dòng)相。進(jìn)行分離時(shí)，將被分離的組分加到固定相上，通過(guò)移動(dòng)相進(jìn)行分離時(shí)，將被分離的組分加到固定相上，通過(guò)移動(dòng)相的流動(dòng)，使試樣中各成分在兩

14、相之間的分配不同而的流動(dòng)，使試樣中各成分在兩相之間的分配不同而獲得分離。獲得分離。分配色譜根據(jù)固定相與移動(dòng)相的極性不同可分為以下兩種：1、正相色譜：以極性大的溶劑（如水、親水性的溶劑）為固定相，極性小的溶劑為移動(dòng)相的分配色譜。常用于分離極性大的組分，例如生物堿、糖類、苷類、有機(jī)酸等，固定相常用水或緩沖液，移動(dòng)相則是氯仿、乙酸乙酯、丁醇。極性小的組分先出來(lái)，極性大的組分后出來(lái)。2、反相色譜：以極性小的溶劑（如氯仿、石油醚等親脂性溶劑）為固定相，極性大的溶劑為移動(dòng)相的分配色譜。常用于分離極性小的脂溶性的化合物，例如油脂、高級(jí)脂肪酸、游離甾體等，固定相常用石蠟油，移動(dòng)相則是水或甲醇。極性大的組分先出

15、來(lái)，極性小的組分后出來(lái)。三、支持劑三、支持劑 纖維粉、硅膠、硅藻土纖維粉、硅膠、硅藻土 （1）中性多孔性粉末，無(wú)吸附作用或吸）中性多孔性粉末，無(wú)吸附作用或吸附作用很弱附作用很弱（2）不溶于層析所用的溶劑系統(tǒng)）不溶于層析所用的溶劑系統(tǒng)（3）能吸附相當(dāng)量的固定相，且流動(dòng)相）能吸附相當(dāng)量的固定相，且流動(dòng)相能自由通過(guò)能自由通過(guò)反相色譜多采用碳十八烷基（反相色譜多采用碳十八烷基（-C18H37）鍵合硅膠作為固定）鍵合硅膠作為固定相。相。原理是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)，使形成具有親油性表面的穩(wěn)定固定相。原理是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)，使形成具有親油性表面的穩(wěn)定固定相。若硅膠表面鍵合的基團(tuán)為氨基時(shí)，則用于正相分配色譜。若硅膠表面鍵

16、合的基團(tuán)為氨基時(shí)，則用于正相分配色譜。四、溶劑系統(tǒng)（可用混合溶劑）四、溶劑系統(tǒng)（可用混合溶劑）五、被分離物質(zhì)（誰(shuí)先出）五、被分離物質(zhì)（誰(shuí)先出）六、操作方式六、操作方式裝柱：固定相：支持劑（裝柱：固定相：支持劑（0.5:11:1),二者要充分?jǐn)嚢瓒咭浞謹(jǐn)嚢?濾除多濾除多余的固定相余的固定相,然后倒入所用的移動(dòng)相中然后倒入所用的移動(dòng)相中,劇烈攪拌使二者相劇烈攪拌使二者相互飽和平衡互飽和平衡.裝柱時(shí)先將固定腥飽和的移動(dòng)相加入到色譜裝柱時(shí)先將固定腥飽和的移動(dòng)相加入到色譜柱內(nèi)柱內(nèi),再按濕法裝柱操作裝入吸著固定相的支持劑再按濕法裝柱操作裝入吸著固定相的支持劑. 加樣加樣:一般支持劑的為上樣量的一般支持

17、劑的為上樣量的1001000倍倍.1、對(duì)于易溶于固定相的，將試樣溶于少量的固定相后，加、對(duì)于易溶于固定相的，將試樣溶于少量的固定相后，加入少量支持劑拌勻，裝入柱頂。入少量支持劑拌勻，裝入柱頂。2、對(duì)于可溶于移動(dòng)相者，則直接溶于移動(dòng)相中后加入柱頂。、對(duì)于可溶于移動(dòng)相者，則直接溶于移動(dòng)相中后加入柱頂。3、對(duì)于在兩相中均難溶者，則以使用的低沸點(diǎn)溶劑溶解后，、對(duì)于在兩相中均難溶者，則以使用的低沸點(diǎn)溶劑溶解后，加入干燥的支持劑拌勻，揮去溶劑，再用一定量的固定相拌加入干燥的支持劑拌勻，揮去溶劑，再用一定量的固定相拌勻，裝入柱頂。勻，裝入柱頂。洗脫：洗脫：所用的移動(dòng)相均需先與固定相飽和。所用的移動(dòng)相均需先與

