第5章細(xì)胞融合

1、一一 細(xì)胞融合的定義細(xì)胞融合的定義 細(xì)胞融合是細(xì)胞融合是20世紀(jì)世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一項(xiàng)細(xì)年代發(fā)展起來的一項(xiàng)細(xì)胞工程技術(shù)。胞工程技術(shù)。細(xì)胞融合細(xì)胞融合(Cellfusion)又稱體細(xì)胞雜又稱體細(xì)胞雜交交(Somatic hybridization)，是指將不同來源的原是指將不同來源的原生質(zhì)體生質(zhì)體(除去細(xì)胞壁的細(xì)胞除去細(xì)胞壁的細(xì)胞)相融合并使之分化再相融合并使之分化再生、形成新物種或新品種的技術(shù)。生、形成新物種或新品種的技術(shù)。二二.細(xì)胞融合的意義細(xì)胞融合的意義1.通過原生質(zhì)體融合進(jìn)行體細(xì)胞雜交已成為細(xì)通過原生質(zhì)體融合進(jìn)行體細(xì)胞雜交已成為細(xì)胞工程研究的重要內(nèi)容之一?？砂堰@種技術(shù)胞工程研究的重要

2、內(nèi)容之一?？砂堰@種技術(shù)應(yīng)用于遺傳性狀改良、克服遠(yuǎn)緣雜交中的不應(yīng)用于遺傳性狀改良、克服遠(yuǎn)緣雜交中的不親和障礙、更加廣泛地組合起各種植物的優(yōu)親和障礙、更加廣泛地組合起各種植物的優(yōu)良遺傳性狀，從而培育出理想的新品種。良遺傳性狀，從而培育出理想的新品種。2.進(jìn)行體細(xì)胞融合可以避開生殖細(xì)胞的受精過進(jìn)行體細(xì)胞融合可以避開生殖細(xì)胞的受精過程，從而在親緣更遠(yuǎn)的物種間實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，程，從而在親緣更遠(yuǎn)的物種間實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，創(chuàng)造出自然界中所沒有的新物種。創(chuàng)造出自然界中所沒有的新物種。3.體細(xì)胞融合還有一個(gè)重要的價(jià)值，就是創(chuàng)造體細(xì)胞融合還有一個(gè)重要的價(jià)值，就是創(chuàng)造細(xì)胞質(zhì)雜種。在體細(xì)胞雜交中雙親的細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì)雜種。在體

3、細(xì)胞雜交中雙親的細(xì)胞質(zhì)都有一定的貢獻(xiàn)。據(jù)試驗(yàn)，融合后的雜種細(xì)都有一定的貢獻(xiàn)。據(jù)試驗(yàn)，融合后的雜種細(xì)胞質(zhì)最終會(huì)選擇某一親本的葉綠體，但線粒胞質(zhì)最終會(huì)選擇某一親本的葉綠體，但線粒體可以實(shí)現(xiàn)雙親重組。因此，有可能通過細(xì)體可以實(shí)現(xiàn)雙親重組。因此，有可能通過細(xì)胞融合獲得細(xì)胞核、葉綠體、線粒體基因組胞融合獲得細(xì)胞核、葉綠體、線粒體基因組的不同組合，這在育種上無疑有著重大價(jià)值。的不同組合，這在育種上無疑有著重大價(jià)值。4.體細(xì)胞雜交在作物育種和種質(zhì)創(chuàng)新上有其獨(dú)體細(xì)胞雜交在作物育種和種質(zhì)創(chuàng)新上有其獨(dú)到的意義和作用。隨著新的融合技術(shù)到的意義和作用。隨著新的融合技術(shù)(如電融如電融合技術(shù)合技術(shù))進(jìn)一步完善和發(fā)展，體細(xì)

4、胞雜交對(duì)作進(jìn)一步完善和發(fā)展，體細(xì)胞雜交對(duì)作物改良必將發(fā)揮出更大的作用。物改良必將發(fā)揮出更大的作用。三三 基本原理基本原理 對(duì)于植物細(xì)胞而言，對(duì)于植物細(xì)胞而言，1、一般先將兩種不同植物的體細(xì)胞、一般先將兩種不同植物的體細(xì)胞(來自其葉或來自其葉或根根)經(jīng)過纖維素酶、果膠酶消化，除去其細(xì)胞壁，經(jīng)過纖維素酶、果膠酶消化，除去其細(xì)胞壁，得到原生質(zhì)體；、得到原生質(zhì)體；、而后通過物理或化學(xué)方法誘導(dǎo)其細(xì)胞融合形成雜而后通過物理或化學(xué)方法誘導(dǎo)其細(xì)胞融合形成雜種細(xì)胞；、種細(xì)胞；、繼而再以適當(dāng)?shù)募夹g(shù)進(jìn)行雜種細(xì)胞的分檢和培養(yǎng)，繼而再以適當(dāng)?shù)募夹g(shù)進(jìn)行雜種細(xì)胞的分檢和培養(yǎng)，促使促使 雜種細(xì)胞分裂形成細(xì)胞團(tuán)、愈傷組織、直雜

5、種細(xì)胞分裂形成細(xì)胞團(tuán)、愈傷組織、直至形成雜種植株，從而實(shí)現(xiàn)基因在遠(yuǎn)緣物種間的至形成雜種植株，從而實(shí)現(xiàn)基因在遠(yuǎn)緣物種間的轉(zhuǎn)移。、由轉(zhuǎn)移。、由于這個(gè)新細(xì)胞得到了來自兩個(gè)細(xì)胞的染色體組和于這個(gè)新細(xì)胞得到了來自兩個(gè)細(xì)胞的染色體組和細(xì)胞質(zhì)，在適宜的條件下來培養(yǎng)，長(zhǎng)成的生物個(gè)細(xì)胞質(zhì)，在適宜的條件下來培養(yǎng)，長(zhǎng)成的生物個(gè)體就是一個(gè)新的物種或品系。體就是一個(gè)新的物種或品系。 下圖所示的是兩個(gè)不同的原生質(zhì)體或細(xì)胞融合成下圖所示的是兩個(gè)不同的原生質(zhì)體或細(xì)胞融合成一個(gè)新的融合細(xì)胞的原理示意圖：將不同來源的一個(gè)新的融合細(xì)胞的原理示意圖：將不同來源的兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞通過細(xì)胞融合，得到含有兩兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞通過細(xì)胞融合

6、，得到含有兩者遺傳信息的新的雜合細(xì)胞，然后通過培養(yǎng)基篩者遺傳信息的新的雜合細(xì)胞，然后通過培養(yǎng)基篩選出這種雜合細(xì)胞，就有可能得到一個(gè)新生物。選出這種雜合細(xì)胞，就有可能得到一個(gè)新生物。顯微鏡下的細(xì)胞融合過程見圖顯微鏡下的細(xì)胞融合過程見圖5-2 細(xì)胞融合主要經(jīng)過了兩原生質(zhì)體或細(xì)胞互細(xì)胞融合主要經(jīng)過了兩原生質(zhì)體或細(xì)胞互相靠近、細(xì)胞橋形成、胞質(zhì)滲透、細(xì)胞核融相靠近、細(xì)胞橋形成、胞質(zhì)滲透、細(xì)胞核融合幾個(gè)步驟。合幾個(gè)步驟。其中細(xì)胞橋的形成是細(xì)胞融合其中細(xì)胞橋的形成是細(xì)胞融合最關(guān)鍵的一步，融合過程中兩個(gè)細(xì)胞膜從彼最關(guān)鍵的一步，融合過程中兩個(gè)細(xì)胞膜從彼此接觸到破裂形成細(xì)胞橋的具體變化過程圖此接觸到破裂形成細(xì)胞橋

