植物單倍體培養(yǎng)學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1植物植物(zhw)單倍體培養(yǎng)單倍體培養(yǎng)第一頁，共60頁?；ūūㄝ嗷ㄝ?hu )花瓣花瓣(hubn)子房子房(zfng)花柱花柱柱頭柱頭雌芯雌芯花冠花冠花藥花藥花絲花絲雄芯雄芯花托花托第3頁/共60頁第2頁/共60頁第二頁，共60頁。第七章第七章 植物單倍體植物單倍體(花藥花藥(huyo)培養(yǎng)培養(yǎng)單倍體植物單倍體植物(haplobiont)(haplobiont) 用離體培養(yǎng)花藥的方法使花粉用離體培養(yǎng)花藥的方法使花粉(hufn)(hufn)發(fā)育成一發(fā)育成一個(gè)完整的植株。個(gè)完整的植株。名詞名詞(mng c)花粉和花藥的培養(yǎng)花粉和花藥的培養(yǎng)(pollen and anther cultu

2、re) 是指花粉在培養(yǎng)基上改變其正常發(fā)育和機(jī)能，不經(jīng)受是指花粉在培養(yǎng)基上改變其正常發(fā)育和機(jī)能，不經(jīng)受精而發(fā)生細(xì)胞分裂，由單個(gè)花粉粒發(fā)育成完整單倍體植精而發(fā)生細(xì)胞分裂，由單個(gè)花粉粒發(fā)育成完整單倍體植株的技術(shù)。株的技術(shù)。第4頁/共60頁第3頁/共60頁第三頁，共60頁。花藥培養(yǎng)：其外植體為植花藥培養(yǎng)：其外植體為植物雄性生殖器官的一部分，物雄性生殖器官的一部分，就培養(yǎng)方法和技術(shù)來講，屬就培養(yǎng)方法和技術(shù)來講，屬于器官培養(yǎng)的范疇。于器官培養(yǎng)的范疇。花粉培養(yǎng)：將處于一定發(fā)花粉培養(yǎng)：將處于一定發(fā)育階段的花粉從花藥中分離育階段的花粉從花藥中分離，再加以離體培養(yǎng)。有時(shí)花，再加以離體培養(yǎng)。有時(shí)花粉培養(yǎng)也稱為小孢子

3、粉培養(yǎng)也稱為小孢子(boz)培養(yǎng)培養(yǎng)(microspore culture)。從培養(yǎng)方法和技術(shù)方面來講從培養(yǎng)方法和技術(shù)方面來講，它屬于細(xì)胞培養(yǎng)的范疇。，它屬于細(xì)胞培養(yǎng)的范疇。第5頁/共60頁第4頁/共60頁第四頁，共60頁。第七章第七章 植物單倍體植物單倍體(花藥花藥(huyo)培養(yǎng)培養(yǎng)1964年，印度學(xué)年，印度學(xué)者采用花藥培養(yǎng)者采用花藥培養(yǎng)方法，首次獲得方法，首次獲得毛葉曼陀羅單倍毛葉曼陀羅單倍體植株體植株第6頁/共60頁第5頁/共60頁第五頁，共60頁。發(fā)生發(fā)生(fshng)核融核融合合藥物藥物(yow)處理處理第7頁/共60頁第6頁/共60頁第六頁，共60頁。油菜成熟油菜成熟(chngs

4、h)花藥的結(jié)構(gòu)花藥的結(jié)構(gòu)花粉囊花粉囊花粉囊壁花粉囊壁成熟成熟(chngsh)花粉?；ǚ哿；ㄋ幜芽诨ㄋ幜芽诘谝还?jié)第一節(jié) 花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)第8頁/共60頁第7頁/共60頁第七頁，共60頁。第9頁/共60頁第8頁/共60頁第八頁，共60頁。n(fy)途徑：營養(yǎng)核和生殖核分別繼續(xù)分裂，形成多細(xì)胞的花粉，進(jìn)一步發(fā)育(fy)形成愈傷組織或胚狀體。第10頁/共60頁第9頁/共60頁第九頁，共60頁。第11頁/共60頁第10頁/共60頁第十頁，共60頁。（1）、基因型）、基因型以花藥培養(yǎng)獲得(hud)單倍體植株的植物： 茄科 十字花科 禾本科 百合科第12頁/共60頁第11頁/共60頁第十

5、一頁，共60頁。品種接種花藥數(shù)產(chǎn)生胚狀體數(shù)誘導(dǎo)率（%）元帥赤陽國光金冠9781410107313022110772.10.70.60.5不同蘋果(pnggu)品種的花藥培養(yǎng)胚狀體的誘導(dǎo)率第13頁/共60頁第12頁/共60頁第十二頁，共60頁?；净?jbn)培養(yǎng)基培養(yǎng)基激素激素(j s)種類種類和濃度和濃度蔗糖蔗糖(zhtng)濃度濃度第14頁/共60頁第13頁/共60頁第十三頁，共60頁。第15頁/共60頁第14頁/共60頁第十四頁，共60頁。u 細(xì)胞分裂素可促進(jìn)胚狀體形成；細(xì)胞分裂素可促進(jìn)胚狀體形成；u 生長素可誘導(dǎo)生長素可誘導(dǎo)(yudo)(yudo)愈傷組織愈傷組織形成。形成。u 細(xì)胞