18、固定相飽和。第三節(jié)第三節(jié) 離子交換樹(shù)脂柱層析離子交換樹(shù)脂柱層析一、基本概念一、基本概念利用離子交換樹(shù)脂上的功能基能在水溶液中與溶液的其他離子利用離子交換樹(shù)脂上的功能基能在水溶液中與溶液的其他離子進(jìn)行可逆性交換的性質(zhì)進(jìn)行可逆性交換的性質(zhì),以離子交換樹(shù)脂為固定相以離子交換樹(shù)脂為固定相,使混合使混合成分中離子型與非離子型物質(zhì)、或具有不同解離度的離成分中離子型與非離子型物質(zhì)、或具有不同解離度的離子化合物得到分離的一種色譜分離法。子化合物得到分離的一種色譜分離法。常用于分離具有解離能力的酸性、堿性及兩性的化合物，例如常用于分離具有解離能力的酸性、堿性及兩性的化合物，例如生物堿、氨基酸、有機(jī)酸、酚類、肽類

19、等。生物堿、氨基酸、有機(jī)酸、酚類、肽類等。二、基本原理二、基本原理主要由苯乙烯經(jīng)二乙烯苯鉸鏈主要由苯乙烯經(jīng)二乙烯苯鉸鏈形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。C HC H2C HC H2S O3HC H2S O3HC HC H2H2CC H 2S O3HH CS O3H分類：陽(yáng)離子交換樹(shù)脂強(qiáng)酸性（-SO3H）弱酸性（-COOH）陰離子交換樹(shù)脂強(qiáng)堿性-N（CH3）3.X弱堿性(-NHR)或(NH2)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 R-SO3-H+M+OH- R-SO3-M+H2O陰離子交換樹(shù)脂 R-N+OH-+M-OH+ R-N+M- +H2O是可逆的。三、離子交換樹(shù)脂的選擇三、離子交換樹(shù)脂的選擇1、若被分離的物質(zhì)帶正

20、電荷，選擇陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。、若被分離的物質(zhì)帶正電荷，選擇陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。反之，選擇陰離子交換樹(shù)脂。反之，選擇陰離子交換樹(shù)脂。2、若被分離的組分酸堿性強(qiáng)，易與離子交換樹(shù)脂進(jìn)、若被分離的組分酸堿性強(qiáng)，易與離子交換樹(shù)脂進(jìn)行可逆性，易被吸附，則用弱酸性的或弱堿性的離行可逆性，易被吸附，則用弱酸性的或弱堿性的離子交換樹(shù)脂，以免洗脫和再生困難。反之用強(qiáng)酸性子交換樹(shù)脂，以免洗脫和再生困難。反之用強(qiáng)酸性的或強(qiáng)堿性的離子交換樹(shù)脂。的或強(qiáng)堿性的離子交換樹(shù)脂。3、若被分離物質(zhì)的分子量大，選擇低鉸鏈度的樹(shù)脂，、若被分離物質(zhì)的分子量大，選擇低鉸鏈度的樹(shù)脂，若分子量小的用高鉸鏈度樹(shù)脂，以便于離子易于擴(kuò)散若分子量小的用高鉸

21、鏈度樹(shù)脂，以便于離子易于擴(kuò)散和交換。和交換。4、還要注意交換容量（單位重量或單位體積的樹(shù)脂所、還要注意交換容量（單位重量或單位體積的樹(shù)脂所能交換的離子的毫克當(dāng)量數(shù)，單位是毫克當(dāng)量能交換的離子的毫克當(dāng)量數(shù)，單位是毫克當(dāng)量/克表示。克表示。四、影響離子交換的因素四、影響離子交換的因素溶液的酸堿度溶液的酸堿度有重要影響：有重要影響：1、對(duì)于陽(yáng)離子交換樹(shù)脂來(lái)說(shuō)，交換溶液中氫離子、對(duì)于陽(yáng)離子交換樹(shù)脂來(lái)說(shuō)，交換溶液中氫離子濃度過(guò)高時(shí)，由于同離子效應(yīng)，抑制了陽(yáng)離子交換濃度過(guò)高時(shí)，由于同離子效應(yīng)，抑制了陽(yáng)離子交換樹(shù)脂中酸性基團(tuán)的解離，離子間的交換就很少進(jìn)行樹(shù)脂中酸性基團(tuán)的解離，離子間的交換就很少進(jìn)行或難以進(jìn)行