7、的具體變化過程圖解如圖解如圖5-3所示。所示。 細(xì)胞融合現(xiàn)象最初是在動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。細(xì)胞融合現(xiàn)象最初是在動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。 后來，細(xì)胞融合技術(shù)逐步擴(kuò)展到植物細(xì)胞后來，細(xì)胞融合技術(shù)逐步擴(kuò)展到植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞。和微生物細(xì)胞。四四 融合材料融合材料（一）植物或微生物原生質(zhì)體的制備（一）植物或微生物原生質(zhì)體的制備 植物和許多微生物細(xì)胞外有一層堅(jiān)韌的細(xì)胞植物和許多微生物細(xì)胞外有一層堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，如植物細(xì)胞質(zhì)膜外面包裹一層細(xì)胞壁，各壁，如植物細(xì)胞質(zhì)膜外面包裹一層細(xì)胞壁，各細(xì)胞壁間有果膠層將細(xì)胞聯(lián)結(jié)在一起。為了促細(xì)胞壁間有果膠層將細(xì)胞聯(lián)結(jié)在一起。為了促使這樣細(xì)胞的融合就必須先得到單個(gè)細(xì)胞，除使這樣細(xì)胞

8、的融合就必須先得到單個(gè)細(xì)胞，除去細(xì)胞壁，才能獲得植物原生質(zhì)體或微生物原去細(xì)胞壁，才能獲得植物原生質(zhì)體或微生物原生質(zhì)球。因此對(duì)于植物和微生物細(xì)胞的融合一生質(zhì)球。因此對(duì)于植物和微生物細(xì)胞的融合一般又可稱為原生質(zhì)體融合。般又可稱為原生質(zhì)體融合。（二）動(dòng)物單個(gè)細(xì)胞的獲得（二）動(dòng)物單個(gè)細(xì)胞的獲得 動(dòng)物細(xì)胞雖然沒有細(xì)胞壁，但細(xì)胞間的連接動(dòng)物細(xì)胞雖然沒有細(xì)胞壁，但細(xì)胞間的連接方式多樣而復(fù)雜，在進(jìn)行有效的細(xì)胞融合之前，方式多樣而復(fù)雜，在進(jìn)行有效的細(xì)胞融合之前，也必須獲得單個(gè)分散的細(xì)胞。主要步驟如下：也必須獲得單個(gè)分散的細(xì)胞。主要步驟如下：1. 組織的獲得組織的獲得 采用各種適宜的方法處死動(dòng)物，取出組織塊采用各

9、種適宜的方法處死動(dòng)物，取出組織塊放入小燒杯中，用剪刀將組織塊剪碎成放入小燒杯中，用剪刀將組織塊剪碎成lmm3大大小，用吸管吸取小，用吸管吸取Hanks溶液沖下剪刀上的碎塊，溶液沖下剪刀上的碎塊，補(bǔ)加補(bǔ)加3-5ml的的Hanks溶液，用吸管輕輕吹打，低溶液，用吸管輕輕吹打，低速離心，棄去上清液，留下組織塊。速離心，棄去上清液，留下組織塊。2.組織的消化組織的消化 通過生物化學(xué)的方法將剪碎的組織塊分散成通過生物化學(xué)的方法將剪碎的組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞?？筛鶕?jù)不同的組織對(duì)象采用不細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞?？筛鶕?jù)不同的組織對(duì)象采用不同的酶消化液，如最常用的有胰蛋白酶和膠原酶同的酶消化液，如最常用的有胰蛋白酶

10、和膠原酶等。其他的酶如鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、蝸牛酶等。其他的酶如鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、蝸牛酶等也可用于動(dòng)物組織的消化。等也可用于動(dòng)物組織的消化。EDTA最適合消化最適合消化傳代細(xì)胞，常與胰蛋白酶使用。傳代細(xì)胞，常與胰蛋白酶使用。 下面分別以胰蛋白酶和膠原酶為例介紹一下下面分別以胰蛋白酶和膠原酶為例介紹一下動(dòng)物組織的消化方法：動(dòng)物組織的消化方法： 胰蛋白酶：尤其適合于細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，胰蛋白酶：尤其適合于細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、羊膜、上皮、肝、腎以及傳代細(xì)胞等。如胚胎、羊膜、上皮、肝、腎以及傳代細(xì)胞等。用胰蛋白酶消化動(dòng)物細(xì)胞的基本步驟如下：用胰蛋白酶消化動(dòng)物細(xì)胞的基本步驟如下： (1)

11、向剪碎的組織塊中加入向剪碎的組織塊中加入30-50倍體積的倍體積的0.25濃度的胰蛋白酶。濃度的胰蛋白酶。 (2)在在37水浴內(nèi)消化水浴內(nèi)消化3060min，每每5-l0min搖動(dòng)搖動(dòng)一次，根據(jù)具體情況可以中間更換消化液。一次，根據(jù)具體情況可以中間更換消化液。 (3)Hanks液漂洗兩次，每次液漂洗兩次，每次23min 。 (4)800rmin離心離心5min，棄上清液，加入營(yíng)養(yǎng)液。棄上清液，加入營(yíng)養(yǎng)液。如果有大塊，可用紗網(wǎng)過濾。如果有大塊，可用紗網(wǎng)過濾。 膠原酶：是一種由細(xì)菌中提取的酶，對(duì)膠原和細(xì)胞間質(zhì)膠原酶：是一種由細(xì)菌中提取的酶，對(duì)膠原和細(xì)胞間質(zhì)有較強(qiáng)的消化作用，適用于消化纖維組織、上皮

12、組織、有較強(qiáng)的消化作用，適用于消化纖維組織、上皮組織、癌組織等。膠原酶不受癌組織等。膠原酶不受Ca 2+、Mg2+的螯合影響，可的螯合影響，可 用用BSS和含血清培養(yǎng)基配制成和含血清培養(yǎng)基配制成200Uml或或0.10.3mgml濃度，作用溫和，無需機(jī)械振蕩。具體消化方法如下：濃度，作用溫和，無需機(jī)械振蕩。具體消化方法如下： (1)向培養(yǎng)瓶中放入向培養(yǎng)瓶中放入15mm3大小的組織塊，加大小的組織塊，加5m12000Uml的膠原酶母液，最終濃度為的膠原酶母液，最終濃度為200Uml，pH=6.5 。 (2)36.5 水浴水浴448h，無需搖動(dòng)，中間可更換酶液一次。無需搖動(dòng)，中間可更換酶液一次。

13、(3)當(dāng)組織變軟，分散于瓶底時(shí)，輕輕振蕩即散成細(xì)胞當(dāng)組織變軟，分散于瓶底時(shí)，輕輕振蕩即散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，小心倒出培養(yǎng)液。團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，小心倒出培養(yǎng)液。 (4)800rmin離心離心5min，棄上清液，重新懸浮棄上清液，重新懸浮BSS溶液溶液 中，再離心一次。中，再離心一次。 (5)加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸浮液。加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸浮液。 五五 細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞融合技術(shù) 為了使制備好的原生質(zhì)體或細(xì)胞能融合在一為了使制備好的原生質(zhì)體或細(xì)胞能融合在一起，選擇適宜有效的誘導(dǎo)融合方法很重要。誘導(dǎo)起，選擇適宜有效的誘導(dǎo)融合方法很重要。誘導(dǎo)融合的方法可分為物理法、化學(xué)法及生物法。物融合的方法可分為物理法、化

14、學(xué)法及生物法。物理法主要包括顯微操作、電場(chǎng)刺激等；化學(xué)法主理法主要包括顯微操作、電場(chǎng)刺激等；化學(xué)法主要是用聚乙二醇要是用聚乙二醇PEG結(jié)合高結(jié)合高pH、高鈣離子法；高鈣離子法；生物法有仙臺(tái)病毒法等。具體應(yīng)用時(shí)要根據(jù)不同生物法有仙臺(tái)病毒法等。具體應(yīng)用時(shí)要根據(jù)不同對(duì)象選擇不同的細(xì)胞融合方法和條件。對(duì)象選擇不同的細(xì)胞融合方法和條件。誘導(dǎo)動(dòng)物誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合，仙臺(tái)病毒細(xì)胞融合，仙臺(tái)病毒HVJ誘導(dǎo)、誘導(dǎo)、PEG法、電融合法、電融合法都適用；植物細(xì)胞融合常用法都適用；植物細(xì)胞融合常用PEG法和電融合法；法和電融合法；微生物細(xì)胞融合只適用微生物細(xì)胞融合只適用PEG法。表法。表5-1顯示不同顯示不同細(xì)胞融合的

