培訓-紫外可見風光光度計的原理及應用

1、勞模工作室化驗組勞模工作室化驗組20172017年年4 4月月1414日日主主 講：周講：周 眾眾“紫外紫外- -可見分光光度計的原理及應用可見分光光度計的原理及應用”培訓培訓紫外紫外-可見分光光度計的原理及應用可見分光光度計的原理及應用 利用紫外-可見分光光度計測量物質(zhì)對紫外-可見光的吸收程度（吸光度）和紫外-可見吸收光譜來確定物質(zhì)的組成、含量，推測物質(zhì)結(jié)果的分析方法，稱為紫外-可見吸收光譜法或紫外-可見分光光度法，屬于分子吸光分析法。1紫外紫外-可見分光光度計的原理可見分光光度計的原理 根據(jù)物質(zhì)對光的吸收特征和吸收強度，對物質(zhì)進行根據(jù)物質(zhì)對光的吸收特征和吸收強度，對物質(zhì)進行定性定性和和定量

2、定量的分析方法，稱為分光光度法。的分析方法，稱為分光光度法。 光區(qū)波長在光區(qū)波長在200-380nm 紫外光區(qū)紫外光區(qū) 光區(qū)波長在光區(qū)波長在380-780nm 可見光區(qū)可見光區(qū)1紫外紫外-可見分光光度法的原理可見分光光度法的原理2紫外紫外-可見分光光度法的特點可見分光光度法的特點3紫外紫外-可見分光光度計的組織結(jié)構(gòu)可見分光光度計的組織結(jié)構(gòu)4影響檢測的因素及減小誤差的方法影響檢測的因素及減小誤差的方法5紫外紫外-可見分光光度計的日常保養(yǎng)可見分光光度計的日常保養(yǎng)A=abc A吸光度吸光度 a比例常數(shù)比例常數(shù) b液層厚度，光在溶液中的距離液層厚度，光在溶液中的距離 c濃度濃度紫外紫外-可見分光光度法

3、的原理可見分光光度法的原理 紫外紫外-可見分光光度計是通過測定樣品待測組分在吸收池中對特定波長光的選擇可見分光光度計是通過測定樣品待測組分在吸收池中對特定波長光的選擇性吸收的大小來確定樣品的含量的。待測組分的濃度與吸光度的關系服從性吸收的大小來確定樣品的含量的。待測組分的濃度與吸光度的關系服從郎伯郎伯比比耳定律耳定律。當當b、c均為均為1時，時，A=a稱為吸光系數(shù)稱為吸光系數(shù)若若c以以mol/L表示，表示，b以以cm表示，則此表示，則此常數(shù)稱為摩爾吸光系數(shù)用常數(shù)稱為摩爾吸光系數(shù)用表示表示 A=bc的大小，取決于物質(zhì)（溶質(zhì)、溶劑）的的大小，取決于物質(zhì)（溶質(zhì)、溶劑）的本性和光的波長本性和光的波長A

4、=abc 物質(zhì)不同物質(zhì)不同，其吸光系數(shù)不同，所以，其吸光系數(shù)不同，所以可作為物質(zhì)的特性常數(shù)；可作為物質(zhì)的特性常數(shù)；越大，靈敏度越高越大，靈敏度越高 溶劑不同溶劑不同，其吸光系數(shù)不同，其吸光系數(shù)不同 光的波長不同光的波長不同，其吸光系數(shù)不同，其吸光系數(shù)不同 不同的物質(zhì)有不同的吸收峰和不同的物質(zhì)有不同的吸收峰和max，這是物質(zhì)定性的依據(jù)之一，這是物質(zhì)定性的依據(jù)之一 物質(zhì)定量在物質(zhì)定量在max處測定其吸光度，靈敏度最高處測定其吸光度，靈敏度最高 郎伯郎伯比耳定律只有當入射光是單色光并且溶液為稀溶液時才適用比耳定律只有當入射光是單色光并且溶液為稀溶液時才適用紫外紫外-可見分光光度法的原理可見分光光度法