22、?；螂y以進(jìn)行。2、反之陰離子交換樹(shù)脂也是如此。、反之陰離子交換樹(shù)脂也是如此。所以強(qiáng)酸性樹(shù)脂交換液的所以強(qiáng)酸性樹(shù)脂交換液的PH值應(yīng)大于值應(yīng)大于3；弱酸性樹(shù)脂；弱酸性樹(shù)脂交換液的交換液的PH值應(yīng)大于值應(yīng)大于6；強(qiáng)堿性樹(shù)脂交換液的；強(qiáng)堿性樹(shù)脂交換液的PH值應(yīng)值應(yīng)小于小于10；弱堿性樹(shù)脂交換液的；弱堿性樹(shù)脂交換液的PH值應(yīng)小于值應(yīng)小于7。欲交換的化合物性質(zhì)欲交換的化合物性質(zhì)1、解離常數(shù)大，酸堿性強(qiáng)時(shí)，容易交換，但洗脫困難。、解離常數(shù)大，酸堿性強(qiáng)時(shí)，容易交換，但洗脫困難。2、解離離子的價(jià)數(shù)愈高，則吸附性愈強(qiáng)，愈易交換吸附；、解離離子的價(jià)數(shù)愈高，則吸附性愈強(qiáng)，愈易交換吸附；反之，難以交換吸附。反之，難以交

23、換吸附。欲交換的化合物的濃度欲交換的化合物的濃度通常在水或稀醇溶液中進(jìn)行。通常在水或稀醇溶液中進(jìn)行。1、濃度低，易于交換。、濃度低，易于交換。2、濃度高時(shí)，由于濃度差的影響，樹(shù)脂網(wǎng)孔會(huì)失水而造、濃度高時(shí)，由于濃度差的影響，樹(shù)脂網(wǎng)孔會(huì)失水而造成網(wǎng)孔收縮，影響交換。成網(wǎng)孔收縮，影響交換。交換液溫度的影響交換液溫度的影響（溫度高有利于交換，但熱不穩(wěn)定成分不（溫度高有利于交換，但熱不穩(wěn)定成分不適用）適用）交換溶劑的影響交換溶劑的影響（在極性小的溶劑里難以進(jìn)行，主要是因?yàn)殡y（在極性小的溶劑里難以進(jìn)行，主要是因?yàn)殡y解離）解離）交換流速的影響交換流速的影響（控制流速，否則交換不完全）（控制流速，否則交換不完

24、全）五五 操作方式操作方式樹(shù)脂的預(yù)處理樹(shù)脂的預(yù)處理（先用水浸泡（先用水浸泡2-3天再用天再用酸堿處理。陽(yáng)離子交換樹(shù)脂鈉型用酸酸堿處理。陽(yáng)離子交換樹(shù)脂鈉型用酸-堿堿-酸處理；酸處理；陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂氯型用堿陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂氯型用堿-酸酸-堿處理，以除去堿處理，以除去小分子有機(jī)物和鐵鈣等雜質(zhì)）。小分子有機(jī)物和鐵鈣等雜質(zhì)）。裝柱裝柱交換交換洗脫（先用自來(lái)水洗至無(wú)色，在用洗脫劑洗。酸性化洗脫（先用自來(lái)水洗至無(wú)色，在用洗脫劑洗。酸性化合物用一定濃度的酸來(lái)洗，合物用一定濃度的酸來(lái)洗，0.1-1N鹽酸鹽酸;堿性化合物用堿性化合物用一定濃度的堿來(lái)洗，一定濃度的堿來(lái)洗，0.1-1N氨水氨水;被吸附的化合物按酸被