15、條件及其主要應(yīng)用。細(xì)胞融合的條件及其主要應(yīng)用。（一）生物法（一）生物法仙臺(tái)病毒法仙臺(tái)病毒法 我們知道很多病毒都具有凝集細(xì)胞的能力，它一邊黏我們知道很多病毒都具有凝集細(xì)胞的能力，它一邊黏接在一個(gè)細(xì)胞表面，另外一邊黏接在另一個(gè)細(xì)胞表面，接在一個(gè)細(xì)胞表面，另外一邊黏接在另一個(gè)細(xì)胞表面，從而使兩個(gè)細(xì)胞在病毒的作用下靠近發(fā)生凝結(jié)。從而使兩個(gè)細(xì)胞在病毒的作用下靠近發(fā)生凝結(jié)。 在動(dòng)物細(xì)胞融合中，仙臺(tái)病毒在動(dòng)物細(xì)胞融合中，仙臺(tái)病毒(HVJ)已成為產(chǎn)生細(xì)胞已成為產(chǎn)生細(xì)胞雜種的標(biāo)準(zhǔn)融合劑。雜種的標(biāo)準(zhǔn)融合劑。 病毒促使細(xì)胞融合的主要步驟如下：病毒促使細(xì)胞融合的主要步驟如下： (1)兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下

16、彼此靠近。兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近。 (2)通過病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜通過病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透。間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透。 (3)兩個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞核互相融合，融為一體。兩個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞核互相融合，融為一體。 (4)進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種子細(xì)胞。的雜種子細(xì)胞。 過程圖解如下圖所示。過程圖解如下圖所示。 （二）化學(xué)法（二）化學(xué)法PEG結(jié)合高結(jié)合高Ca2+、pH誘導(dǎo)法誘導(dǎo)法 細(xì)胞融合中的化學(xué)法誘導(dǎo)主要包括：細(xì)胞融合中的化學(xué)法誘導(dǎo)主要包括：NaNO

17、3誘導(dǎo)誘導(dǎo)(NaNO3可中和原生質(zhì)體表面負(fù)電荷，促進(jìn)可中和原生質(zhì)體表面負(fù)電荷，促進(jìn)原生質(zhì)體聚集，對(duì)原生質(zhì)體無損害，但融合效率原生質(zhì)體聚集，對(duì)原生質(zhì)體無損害，但融合效率低低)、高、高Ca2+和和pH誘導(dǎo)法、誘導(dǎo)法、PEG誘導(dǎo)、高誘導(dǎo)、高Ca2+和和pH誘導(dǎo)誘導(dǎo)PEG結(jié)合誘導(dǎo)等。上面幾種方法中以后結(jié)合誘導(dǎo)等。上面幾種方法中以后者最為常用，下面做一重點(diǎn)介紹：者最為常用，下面做一重點(diǎn)介紹：1 .基本原理基本原理 聚乙二醇聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是一是一種多聚化合物，分子式為種多聚化合物，分子式為H(OHCH2CH2)nOH，商品名卡波蠟商品名卡波蠟(Carbowax)

18、。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室用的室用的PEG平均相對(duì)分子質(zhì)量在平均相對(duì)分子質(zhì)量在200- 20000之之間，一般間，一般1000以下者為液體，以下者為液體，1 000以上者為以上者為固體。固體。1974年人們用它誘導(dǎo)大麥、大豆等植年人們用它誘導(dǎo)大麥、大豆等植物原生質(zhì)體融合，以后又用物原生質(zhì)體融合，以后又用PEG誘導(dǎo)與用高誘導(dǎo)與用高Ca2+和和pH誘導(dǎo)相結(jié)合，極大地提高了融合效誘導(dǎo)相結(jié)合，極大地提高了融合效率。率。2. 基本過程基本過程 以植物原生質(zhì)體為例，以植物原生質(zhì)體為例，PEG法誘導(dǎo)原生質(zhì)法誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的過程見圖體融合的過程見圖5-4所示。所示。 融合中應(yīng)注意：融合中應(yīng)注意： (1)事先要做好兩種原生

19、質(zhì)體的識(shí)別標(biāo)記，如事先要做好兩種原生質(zhì)體的識(shí)別標(biāo)記，如色素、缺陷型、抗性標(biāo)記等。色素、缺陷型、抗性標(biāo)記等。 (2)原生質(zhì)體的密度應(yīng)在原生質(zhì)體的密度應(yīng)在105個(gè)個(gè)ml左右，兩種左右，兩種原生質(zhì)體按原生質(zhì)體按1:1等量混合。等量混合。 (3)常用常用PEG的分子量通常為的分子量通常為40006000，加熱熔，加熱熔化與化與Eagle溶液配成溶液配成50(WV)濃度濃度(小分子質(zhì)小分子質(zhì)量的量的PEG配成配成55濃度濃度)。加入。加入PEG后，后，24 培育培育10-20min(注意時(shí)間宜短不宜長(zhǎng)，過長(zhǎng)，使注意時(shí)間宜短不宜長(zhǎng)，過長(zhǎng)，使原生質(zhì)體周圍包裹一層膜形成凝集體，會(huì)降低原生質(zhì)體周圍包裹一層膜形成

20、凝集體，會(huì)降低融合率融合率)，緩緩加入高，緩緩加入高pH、高鈣離子溶液，高鈣離子溶液，15min后用沖洗液清洗，離心收集原生質(zhì)體。后用沖洗液清洗，離心收集原生質(zhì)體。(4)計(jì)算：融合率計(jì)算：融合率=(融合細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù)視野融合細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù)視野內(nèi)全部細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù)內(nèi)全部細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù))100(三三)物理法物理法電融合誘導(dǎo)法電融合誘導(dǎo)法1 基本原理基本原理 電融合法是電融合法是20世紀(jì)世紀(jì)80年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技術(shù)。在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，原生質(zhì)體質(zhì)膜表面術(shù)。在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種原生質(zhì)的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異

21、種原生質(zhì)體黏合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開始連接，體黏合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。與直到閉和成完整的膜形成融合體。與PEG法比較，法比較，電融合法優(yōu)點(diǎn)較多，如融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)電融合法優(yōu)點(diǎn)較多，如融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)原生質(zhì)體傷害小；裝置精巧、方便簡(jiǎn)單、可在顯原生質(zhì)體傷害小；裝置精巧、方便簡(jiǎn)單、可在顯微鏡下觀察或錄像融合過程；免去微鏡下觀察或錄像融合過程；免去PEG誘導(dǎo)后的誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控制性強(qiáng)等等。電融合設(shè)洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控制性強(qiáng)等等。電融合設(shè)備及原理如圖備及原理如圖5-5：2 基本過程基本過程 電融合裝置的電極有兩種：微電極

22、型電融合裝置的電極有兩種：微電極型(圖圖55中中B)和平行多電極型和平行多電極型(圖圖5-5中中A)，它們的特點(diǎn)與它們的特點(diǎn)與操作如下：操作如下： (1)將制備好的親本原生質(zhì)體均勻混合放入融合將制備好的親本原生質(zhì)體均勻混合放入融合小室中，微電極型只有一個(gè)小室小室中，微電極型只有一個(gè)小室(圖圖5-5中中B)，平平行電極型有行電極型有4個(gè)小室個(gè)小室(圖圖5-5中中A)，兩電極間隔兩電極間隔3mm，整個(gè)裝置放在一個(gè)培養(yǎng)皿中。整個(gè)裝置放在一個(gè)培養(yǎng)皿中。 (2)微電極型的兩個(gè)電極的端部同時(shí)與兩個(gè)靠近微電極型的兩個(gè)電極的端部同時(shí)與兩個(gè)靠近的原生質(zhì)體膜表面接觸，微電極所產(chǎn)生的的原生質(zhì)體膜表面接觸，微電極所產(chǎn)