5、的原理u 靈敏度高靈敏度高 適用于微量組分的測定，一般可測定適用于微量組分的測定，一般可測定10-6g級的物質(zhì)級的物質(zhì)u 準確度較高準確度較高 相對誤差一般在相對誤差一般在15%之內(nèi)之內(nèi)u 方法簡便方法簡便 操作容易，儀器設備簡單，分析速度快操作容易，儀器設備簡單，分析速度快u 應用廣泛應用廣泛 主要應用于無機和有機化合物的定量分析及配合物的組成、穩(wěn)定常數(shù)的測定，也能應用主要應用于無機和有機化合物的定量分析及配合物的組成、穩(wěn)定常數(shù)的測定，也能應用于有機化合物的鑒定及結(jié)構(gòu)分析，還可對同分異構(gòu)體進行鑒別于有機化合物的鑒定及結(jié)構(gòu)分析，還可對同分異構(gòu)體進行鑒別紫外紫外-可見分光光度法的特點可見分光光度

6、法的特點光源提供入射光的裝置，要求能夠發(fā)射連續(xù)的具有足夠強度和穩(wěn)定的入射光，且輻射強度隨波長的變化盡可能小，使用壽命長單色器將光源輻射的復合光色散成單色光的光學裝置，一般由狹縫、色散元件及透鏡系統(tǒng)組成吸收池用于盛放試液的裝置，一般可見光區(qū)用玻璃吸收池，紫外光區(qū)用石英吸收池顯示器普通儀器一般集成在主機上，功能更加齊全、精密的儀器一般需要連接電腦檢測器將光信號轉(zhuǎn)變成電信號的裝置，要求靈敏度高、響應時間短、穩(wěn)定性好等紫外紫外-可見分光光度計的組織結(jié)構(gòu)可見分光光度計的組織結(jié)構(gòu)p 選擇合適的顯色劑，靈敏度高，選擇性好，產(chǎn)物穩(wěn)定選擇合適的顯色劑，靈敏度高，選擇性好，產(chǎn)物穩(wěn)定p 找出最佳的試劑加入量、酸度、

7、溫度和顯色時間，使樣品和標準在盡可能完全相同的條件找出最佳的試劑加入量、酸度、溫度和顯色時間，使樣品和標準在盡可能完全相同的條件下測定下測定 p 通過加掩蔽劑和控制通過加掩蔽劑和控制pH值，清除共存離子的干擾，值，清除共存離子的干擾，例如檢測氨氮時加入酒石酸鉀鈉，可掩例如檢測氨氮時加入酒石酸鉀鈉，可掩蔽水中常見的鈣、鎂、鐵等離子在測定過程中生成沉淀蔽水中常見的鈣、鎂、鐵等離子在測定過程中生成沉淀p 吸光度吸光度0.11.0，最好，最好0.10.7范圍內(nèi)測定范圍內(nèi)測定 對對A0.1的溶液，吸收池厚度大一些，或萃取濃縮來提高的溶液，吸收池厚度大一些，或萃取濃縮來提高A 對對A1.0的溶液，可稀釋或

8、用薄的吸收池來降低的溶液，可稀釋或用薄的吸收池來降低Ap 減小儀器誤差減小儀器誤差 穩(wěn)壓器穩(wěn)壓器入射光強度保持不變?nèi)肷涔鈴姸缺３植蛔?儀器的單色器分光性好儀器的單色器分光性好較純的單色光較純的單色光 吸收池厚度一致，套與套之間不搞錯吸收池厚度一致，套與套之間不搞錯 透光性能好（指紋、油膩、沉淀物、顏色滲透）透光性能好（指紋、油膩、沉淀物、顏色滲透）影響檢測的因素及減小誤差的方法影響檢測的因素及減小誤差的方法 盡量盡量減少開關次數(shù)減少開關次數(shù)，剛關閉的光源等不要立即重新開啟，剛關閉的光源等不要立即重新開啟 若光源燈亮度明顯減弱或不穩(wěn)定，應若光源燈亮度明顯減弱或不穩(wěn)定，應及時更換新燈及時更換新燈