25、吸附的化合物按酸堿性由小到大的順序先后被洗下堿性由小到大的順序先后被洗下)樹(shù)脂的再生樹(shù)脂的再生還是用酸堿處理還是用酸堿處理,加水保存加水保存.為了防止長(zhǎng)時(shí)間不用而發(fā)霉為了防止長(zhǎng)時(shí)間不用而發(fā)霉,可在可在水中加一層甲苯水中加一層甲苯)第四節(jié)第四節(jié) 大孔吸附樹(shù)脂柱層析大孔吸附樹(shù)脂柱層析一、基本原理一、基本原理主要為白色球形顆粒，粒度通常為主要為白色球形顆粒，粒度通常為2060目，為苯乙烯和二乙烯苯或目，為苯乙烯和二乙烯苯或2-甲基甲基丙稀酸樹(shù)脂等聚合而成的高分子網(wǎng)狀孔穴結(jié)構(gòu)。理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸丙稀酸樹(shù)脂等聚合而成的高分子網(wǎng)狀孔穴結(jié)構(gòu)。理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸堿及有機(jī)溶劑，對(duì)有機(jī)物有較好的選擇性，不

26、受無(wú)機(jī)鹽類及強(qiáng)離子低分堿及有機(jī)溶劑，對(duì)有機(jī)物有較好的選擇性，不受無(wú)機(jī)鹽類及強(qiáng)離子低分子化合物存在的影響。子化合物存在的影響。1、大孔吸附樹(shù)脂通過(guò)范德華力或形成氫鍵等分子間力吸附有機(jī)化合物。、大孔吸附樹(shù)脂通過(guò)范德華力或形成氫鍵等分子間力吸附有機(jī)化合物。2、其本身的多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)決定了具有篩選性分離的特點(diǎn)。、其本身的多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)決定了具有篩選性分離的特點(diǎn)。二、影響分離因素二、影響分離因素1、樹(shù)脂本身化學(xué)結(jié)構(gòu)、樹(shù)脂本身化學(xué)結(jié)構(gòu)極性樹(shù)脂用于吸附極性化合物，非極性樹(shù)脂用于吸附非極性化極性樹(shù)脂用于吸附極性化合物，非極性樹(shù)脂用于吸附非極性化合物。合物。2、被分離成分的性質(zhì)、被分離成分的性質(zhì)一般而言，極性較

27、大的成分適宜在中極性的樹(shù)脂上一般而言，極性較大的成分適宜在中極性的樹(shù)脂上進(jìn)行分離，而極性較小的成分適宜在非極性的樹(shù)脂進(jìn)行分離，而極性較小的成分適宜在非極性的樹(shù)脂上進(jìn)行分離；化合物分子體積較大者，宜選用較大上進(jìn)行分離；化合物分子體積較大者，宜選用較大孔徑者，以利于分離。孔徑者，以利于分離。3、溶劑的影響、溶劑的影響（1）PH值的影響值的影響一般而言，酸性化合物宜在酸性溶液中被吸附；一般而言，酸性化合物宜在酸性溶液中被吸附；堿性化合物宜在堿性溶液中被吸附；堿性化合物宜在堿性溶液中被吸附；中性化合物宜在中性溶液中被吸附；中性化合物宜在中性溶液中被吸附；（2）洗脫劑的種類及濃度。）洗脫劑的種類及濃度。

28、對(duì)于非極性的樹(shù)脂，洗脫劑的極性越小，洗脫能力越強(qiáng)；對(duì)于非極性的樹(shù)脂，洗脫劑的極性越小，洗脫能力越強(qiáng)；對(duì)于中極性和極性樹(shù)脂，則宜選用極性較大的洗脫劑。對(duì)于中極性和極性樹(shù)脂，則宜選用極性較大的洗脫劑。三、操作方式三、操作方式 1、預(yù)處理（含有一定量的致孔劑、分散劑、未聚合的單體化預(yù)處理（含有一定量的致孔劑、分散劑、未聚合的單體化合物，以乙醇濕法裝柱，繼續(xù)用乙醇在柱上流動(dòng)清洗，不時(shí)合物，以乙醇濕法裝柱，繼續(xù)用乙醇在柱上流動(dòng)清洗，不時(shí)檢查流出的乙醇，當(dāng)流出的乙醇液與水混合不呈現(xiàn)白色乳濁檢查流出的乙醇，當(dāng)流出的乙醇液與水混合不呈現(xiàn)白色乳濁現(xiàn)象即可用大量的蒸餾水洗去乙醇）?，F(xiàn)象即可用大量的蒸餾水洗去乙醇）