23、生的512mA的脈沖電流間斷刺激的脈沖電流間斷刺激15ms，原生質(zhì)體原生質(zhì)體在累計(jì)幾秒到幾十秒鐘的時(shí)間內(nèi)會(huì)發(fā)生暫時(shí)性的在累計(jì)幾秒到幾十秒鐘的時(shí)間內(nèi)會(huì)發(fā)生暫時(shí)性的收縮，兩層膜之間形成小孔，連接成橋，形成一收縮，兩層膜之間形成小孔，連接成橋，形成一個(gè)個(gè)泡囊，經(jīng)點(diǎn)連接到面連接，最后形成融合體，個(gè)個(gè)泡囊，經(jīng)點(diǎn)連接到面連接，最后形成融合體，整個(gè)過程大約整個(gè)過程大約1030min。 (3)平行多電極通過平行多電極通過1兆赫兆赫(MHz)交流電場(chǎng)發(fā)生雙交流電場(chǎng)發(fā)生雙向電脈沖，原生質(zhì)體在電場(chǎng)力的作用下，極化產(chǎn)向電脈沖，原生質(zhì)體在電場(chǎng)力的作用下，極化產(chǎn)生偶極子，原生質(zhì)體緊密排開成串珠狀生偶極子，原生質(zhì)體緊密排開

24、成串珠狀(圖圖5-5中中C)。在適當(dāng)時(shí)間和強(qiáng)度在適當(dāng)時(shí)間和強(qiáng)度(如如50mA l.22kVcm)的的直流電脈沖作用下，質(zhì)膜被擊穿，進(jìn)一步形成融直流電脈沖作用下，質(zhì)膜被擊穿，進(jìn)一步形成融合體。應(yīng)用如下圖所示。合體。應(yīng)用如下圖所示。 (四四) 細(xì)胞融合的影響因素細(xì)胞融合的影響因素1. 植物細(xì)胞融合植物細(xì)胞融合 植物原生質(zhì)體融合無種屬特異性，故其融合效率僅植物原生質(zhì)體融合無種屬特異性，故其融合效率僅與外界條件有關(guān)，而與其自身種屬無關(guān)。如何確定不同與外界條件有關(guān)，而與其自身種屬無關(guān)。如何確定不同材料的融合條件，需經(jīng)過具體實(shí)驗(yàn)制定出最佳融合方案。材料的融合條件，需經(jīng)過具體實(shí)驗(yàn)制定出最佳融合方案。 植物細(xì)

25、胞融合的影響因素如下：植物細(xì)胞融合的影響因素如下： (1)PEG誘導(dǎo)融合的關(guān)鍵是作用時(shí)間，尤其是高誘導(dǎo)融合的關(guān)鍵是作用時(shí)間，尤其是高Ca 2+和和pH溶液處理時(shí)間長(zhǎng)短非常重要。時(shí)間過長(zhǎng)原生質(zhì)體損溶液處理時(shí)間長(zhǎng)短非常重要。時(shí)間過長(zhǎng)原生質(zhì)體損傷嚴(yán)重，融合效率降低；過短則不融合。傷嚴(yán)重，融合效率降低；過短則不融合。 (2)PEG規(guī)格和純度與融合效率亦有關(guān)系。以往認(rèn)為規(guī)格和純度與融合效率亦有關(guān)系。以往認(rèn)為PEG 分子質(zhì)量越大，對(duì)細(xì)胞毒性越大，因此選用分子質(zhì)量小分子質(zhì)量越大，對(duì)細(xì)胞毒性越大，因此選用分子質(zhì)量小的的PEG。但是目前發(fā)現(xiàn)但是目前發(fā)現(xiàn)PEG毒性是其中雜質(zhì)所致，經(jīng)純毒性是其中雜質(zhì)所致，經(jīng)純化后即

26、無毒性。故目前應(yīng)用分子質(zhì)量較大者化后即無毒性。故目前應(yīng)用分子質(zhì)量較大者(40006000)居多。因此操作時(shí)應(yīng)注意居多。因此操作時(shí)應(yīng)注意PEG純度。純度。 (3)在電場(chǎng)誘導(dǎo)融合時(shí)，融合率與原生質(zhì)體密度在電場(chǎng)誘導(dǎo)融合時(shí)，融合率與原生質(zhì)體密度有關(guān)；密度小于有關(guān)；密度小于104個(gè)個(gè)ml融合效率低；大于融合效率低；大于105個(gè)個(gè) ml會(huì)融合成團(tuán)，難以達(dá)到預(yù)期效果。最適會(huì)融合成團(tuán)，難以達(dá)到預(yù)期效果。最適宜的密度一般為宜的密度一般為21048 104個(gè)個(gè) ml 。 (4)在融合液中加入少量在融合液中加入少量CaCl2，既可維持一定電既可維持一定電導(dǎo)率，對(duì)細(xì)胞也有保護(hù)作用；其次交變電流強(qiáng)弱、導(dǎo)率，對(duì)細(xì)胞也有保

27、護(hù)作用；其次交變電流強(qiáng)弱、處理時(shí)間長(zhǎng)短及電脈沖大小均會(huì)影響融合率。處理時(shí)間長(zhǎng)短及電脈沖大小均會(huì)影響融合率。 (5)此外，用混合鹽溶液對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行融合前此外，用混合鹽溶液對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行融合前預(yù)處理，以及在促融劑中添加伴刀豆球蛋白、二預(yù)處理，以及在促融劑中添加伴刀豆球蛋白、二甲基亞砜、胰蛋白酶、精胺或亞精胺等亦可提高甲基亞砜、胰蛋白酶、精胺或亞精胺等亦可提高融合效率。融合效率。 2.動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞融合 在動(dòng)物細(xì)胞融合過程中，除促融劑外，其他如細(xì)胞在動(dòng)物細(xì)胞融合過程中，除促融劑外，其他如細(xì)胞性質(zhì)、溫度、性質(zhì)、溫度、pH、離子強(qiáng)度及離子種類等均會(huì)影響細(xì)離子強(qiáng)度及離子種類等均會(huì)影響細(xì)胞融合效率。

28、胞融合效率。 (1)首先，親本細(xì)胞表面性質(zhì)影響較大，表面覆蓋絨毛首先，親本細(xì)胞表面性質(zhì)影響較大，表面覆蓋絨毛而不規(guī)則者較易融合，而表面光滑者較難融合。而不規(guī)則者較易融合，而表面光滑者較難融合。 (2)細(xì)胞種類不同，融合效果也不同，如腹水癌及株化細(xì)胞種類不同，融合效果也不同，如腹水癌及株化細(xì)胞較易融合，而淋巴細(xì)胞或血球細(xì)胞幾乎不融合。細(xì)胞較易融合，而淋巴細(xì)胞或血球細(xì)胞幾乎不融合。 (3)細(xì)胞融合時(shí)需要適宜溫度和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。如仙臺(tái)病毒細(xì)胞融合時(shí)需要適宜溫度和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。如仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)歐利希氏腹水癌細(xì)胞融合時(shí)，于誘導(dǎo)歐利希氏腹水癌細(xì)胞融合時(shí)，于37 振搖時(shí)易于振搖時(shí)易于融合，且融合效率與病毒量呈正比。但

29、在融合，且融合效率與病毒量呈正比。但在34 振搖則振搖則融合率下降。在融合率下降。在37時(shí)不振搖則幾乎不融合。時(shí)不振搖則幾乎不融合。 (4)細(xì)胞融合過程中，通常耗氧量較大，缺氧時(shí)經(jīng)細(xì)胞融合過程中，通常耗氧量較大，缺氧時(shí)經(jīng)常不融合?？諝庵泻趿看笥诔２蝗诤稀？諝庵泻趿看笥?0時(shí)有一定融合時(shí)有一定融合率，但有些細(xì)胞在無氧條件下也可融合。率，但有些細(xì)胞在無氧條件下也可融合。 (5)有些細(xì)胞融合時(shí)需要有些細(xì)胞融合時(shí)需要Ca2+ ，否則不融合，細(xì)否則不融合，細(xì)胞蛋白質(zhì)亦發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)表明胞蛋白質(zhì)亦發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)表明Sr2+、Ba2+ 、Mg2+ 、Mn2+ 等離子可代替等離子可代替Ca2+，但有效濃度