9、經(jīng)常經(jīng)常更換單色器盒的干燥劑更換單色器盒的干燥劑，防止色散元件受潮生霉，防止色散元件受潮生霉 選擇波長應選擇波長應平穩(wěn)的轉(zhuǎn)動平穩(wěn)的轉(zhuǎn)動，不可用力過猛，不可用力過猛 比色皿的比色皿的光學面應保持清潔光學面應保持清潔，保證檢測數(shù)據(jù)的準確性，保證檢測數(shù)據(jù)的準確性 實驗室電壓波動較大時，需配備有過壓保護器的穩(wěn)壓器實驗室電壓波動較大時，需配備有過壓保護器的穩(wěn)壓器 停止工作時，必須切斷電源，蓋上防塵罩；儀器若長期不用，要定期通電停止工作時，必須切斷電源，蓋上防塵罩；儀器若長期不用，要定期通電2030 min 定期對分光光度計進行校驗（包括波長準確度、透射比正確度、穩(wěn)定度）定期對分光光度計進行校驗（包括波長

10、準確度、透射比正確度、穩(wěn)定度） 分光光度計的維護保養(yǎng)要堅持分光光度計的維護保養(yǎng)要堅持“三防四定三防四定”制度，做到制度，做到防塵、防防塵、防潮、防振潮、防振和和定人保管、定點存放、定期維護、定期檢修定人保管、定點存放、定期維護、定期檢修紫外紫外-可見分光光度計的日常保養(yǎng)可見分光光度計的日常保養(yǎng)2紫外紫外-可見分光光度計的應用可見分光光度計的應用通過詳細課題講解該儀器的具體應用及研究課題的思路通過詳細課題講解該儀器的具體應用及研究課題的思路 分光光度法檢測甲醛的方法研究分光光度法檢測甲醛的方法研究 通過查閱相關文獻，得出可采用通過查閱相關文獻，得出可采用分光光度法的檢測方法包括變色酸法、分光光度

11、法的檢測方法包括變色酸法、鹽酸苯肼法、乙酰丙酮法以及間苯三鹽酸苯肼法、乙酰丙酮法以及間苯三酚法等。此課題是對所有方法的反應酚法等。此課題是對所有方法的反應條件進行研究，進而得出更佳的反應條件進行研究，進而得出更佳的反應條件及各類方法的對比。在此，以其條件及各類方法的對比。在此，以其中變色酸法進行儀器應用的相關講解。中變色酸法進行儀器應用的相關講解。顯色劑的顯色劑的選擇選擇生成物最生成物最大吸收波大吸收波長的確定長的確定反應中單反應中單因素的條因素的條件選擇件選擇正交試驗正交試驗得出最佳得出最佳反應條件反應條件驗證結(jié)論驗證結(jié)論方法的回方法的回收率與精收率與精密度密度方法的研究思路方法的研究思路顯

12、色劑的選擇顯色劑的選擇 通過查閱相關文獻得知，甲醛與變色酸在濃硫酸介質(zhì)中反應生成紫色化合物，通過查閱相關文獻得知，甲醛與變色酸在濃硫酸介質(zhì)中反應生成紫色化合物，該化合物在可見光波段有吸收，且在一定時間內(nèi)，化合物相對較穩(wěn)定，可采用分光該化合物在可見光波段有吸收，且在一定時間內(nèi)，化合物相對較穩(wěn)定，可采用分光光度法進行檢測。光度法進行檢測。生成物最大吸收波長的確定生成物最大吸收波長的確定 在在10 mL比色管中比色管中,加入加入3.0 mL變色酸溶液變色酸溶液, 再緩緩加入濃硫酸再緩緩加入濃硫酸6.0 mL,冷卻后加冷卻后加入入2.0 mL甲醛標準使用液，甲醛標準使用液，95 水浴水浴30 min