29、。2、裝柱和上樣、裝柱和上樣3、洗脫（水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等）、洗脫（水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等）4、樹(shù)脂柱的清洗（使用后其表面或內(nèi)部會(huì)有許多非吸、樹(shù)脂柱的清洗（使用后其表面或內(nèi)部會(huì)有許多非吸附性成分或吸附性雜質(zhì)殘留，必須經(jīng)清洗而除去）。附性成分或吸附性雜質(zhì)殘留，必須經(jīng)清洗而除去）。5、再生（若選用了非水溶性的有機(jī)溶劑作為洗脫劑，、再生（若選用了非水溶性的有機(jī)溶劑作為洗脫劑，用甲醇反復(fù)沖洗樹(shù)脂柱即可；若選用了水溶性的有機(jī)溶用甲醇反復(fù)沖洗樹(shù)脂柱即可；若選用了水溶性的有機(jī)溶劑作為洗脫劑，用蒸餾水反復(fù)沖洗樹(shù)脂柱即可）。劑作為洗脫劑，用蒸餾水反復(fù)沖洗樹(shù)脂柱即可）。第五節(jié)第五節(jié) 凝膠和柱

30、層析凝膠和柱層析一、基本概念一、基本概念又稱為凝膠濾過(guò)色譜、凝膠滲透色譜、分子篩濾過(guò)色譜及排阻又稱為凝膠濾過(guò)色譜、凝膠滲透色譜、分子篩濾過(guò)色譜及排阻色譜，是以凝膠作為固定相，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┻M(jìn)行洗脫，使色譜，是以凝膠作為固定相，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┻M(jìn)行洗脫，使混合物中分子量大小不同的化合物得到分離的方法。主要用混合物中分子量大小不同的化合物得到分離的方法。主要用于天然藥物中大小分子化合物的分離，如蛋白質(zhì)、酶、多肽、于天然藥物中大小分子化合物的分離，如蛋白質(zhì)、酶、多肽、氨基酸、多糖、甾體、苷類等。氨基酸、多糖、甾體、苷類等。二、基本原理二、基本原理凝膠是具有多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。由于受凝膠顆粒中

31、網(wǎng)孔半徑的限制，被分離試樣中比網(wǎng)孔小的化合物可自由進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部；而比網(wǎng)孔大的化合物不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部被排阻。三、凝膠的種類及性能三、凝膠的種類及性能1葡聚糖凝膠：又稱為交聯(lián)葡聚糖（Sephadex） ，是由葡聚糖和甘油通過(guò)醚橋(-OCH2CHOHCH2O-)相交鏈而成的多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，其部分結(jié)構(gòu)如圖所示。具有親水性，但不溶于水，稀酸堿和鹽溶液，能在水中溶脹成膠粒，在PH310穩(wěn)定，適用于分離水溶性成份如蛋白質(zhì)，肽，氨基酸，糖及苷類等，應(yīng)用最為廣泛。葡聚糖凝膠顆粒的網(wǎng)孔大小取決于制備時(shí)所添加交聯(lián)劑的比例。若交聯(lián)劑量多，則交聯(lián)度大，網(wǎng)孔緊密，孔徑小，吸水少；反之 交聯(lián)劑量少，網(wǎng)孔稀疏，孔

32、徑大，吸水多。商品型號(hào)按交聯(lián)度大小分類，并以每克干凝膠吸水量10倍的數(shù)值來(lái)表示，如凝膠G-25型表示吸水量為2.5ml/g的葡聚糖凝膠。不同規(guī)格的葡聚糖凝膠適合用于分離不同分子量的化合物。交聯(lián)葡聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)OC H2OO HO HOC H2C H2C H O HHHHHHC H2OHOHO HO HHHC H2OHOC H2OHO HO HHO HHOHOC H2OHO HO HHHO HHOC H3C H O HC H3OOO HHHO HHOC H2HOOHHO HHO HHC H2OOC H2C H3O HC H2O2葡聚糖凝膠LH-20（ Sephadex LH-20） ：葡聚糖凝膠LH-20分子中引入了親脂性