30、較但有效濃度較Ca2+大的多。融合時(shí)最適合的離子強(qiáng)度一般為大的多。融合時(shí)最適合的離子強(qiáng)度一般為0.1molL。 (6)最適合的最適合的pH為為7.47.8之間，在此范圍之外，之間，在此范圍之外，融合率均較低。融合率均較低。六六. 融合細(xì)胞的選擇融合細(xì)胞的選擇 通過各種技術(shù)手段可以獲得各種類型的融通過各種技術(shù)手段可以獲得各種類型的融合體。細(xì)胞發(fā)生融合后，根據(jù)融合細(xì)胞中所含合體。細(xì)胞發(fā)生融合后，根據(jù)融合細(xì)胞中所含的類型，可將其分為以下幾種類型：的類型，可將其分為以下幾種類型： (1)同核體同核體同源原生質(zhì)體的融合體。由于是同源原生質(zhì)體的融合體。由于是同源細(xì)胞，它們的基因型及表現(xiàn)型完全一樣。同源細(xì)胞

31、，它們的基因型及表現(xiàn)型完全一樣。 (2)異核體異核體非同源原生質(zhì)體的融合體。一非同源原生質(zhì)體的融合體。一般是親源關(guān)系較近的細(xì)胞，這種親核雜種細(xì)般是親源關(guān)系較近的細(xì)胞，這種親核雜種細(xì)胞含有雙親全部細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)，其發(fā)胞含有雙親全部細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)，其發(fā)育的個(gè)體也有可育的，如煙草種間的細(xì)胞雜育的個(gè)體也有可育的，如煙草種間的細(xì)胞雜種。種。 (3)多核體多核體含有雙親不同比例核物質(zhì)的融含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。親源關(guān)系較遠(yuǎn)的細(xì)胞間融合，融合體合體。親源關(guān)系較遠(yuǎn)的細(xì)胞間融合，融合體以一個(gè)細(xì)胞的核物質(zhì)為主，只加入另外一個(gè)以一個(gè)細(xì)胞的核物質(zhì)為主，只加入另外一個(gè)細(xì)胞少量的遺傳物質(zhì)，如胡蘿卜與羊角芹

32、形細(xì)胞少量的遺傳物質(zhì)，如胡蘿卜與羊角芹形成部分親核的雜種細(xì)胞。成部分親核的雜種細(xì)胞。 植物原生質(zhì)體融合后，融合物在培養(yǎng)基中再生植物原生質(zhì)體融合后，融合物在培養(yǎng)基中再生細(xì)胞壁，通過有絲分裂，產(chǎn)生由親本細(xì)胞、同源細(xì)胞壁，通過有絲分裂，產(chǎn)生由親本細(xì)胞、同源細(xì)胞及雜種細(xì)胞組成的混合群體。細(xì)胞及雜種細(xì)胞組成的混合群體。 不同的融合產(chǎn)物在培養(yǎng)條件下有著不同的命運(yùn)。不同的融合產(chǎn)物在培養(yǎng)條件下有著不同的命運(yùn)。未融合的原生質(zhì)體和同源融合的原生質(zhì)體能較快未融合的原生質(zhì)體和同源融合的原生質(zhì)體能較快地適應(yīng)培養(yǎng)條件而生長(zhǎng)發(fā)育。而異源融合體往往地適應(yīng)培養(yǎng)條件而生長(zhǎng)發(fā)育。而異源融合體往往因它們發(fā)育緩慢而受到優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的親本原

33、生質(zhì)體因它們發(fā)育緩慢而受到優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的親本原生質(zhì)體融合細(xì)胞的抑制，不易發(fā)育成雜種。因此需要通融合細(xì)胞的抑制，不易發(fā)育成雜種。因此需要通過培養(yǎng)和篩選，除去不需要的細(xì)胞，分離出需要過培養(yǎng)和篩選，除去不需要的細(xì)胞，分離出需要的雜種細(xì)胞，從而解決融合細(xì)胞的選擇問題。的雜種細(xì)胞，從而解決融合細(xì)胞的選擇問題。 最簡(jiǎn)單的選擇方法是利用雙親細(xì)胞形態(tài)和色澤上的差最簡(jiǎn)單的選擇方法是利用雙親細(xì)胞形態(tài)和色澤上的差異識(shí)別雜種細(xì)胞，但多數(shù)是根據(jù)細(xì)胞生理遺傳上的特性異識(shí)別雜種細(xì)胞，但多數(shù)是根據(jù)細(xì)胞生理遺傳上的特性來選擇。比較常用的雜種細(xì)胞篩選方法包括：來選擇。比較常用的雜種細(xì)胞篩選方法包括： (1)遺傳互補(bǔ)篩選法：利用每一親

34、本貢獻(xiàn)一個(gè)功能正常等遺傳互補(bǔ)篩選法：利用每一親本貢獻(xiàn)一個(gè)功能正常等位基因，糾正另外一親本的缺陷，從而令雜種細(xì)胞表現(xiàn)位基因，糾正另外一親本的缺陷，從而令雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常功能的原理選擇雜種細(xì)胞。正常功能的原理選擇雜種細(xì)胞。 (2)抗性互補(bǔ)篩選法：利用親本原生質(zhì)體對(duì)抗生素、除草抗性互補(bǔ)篩選法：利用親本原生質(zhì)體對(duì)抗生素、除草劑及其他毒性物質(zhì)抗性差異來選擇雜種細(xì)胞。對(duì)抗性突劑及其他毒性物質(zhì)抗性差異來選擇雜種細(xì)胞。對(duì)抗性突變體或抗藥性有差異的可采用這種方法。變體或抗藥性有差異的可采用這種方法。 (3)生長(zhǎng)特性篩選法：利用原生質(zhì)體對(duì)培養(yǎng)基成分要求與生長(zhǎng)特性篩選法：利用原生質(zhì)體對(duì)培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇

35、雜種細(xì)胞。例如：親本原生質(zhì)體生長(zhǎng)要反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞。例如：親本原生質(zhì)體生長(zhǎng)要求外源激素，而有的雜種細(xì)胞由于雙親互補(bǔ)作用會(huì)產(chǎn)生求外源激素，而有的雜種細(xì)胞由于雙親互補(bǔ)作用會(huì)產(chǎn)生內(nèi)激素，從而使雜種細(xì)胞能在無激素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。內(nèi)激素，從而使雜種細(xì)胞能在無激素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。 (4)物理特性篩選法：利用親本原生質(zhì)體大小、物理特性篩選法：利用親本原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度等差異選擇雜種細(xì)胞。如用離心顏色、漂浮密度等差異選擇雜種細(xì)胞。如用離心方法可以把異核體與親本原生質(zhì)體分開，從而獲方法可以把異核體與親本原生質(zhì)體分開，從而獲得融合體。得融合體。 (5)其他方法：采用顯微操作技術(shù)也能把單個(gè)異其他方法

36、：采用顯微操作技術(shù)也能把單個(gè)異核體分離出來進(jìn)行培養(yǎng)。因?yàn)槿绻侨诤霞?xì)胞，核體分離出來進(jìn)行培養(yǎng)。因?yàn)槿绻侨诤霞?xì)胞，就必定具有與雙親本不同的熒光標(biāo)記，所以科學(xué)就必定具有與雙親本不同的熒光標(biāo)記，所以科學(xué)家發(fā)明了一種普遍適用的方法，即采用無毒的熒家發(fā)明了一種普遍適用的方法，即采用無毒的熒光素標(biāo)記雙親原生質(zhì)體。融合后利用一種電子光素標(biāo)記雙親原生質(zhì)體。融合后利用一種電子 熒光激活選擇器自動(dòng)分類和選擇融合細(xì)胞。熒光激活選擇器自動(dòng)分類和選擇融合細(xì)胞。 以上方法中利用選擇性培養(yǎng)基是一個(gè)很常用以上方法中利用選擇性培養(yǎng)基是一個(gè)很常用的雜種細(xì)胞選擇方法。的雜種細(xì)胞選擇方法。 七七. 細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用舉例細(xì)胞融合技