13、,然后進行然后進行400800 nm全波段掃描全波段掃描，測其測其最大吸收波長最大吸收波長。結(jié)論結(jié)論 反應生成的紫色化合物在反應生成的紫色化合物在572 nm處處有最大吸收，因此本試驗采用的最大吸收有最大吸收，因此本試驗采用的最大吸收波長為波長為572 nm。反應中單因素的條件選擇反應中單因素的條件選擇 根據(jù)反應原理，本試驗共選取根據(jù)反應原理，本試驗共選取3個因素，變色酸和濃硫酸的體積比、水浴時間、個因素，變色酸和濃硫酸的體積比、水浴時間、水浴溫度，并分別進行水浴溫度，并分別進行單因素試驗單因素試驗（即固定其中兩個因素，只改變第三個因素的試即固定其中兩個因素，只改變第三個因素的試驗），各自選擇

14、吸光度較大的三個反應條件作為正交試驗的因素。驗），各自選擇吸光度較大的三個反應條件作為正交試驗的因素。結(jié)論結(jié)論 通過單因素試驗，選擇如下正交試驗因素通過單因素試驗，選擇如下正交試驗因素 變色酸和濃硫酸的體積比：變色酸和濃硫酸的體積比：2:6 3:5 4:4 水浴時間：水浴時間：6 min 8 min 10 min 水浴溫度：水浴溫度：75 85 95 正交試驗得出最佳反應條件正交試驗得出最佳反應條件 正交試驗是研究正交試驗是研究多因素多水平多因素多水平的一種設計方法，是根據(jù)正交性從全面試驗中挑的一種設計方法，是根據(jù)正交性從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，這些有代表性的點具備了選出部分

15、有代表性的點進行試驗，這些有代表性的點具備了“均勻分散，齊整可比均勻分散，齊整可比”的特點。例如，作一個三因素三水平的實驗，按全面實驗要求，須進行的特點。例如，作一個三因素三水平的實驗，按全面實驗要求，須進行3*3=27種組種組合的實驗，若合的實驗，若按正交表安排實驗按正交表安排實驗，只需作，只需作9次，顯然大大減少了工作量次，顯然大大減少了工作量，因而正交實因而正交實驗設計在很多領域的研究中已經(jīng)得到廣泛應用。驗設計在很多領域的研究中已經(jīng)得到廣泛應用。反應中單因素的條件選擇反應中單因素的條件選擇 比較本試驗比較本試驗A、B、C個因素個因素K值的大小，可以得出最優(yōu)值的大小，可以得出最優(yōu)條件是條件

16、是A2B1C3 ，即，即3.0 mL變色酸溶液、變色酸溶液、5.0 mL濃硫酸，濃硫酸，95 水浴水浴6 min。觀察表中中。觀察表中中A、B、C個因素中極差個因素中極差R的大小，的大小，RA遠遠大于遠遠大于RB和和RC，說明變色酸和濃硫酸的體積比是影響，說明變色酸和濃硫酸的體積比是影響該試驗的主要因素，其次是水浴溫度，最后是水浴時間。同該試驗的主要因素，其次是水浴溫度，最后是水浴時間。同時對比水浴時間和空白列的時對比水浴時間和空白列的R的大小，二者數(shù)值接近，這表明的大小，二者數(shù)值接近，這表明水浴時間在水浴時間在6 min10 min之內(nèi)的變化對試驗的結(jié)果影響非常之內(nèi)的變化對試驗的結(jié)果影響非常