37、術(shù)的應(yīng)用舉例 1970年以來，通過原生質(zhì)體融合已獲得了年以來，通過原生質(zhì)體融合已獲得了很多體細(xì)胞雜種，表很多體細(xì)胞雜種，表5-2是其中的一些實(shí)例。是其中的一些實(shí)例。下面重點(diǎn)對(duì)一些已獲成功的應(yīng)用如單克隆抗下面重點(diǎn)對(duì)一些已獲成功的應(yīng)用如單克隆抗體大量生產(chǎn)、微生物新菌株的構(gòu)建、以及通體大量生產(chǎn)、微生物新菌株的構(gòu)建、以及通過原生質(zhì)體融合再生植株作一介紹。應(yīng)用如過原生質(zhì)體融合再生植株作一介紹。應(yīng)用如下圖所示。下圖所示。 (一一)動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞融合單克隆抗體生產(chǎn)單克隆抗體生產(chǎn) 高等動(dòng)物的免疫主要是機(jī)體能識(shí)別外源異物高等動(dòng)物的免疫主要是機(jī)體能識(shí)別外源異物與自身的物質(zhì)。例如種牛痘預(yù)防天花及接種麻疹疫與自

38、身的物質(zhì)。例如種牛痘預(yù)防天花及接種麻疹疫苗預(yù)防麻疹已得到廣泛應(yīng)用。高等動(dòng)物與外界相通苗預(yù)防麻疹已得到廣泛應(yīng)用。高等動(dòng)物與外界相通的呼吸道及生殖泌尿系統(tǒng)等被稱為外分泌的淋巴系的呼吸道及生殖泌尿系統(tǒng)等被稱為外分泌的淋巴系統(tǒng)；不與外界接觸的胸腺、骨髓、脾臟、扁桃腺及統(tǒng)；不與外界接觸的胸腺、骨髓、脾臟、扁桃腺及淋巴結(jié)等稱免疫內(nèi)分泌淋巴系統(tǒng)。胸腺位于胸骨后，淋巴結(jié)等稱免疫內(nèi)分泌淋巴系統(tǒng)。胸腺位于胸骨后，由兩葉構(gòu)成，能生產(chǎn)淋巴細(xì)胞，這類依賴胸腺的淋由兩葉構(gòu)成，能生產(chǎn)淋巴細(xì)胞，這類依賴胸腺的淋巴細(xì)胞叫巴細(xì)胞叫T細(xì)胞。它們能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，調(diào)動(dòng)吞噬細(xì)胞。它們能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，調(diào)動(dòng)吞噬細(xì)胞等包圍及吞噬并將病原菌消滅

39、；脾臟在人體左細(xì)胞等包圍及吞噬并將病原菌消滅；脾臟在人體左腹，是最大的淋巴器官，能產(chǎn)生多種淋巴細(xì)胞。其腹，是最大的淋巴器官，能產(chǎn)生多種淋巴細(xì)胞。其中中B淋巴細(xì)胞是能形成抗體的細(xì)胞；骨髓是產(chǎn)生干淋巴細(xì)胞是能形成抗體的細(xì)胞；骨髓是產(chǎn)生干細(xì)胞的器官，因此骨髓是免疫功能的發(fā)源地。細(xì)胞的器官，因此骨髓是免疫功能的發(fā)源地。 用常規(guī)免疫方法制備的免疫血清抗體只能是數(shù)目眾多用常規(guī)免疫方法制備的免疫血清抗體只能是數(shù)目眾多的單克隆抗體的混合物，一般稱其為多克隆抗體的單克隆抗體的混合物，一般稱其為多克隆抗體(PcAb)。這種多克隆抗體存在特異性差、效價(jià)低、數(shù)量有限、動(dòng)這種多克隆抗體存在特異性差、效價(jià)低、數(shù)量有限、動(dòng)

40、物間個(gè)體差異大，難以重復(fù)制備等固有缺陷。物間個(gè)體差異大，難以重復(fù)制備等固有缺陷。 1975年，英國(guó)劍橋大學(xué)分子生物學(xué)研究室的科萊爾年，英國(guó)劍橋大學(xué)分子生物學(xué)研究室的科萊爾(Kohler)和米爾斯坦和米爾斯坦(Milstein)合作將已適應(yīng)于體外培合作將已適應(yīng)于體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與綿羊紅細(xì)胞免疫小鼠脾細(xì)胞養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與綿羊紅細(xì)胞免疫小鼠脾細(xì)胞(B淋淋巴細(xì)胞巴細(xì)胞)進(jìn)行融合，發(fā)現(xiàn)融合形成的雜交瘤細(xì)胞具有雙進(jìn)行融合，發(fā)現(xiàn)融合形成的雜交瘤細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的特征：即像骨髓瘤細(xì)胞一樣在體外培養(yǎng)時(shí)能夠親細(xì)胞的特征：即像骨髓瘤細(xì)胞一樣在體外培養(yǎng)時(shí)能夠無限地快速增殖，又能持續(xù)地分泌特異性抗體，通過克

41、無限地快速增殖，又能持續(xù)地分泌特異性抗體，通過克隆化可使雜交細(xì)胞成為單純的細(xì)胞系，由此單克隆系就隆化可使雜交細(xì)胞成為單純的細(xì)胞系，由此單克隆系就可以獲得結(jié)構(gòu)與各種特性完全相同的高純度抗體，即單可以獲得結(jié)構(gòu)與各種特性完全相同的高純度抗體，即單克隆抗體克隆抗體(McAb)。上述方法創(chuàng)立了一項(xiàng)具有劃時(shí)代意。上述方法創(chuàng)立了一項(xiàng)具有劃時(shí)代意義的新技術(shù)義的新技術(shù)利用細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體。利用細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體。 制備單克隆抗體包括動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、選制備單克隆抗體包括動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、選擇雜交瘤、檢測(cè)抗體、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍擇雜交瘤、檢測(cè)抗體、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量

42、生產(chǎn)，要經(jīng)過幾個(gè)月的存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)，要經(jīng)過幾個(gè)月的一系列實(shí)驗(yàn)步驟一系列實(shí)驗(yàn)步驟(見圖見圖5-6)。單克隆抗體的制備大。單克隆抗體的制備大致是按以下步驟進(jìn)行：首先取得抗原致是按以下步驟進(jìn)行：首先取得抗原(包括細(xì)菌、包括細(xì)菌、病毒或某種純的蛋白病毒或某種純的蛋白)注射到小鼠體內(nèi)，大約注注射到小鼠體內(nèi)，大約注射射4次，使小鼠免疫并產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。取小鼠次，使小鼠免疫并產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。取小鼠的血清與抗原作用，確認(rèn)產(chǎn)生抗原的血清與抗原作用，確認(rèn)產(chǎn)生抗原抗體凝集反抗體凝集反應(yīng)。取出免疫鼠的脾臟制成脾細(xì)胞懸浮液，與鼠應(yīng)。取出免疫鼠的脾臟制成脾細(xì)胞懸浮液，與鼠骨髓瘤細(xì)胞混合，加入聚乙二醇骨髓瘤細(xì)胞