17、小，可以忽略不計，這就大大降低了試驗中對水浴時間的操小，可以忽略不計，這就大大降低了試驗中對水浴時間的操作要求。在水浴時間方面，作要求。在水浴時間方面，6 min時不但其時不但其K值最大，而且由值最大，而且由于于6 min10 min內(nèi)對試驗結(jié)果影響很小，所以最終確定水浴內(nèi)對試驗結(jié)果影響很小，所以最終確定水浴時間為時間為6 min。序列V(變色酸mL):V(濃硫酸mL)A水浴時間（min）B水浴溫度（）C空白吸光值12：6（A1）6(B1)75(C1) 0.93822：6（A1）8(B2)85(C2) 1.07732：6（A1）10(B3)95(C3) 1.17543：5（A2）6(B1)85

18、(C2) 1.08253：5（A2）8(B2)95(C3) 1.15063：5（A2）10(B3)75(C1) 0.98674：4（A3）6(B1)95(C3) 0.62084：4（A3）8(B2)75(C1) 0.16894：4（A3）10(B3)85(C2) 0.455K11.0630.8800.6970.847 K21.0720.7980.8710.894 K30.4140.8720.9810.808 R0.6580.0820.2840.086驗證結(jié)論驗證結(jié)論 當由正交試驗分析得出的最佳反應條件并未出現(xiàn)在設置中，則需要進行驗證試當由正交試驗分析得出的最佳反應條件并未出現(xiàn)在設置中，則需要進

19、行驗證試驗驗。將最佳反應條件下的試驗結(jié)果與正交表中出現(xiàn)的組合條件的最大吸光值進行對。將最佳反應條件下的試驗結(jié)果與正交表中出現(xiàn)的組合條件的最大吸光值進行對比，若前者比后者的吸光值要大，則驗證成功，然后進行標準曲線的繪制。比，若前者比后者的吸光值要大，則驗證成功，然后進行標準曲線的繪制。TIP 繪制標準曲線時，通常至少需要繪制標準曲線時，通常至少需要5個點，亦可個點，亦可增加到增加到7個點。建議在配置標準溶液時，選擇個點。建議在配置標準溶液時，選擇10個個不同濃度的標準，在繪制曲線時，若相關系數(shù)較低，不同濃度的標準，在繪制曲線時，若相關系數(shù)較低，可剔除其中偏差較大的點，用以提高相關系數(shù)。可剔除其中

20、偏差較大的點，用以提高相關系數(shù)。方法的回收率與精密度方法的回收率與精密度 按照結(jié)論進行方法的回收率和精密度的測定，當樣品中甲醛的添加水平為按照結(jié)論進行方法的回收率和精密度的測定，當樣品中甲醛的添加水平為0.55 mg/Kg時，回收率為時，回收率為75.5 %102.0 %，相對標，相對標準偏差為準偏差為9.2 %11.3 %，添加水平為，添加水平為1.10 mg/Kg時，回收率為時，回收率為79.7 %108.6 %，相對標準偏差為，相對標準偏差為8.4 %9.1 %，添加水平為，添加水平為2.20 mg/Kg時，回收率為時，回收率為80.1 %106.8 %，相對標準偏差為，相對標準偏差為7.0 %8.7 %。在三個不同濃度的添加水平下，回收率為。在三個不同濃度的添加水平下，回收率為75.5 %108.6 %，相對標準偏差為相對標準偏差為7.0 %11.3 %，說明該方法的準確度和重現(xiàn)性均為良好。，說明該方法的準確度和重現(xiàn)性均為良好。 測量方法確認技術(shù)分正確度試驗（標準物質(zhì)分析試驗、測量方法確認技術(shù)分正確度試驗（標準物質(zhì)分析試驗、回收率回收率試驗、不同方法的比對試驗）、試驗、不同方法的比對試驗）、精密度精密度試驗（室內(nèi)重復試驗（室內(nèi)重復性、中間精密度、協(xié)同試驗、極差試驗）、性、中間精密度、協(xié)同試驗、極差試驗）、檢出限檢出限的確定、的確定、測量范圍測量范圍試驗、影響