43、混合，加入聚乙二醇(PEC 4000)形成形成融合細(xì)胞，又叫雜交瘤。它具有分泌抗體又能迅融合細(xì)胞，又叫雜交瘤。它具有分泌抗體又能迅速生長(zhǎng)的特性，叫單克隆抗體雜交株。利用單克速生長(zhǎng)的特性，叫單克隆抗體雜交株。利用單克隆抗體的診斷方法很多，如酶聯(lián)吸附法隆抗體的診斷方法很多，如酶聯(lián)吸附法(ELISA)、熒光抗體法、膠體金銀染色法等已在臨床診斷上熒光抗體法、膠體金銀染色法等已在臨床診斷上應(yīng)用。應(yīng)用。單克隆抗體的大量制備過程如下：?jiǎn)慰寺】贵w的大量制備過程如下：1. 細(xì)胞融合前準(zhǔn)備細(xì)胞融合前準(zhǔn)備(1)動(dòng)物免疫與免疫脾細(xì)胞懸液的制備動(dòng)物免疫與免疫脾細(xì)胞懸液的制備 一般要經(jīng)過初次免疫、第二次免疫一般要經(jīng)過初次

44、免疫、第二次免疫(向動(dòng)物腹腔內(nèi)向動(dòng)物腹腔內(nèi)注射抗體注射抗體)、加強(qiáng)免疫、加強(qiáng)免疫(向動(dòng)物靜脈內(nèi)注射抗體向動(dòng)物靜脈內(nèi)注射抗體)三個(gè)過程。三個(gè)過程。如果需要免疫脾細(xì)胞，一般取最后一次加強(qiáng)免疫如果需要免疫脾細(xì)胞，一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天以天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液。后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液。(2)骨髓瘤細(xì)胞的獲得與培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞的獲得與培養(yǎng) 骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可利用一般的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液。骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可利用一般的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液。小牛血清的濃度一般在小牛血清的濃度一般在1020，細(xì)胞的最大密度不，細(xì)胞的最大密度不得超得超106個(gè)個(gè)ml，一般擴(kuò)大培養(yǎng)以一般擴(kuò)大培養(yǎng)以1:10稀釋傳代，每稀釋傳代，每3

45、5天傳代一次。細(xì)胞的倍增時(shí)間為天傳代一次。細(xì)胞的倍增時(shí)間為1620h。 一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞。保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和良好的形態(tài)，活胞。保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和良好的形態(tài)，活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95也是決定細(xì)胞融合的關(guān)鍵。也是決定細(xì)胞融合的關(guān)鍵。2 細(xì)胞融合與雜交瘤選擇細(xì)胞融合與雜交瘤選擇(1)細(xì)胞融合流程細(xì)胞融合流程 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞，離心，棄上清，用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞，離心，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌用不完全培

46、養(yǎng)液洗滌2次。同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞次。同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。次。 將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1:10或或1:5的比例混合的比例混合在一起，在在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，離心，棄上清，用滴管吸凈殘留液體。次，離心，棄上清，用滴管吸凈殘留液體。 30s內(nèi)加入預(yù)熱的一定濃度、一定分子量的內(nèi)加入預(yù)熱的一定濃度、一定分子量的PEG，邊加邊攪拌，在室溫下融合。加預(yù)熱的不邊加邊攪拌，在室溫下融合。加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止完全培養(yǎng)液，終止PEG作用。作用。 離心，棄上清，用離心，棄上清，用2

47、0小牛血清等輕輕混懸。小牛血清等輕輕混懸。將融合后細(xì)胞懸液加入將融合后細(xì)胞懸液加入96孔板，孔板，100l孔孔，37、5CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 (2)HAT選擇雜交瘤選擇雜交瘤 一般在融合一般在融合24h后，加后，加HAT選擇培養(yǎng)液。維持選擇培養(yǎng)液。維持培養(yǎng)兩周后，改用培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液。改用一般培養(yǎng)液。3 抗體的檢測(cè)與雜交瘤選擇抗體的檢測(cè)與雜交瘤選擇 篩選雜交瘤細(xì)胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交篩選雜交瘤細(xì)胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細(xì)胞系中，僅少數(shù)能分泌針對(duì)免疫原的特異性抗細(xì)胞系中，僅少數(shù)能分泌針對(duì)免疫原的特異性抗體。檢測(cè)抗體

48、的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的體。檢測(cè)抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法。一般以快速、類型不同，選擇不同的篩選方法。一般以快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感的方法為原則。簡(jiǎn)便、特異、敏感的方法為原則。4 單克隆抗體的大量生產(chǎn)單克隆抗體的大量生產(chǎn) 目前，大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：目前，大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種： (1)體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清液中獲取單克隆抗體。從上清液中獲取單克隆抗體。 (2)體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清：體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清： 實(shí)體瘤法實(shí)體瘤法 腹水的制備腹水的制

49、備 如下圖所示。如下圖所示。 5 單克隆抗體的鑒定單克隆抗體的鑒定 對(duì)制備的對(duì)制備的McAb進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。應(yīng)對(duì)其做如下方面的鑒定：的。應(yīng)對(duì)其做如下方面的鑒定： (1)特異性的鑒定特異性的鑒定 (2)McAb的的Ig(免疫球蛋白免疫球蛋白)類與亞類的鑒定類與亞類的鑒定 (3)McAb中和活性的鑒定中和活性的鑒定 (4)McAb識(shí)別抗原表位的鑒定識(shí)別抗原表位的鑒定 (5)McAb親和力的鑒定親和力的鑒定6 影響因素分析影響因素分析 由于制備由于制備McAb的實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，環(huán)節(jié)多，所以影響的實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會(huì)造成失敗。其主要失敗

50、原因素就比較多，稍不注意就會(huì)造成失敗。其主要失敗原因和影響因素可能有：因和影響因素可能有： (1)污染污染 包括細(xì)菌、霉菌和支原體的污染。包括細(xì)菌、霉菌和支原體的污染。 (2)融合后雜交瘤不生長(zhǎng)融合后雜交瘤不生長(zhǎng) 在保證融合技術(shù)沒有問題的前提下主要考慮下列因素：在保證融合技術(shù)沒有問題的前提下主要考慮下列因素： PEG有毒性或作用時(shí)間過長(zhǎng)。有毒性或作用時(shí)間過長(zhǎng)。 小牛血清的質(zhì)量太差，用前沒有進(jìn)行嚴(yán)格的篩選。小牛血清的質(zhì)量太差，用前沒有進(jìn)行嚴(yán)格的篩選。 骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體。骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體。 HAT有問題。有問題。(3)雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體

51、 雖有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，但無抗體產(chǎn)生，這可能雖有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，但無抗體產(chǎn)生，這可能是是HAT中中A失效或骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生突變，變成失效或骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生突變，變成A抵抗細(xì)胞所致。抵抗細(xì)胞所致。 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。 對(duì)于原分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞變?yōu)殛幮裕赡軐?duì)于原分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞變?yōu)殛幮?，可能是?xì)胞支原體污染，或非抗體分泌細(xì)胞克隆競(jìng)爭(zhēng)是細(xì)胞支原體污染，或非抗體分泌細(xì)胞克隆競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)，從而抑制了抗體分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)。也可性生長(zhǎng)，從而抑制了抗體分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)。也可能發(fā)生染色體丟失。能發(fā)生染色體丟失。7. 生物反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)單抗生物

52、反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)單抗 由于臨床上對(duì)治療用單抗的質(zhì)量要求高、需由于臨床上對(duì)治療用單抗的質(zhì)量要求高、需求量大，因此有必要建立采用生物反應(yīng)器大規(guī)模求量大，因此有必要建立采用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單抗的設(shè)備和工藝技術(shù)。下培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單抗的設(shè)備和工藝技術(shù)。下面以我國(guó)八五科技攻關(guān)項(xiàng)目面以我國(guó)八五科技攻關(guān)項(xiàng)目WuT3單克隆抗單克隆抗體的生物反應(yīng)器生產(chǎn)為例，介紹一下相關(guān)技術(shù)：體的生物反應(yīng)器生產(chǎn)為例，介紹一下相關(guān)技術(shù)：(1)雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞 為抗為抗CD3的的WuT3雜交瘤細(xì)胞，由我國(guó)衛(wèi)生部雜交瘤細(xì)胞，由我國(guó)衛(wèi)生部武漢生物制品研究所建株。武漢生物制品研究所建株。(2)生物反應(yīng)

53、器生物反應(yīng)器 采用采用3.5L、14L、75L攪拌式生物反應(yīng)器，有攪拌式生物反應(yīng)器，有自動(dòng)消毒、控制溫度、轉(zhuǎn)速、自動(dòng)消毒、控制溫度、轉(zhuǎn)速、DO和和pH等功能。等功能。 (3)培養(yǎng)液培養(yǎng)液 RPMll640中添加慶大霉素至中添加慶大霉素至100Uml、胎牛胎牛血清血清(NcS)或健康人血清或健康人血清(HuS)、添加劑添加劑HEN(蛋蛋白胨和糖類白胨和糖類)。(4)培養(yǎng)方式培養(yǎng)方式 控制溫度在控制溫度在37 、pH7.1、轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速4060rmin、DO在在3050，分批和半連續(xù)培養(yǎng)。產(chǎn)物用管，分批和半連續(xù)培養(yǎng)。產(chǎn)物用管式連續(xù)流離心機(jī)除去細(xì)胞，收集上清液用于單抗式連續(xù)流離心機(jī)除去細(xì)胞，收集上清液用

54、于單抗?jié)舛?、免疫活性、熱原等分析測(cè)定。濃度、免疫活性、熱原等分析測(cè)定。(5)結(jié)果與分析結(jié)果與分析 利用生物反應(yīng)器分批培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，在收獲利用生物反應(yīng)器分批培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，在收獲時(shí)細(xì)胞的凋亡比例很高時(shí)細(xì)胞的凋亡比例很高(約占細(xì)胞總量的約占細(xì)胞總量的90)，這主要是由于反應(yīng)器內(nèi)葡萄糖、谷氨酰胺等營(yíng)養(yǎng)這主要是由于反應(yīng)器內(nèi)葡萄糖、谷氨酰胺等營(yíng)養(yǎng)缺乏、有毒代謝產(chǎn)物積累所致。如果采用半連續(xù)缺乏、有毒代謝產(chǎn)物積累所致。如果采用半連續(xù)培養(yǎng)方式，及時(shí)補(bǔ)充葡萄糖、谷氨酰胺等營(yíng)養(yǎng)，培養(yǎng)方式，及時(shí)補(bǔ)充葡萄糖、谷氨酰胺等營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)及時(shí)排出代謝產(chǎn)生的有毒物質(zhì)同時(shí)及時(shí)排出代謝產(chǎn)生的有毒物質(zhì)(尤其是氨尤其是氨)，能有效地抑

55、制細(xì)胞凋亡，最終促進(jìn)了細(xì)胞生長(zhǎng)、能有效地抑制細(xì)胞凋亡，最終促進(jìn)了細(xì)胞生長(zhǎng)、有效維持了抗體的合成與分泌，并且可以連續(xù)收有效維持了抗體的合成與分泌，并且可以連續(xù)收獲單抗產(chǎn)品。獲單抗產(chǎn)品。(二二) 利用原生質(zhì)體融合和培養(yǎng)技術(shù)培育新植物利用原生質(zhì)體融合和培養(yǎng)技術(shù)培育新植物 組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的成熟為植物遺傳育種組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的成熟為植物遺傳育種提供了條件。許多遺傳育種技術(shù)提供了條件。許多遺傳育種技術(shù)(如細(xì)胞融合、如細(xì)胞融合、染色體工程等染色體工程等)與組織、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合在一與組織、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合在一起，就能快速培養(yǎng)出具有優(yōu)良遺傳性狀的新型物起，就能快速培養(yǎng)出具有優(yōu)良遺傳性狀的新型物種。種。1

56、 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)植物原生質(zhì)體培養(yǎng) 從用處上從用處上(實(shí)踐和理論上實(shí)踐和理論上)講，講，原生質(zhì)體分離與培原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)有以下意義：養(yǎng)有以下意義： 融合產(chǎn)生體細(xì)胞雜種。融合產(chǎn)生體細(xì)胞雜種。 分離或引入各種細(xì)胞器。分離或引入各種細(xì)胞器。 導(dǎo)入外源基因。導(dǎo)入外源基因。 誘發(fā)突變體。誘發(fā)突變體。 研究細(xì)胞信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)取Ｑ芯考?xì)胞信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)取?研究細(xì)胞壁合成機(jī)制。研究細(xì)胞壁合成機(jī)制。 研究膜的功能與細(xì)胞膜相互的作用。研究膜的功能與細(xì)胞膜相互的作用。 研究核質(zhì)關(guān)系。研究核質(zhì)關(guān)系。 研究疾病與抗性機(jī)理。研究疾病與抗性機(jī)理。(1)原生質(zhì)體的獲得與純化原生質(zhì)體的獲得與純化

57、 從來源上，原生質(zhì)體獲得途徑主要包括：植從來源上，原生質(zhì)體獲得途徑主要包括：植物葉片、根尖、花粉、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細(xì)物葉片、根尖、花粉、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞等。植物原生質(zhì)體的分離方法已在前面介紹了，胞等。植物原生質(zhì)體的分離方法已在前面介紹了，這里不再重復(fù)。植物原生質(zhì)體的純化方法主要采這里不再重復(fù)。植物原生質(zhì)體的純化方法主要采用：用： 沉降法沉降法 漂浮法漂浮法 沉降與漂浮結(jié)合法沉降與漂浮結(jié)合法(2)原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng) 液體培養(yǎng)：把純化后的原生質(zhì)體懸浮于液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)：把純化后的原生質(zhì)體懸浮于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。又分為液體淺層培養(yǎng)和液體懸滴培養(yǎng)兩種。中進(jìn)行培養(yǎng)。又分為液體淺層

58、培養(yǎng)和液體懸滴培養(yǎng)兩種。 固體平板法：就是將原生質(zhì)體均勻地埋入瓊脂培養(yǎng)固體平板法：就是將原生質(zhì)體均勻地埋入瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，類似于微生物的培養(yǎng)?；羞M(jìn)行培養(yǎng)，類似于微生物的培養(yǎng)。 雙層培養(yǎng)法：在瓊脂培養(yǎng)基上部加入一薄層液體原生雙層培養(yǎng)法：在瓊脂培養(yǎng)基上部加入一薄層液體原生質(zhì)體培養(yǎng)液，能保持好的濕度，利于原生質(zhì)體的生長(zhǎng)。質(zhì)體培養(yǎng)液，能保持好的濕度，利于原生質(zhì)體的生長(zhǎng)。 原生質(zhì)體的培養(yǎng)一般經(jīng)過細(xì)胞壁再生、細(xì)胞分裂成原生質(zhì)體的培養(yǎng)一般經(jīng)過細(xì)胞壁再生、細(xì)胞分裂成細(xì)胞團(tuán)、愈傷組織細(xì)胞團(tuán)、愈傷組織(或胚狀體或胚狀體)、分化成芽和根、完整植、分化成芽和根、完整植株這幾個(gè)過程。株這幾個(gè)過程。利用原生質(zhì)體培養(yǎng)可以實(shí)現(xiàn)優(yōu)良品種的利用原生質(zhì)體培養(yǎng)可以實(shí)現(xiàn)優(yōu)良品種的快速繁殖；而且，當(dāng)與其他改變遺傳的技術(shù)快速繁殖；而且，當(dāng)與其他改變遺傳的技術(shù)(如細(xì)胞融如細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)基因等合、轉(zhuǎn)基因等)相結(jié)合，就有可能實(shí)現(xiàn)新品種的培育。相結(jié)合，就有可能實(shí)現(xiàn)新品種的培育。 2. 利用原生質(zhì)體融合培育新植株利用原生質(zhì)體融合培育新植株 通過原生質(zhì)體融合再生植株的過程示意圖如通過原生質(zhì)體融合再生植株的過程示意圖如圖圖57所示。利用該技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了多種優(yōu)良品所示。利用該技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了多種優(yōu)良品