6、分裂素與生長素比值高時(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞分裂素與生長素比值高時(shí)可誘導(dǎo)(yudo)(yudo)愈傷組織分化苗愈傷組織分化苗激素種類激素種類(zhngli)和濃度和濃度第16頁/共60頁第15頁/共60頁第十五頁，共60頁。蔗糖蔗糖(zhtng)濃度濃度第17頁/共60頁第16頁/共60頁第十六頁，共60頁。（3）、生理狀態(tài)的選擇 1.幼年的花藥好于老年的花藥2.開花初期花藥好于開花末期花藥3.不同季節(jié)接種的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率有顯著(xinzh)變化。百合(bih)的成熟花粉 第18頁/共60頁第17頁/共60頁第十七頁，共60頁。（4）、小孢子發(fā)育狀態(tài)）、小孢子發(fā)育狀態(tài) 大多數(shù)植物，在單核時(shí)大多數(shù)植物，

7、在單核時(shí)期的花粉比較容易培養(yǎng)成期的花粉比較容易培養(yǎng)成功。功。 確定花粉發(fā)育時(shí)期的方確定花粉發(fā)育時(shí)期的方法可用涂片法可用涂片(t pin)法來法來進(jìn)行。進(jìn)行。電鏡下的花粉粒 采用采用(ciyng)醋醋酸洋紅染色，壓片酸洋紅染色，壓片鏡檢，確定花粉的鏡檢，確定花粉的發(fā)育時(shí)期發(fā)育時(shí)期第19頁/共60頁第18頁/共60頁第十八頁，共60頁。 花粉粒即雄配子體。為花粉粒即雄配子體。為2細(xì)胞細(xì)胞(xbo)花粉或花粉或3細(xì)胞細(xì)胞(xbo)花粉花粉第20頁/共60頁第19頁/共60頁第十九頁，共60頁。雄配子體的發(fā)育雄配子體的發(fā)育 營養(yǎng)細(xì)胞營養(yǎng)細(xì)胞生殖細(xì)胞生殖細(xì)胞精子精子第21頁/共60頁第20頁/共60頁第

8、二十頁，共60頁。A、花粉發(fā)育(fy)時(shí)期四分體 小孢子 單核花粉 雙核花粉 最適期最適期第22頁/共60頁第21頁/共60頁第二十一頁，共60頁。B、花藥和花粉培養(yǎng)(piyng)的取材時(shí)期四分體 單核早期 單核晚期 雙核早期 雙核晚期 三核期小孢子(boz)花粉?；ǚ?hufn)培養(yǎng)花藥培養(yǎng)不同植物不同植物有區(qū)別有區(qū)別第23頁/共60頁第22頁/共60頁第二十二頁，共60頁。Sunderland（1971）對煙草不同花粉發(fā)育時(shí)期）對煙草不同花粉發(fā)育時(shí)期的培養(yǎng)反應(yīng)進(jìn)行了觀察：的培養(yǎng)反應(yīng)進(jìn)行了觀察：花粉發(fā)育時(shí)期花粉發(fā)育時(shí)期 胚狀體誘導(dǎo)率（胚狀體誘導(dǎo)率（%） 減數(shù)分裂減數(shù)分裂(jin sh fn

9、li)期期 0單核時(shí)期單核時(shí)期 14單核晚期單核晚期 44雙核時(shí)期雙核時(shí)期 55第24頁/共60頁第23頁/共60頁第二十三頁，共60頁。小孢子發(fā)育時(shí)期小孢子發(fā)育時(shí)期培養(yǎng)花藥數(shù)培養(yǎng)花藥數(shù)胚狀體（胚狀體（%）單核早期單核早期單核靠邊（中）單核靠邊（中）單核靠邊（晚）單核靠邊（晚）雙核早雙核早雙核晚雙核晚157721633007.819.41.590煙草小孢子發(fā)育時(shí)期煙草小孢子發(fā)育時(shí)期(shq)對胚狀體誘導(dǎo)率的影響對胚狀體誘導(dǎo)率的影響第25頁/共60頁第24頁/共60頁第二十四頁，共60頁。適宜小孢子發(fā)育時(shí)期適宜小孢子發(fā)育時(shí)期代表植物代表植物減數(shù)分裂期減數(shù)分裂期四分孢子期四分孢子期單核早期單核早期

10、單核晚期單核晚期單核早期至晚期單核早期至晚期單核早期至雙核期單核早期至雙核期四分孢子期至雙核期四分孢子期至雙核期番茄、草莓番茄、草莓葡萄葡萄油菜、蘋果、石刁柏油菜、蘋果、石刁柏小麥、茄子、青椒、荔枝、楸子小麥、茄子、青椒、荔枝、楸子煙草、柑橘、橡膠、龍眼、楊樹煙草、柑橘、橡膠、龍眼、楊樹水稻、甘藍(lán)、梨水稻、甘藍(lán)、梨玉米玉米一些植物花藥和花粉培養(yǎng)適宜一些植物花藥和花粉培養(yǎng)適宜(shy)的小孢子發(fā)育時(shí)期的小孢子發(fā)育時(shí)期第26頁/共60頁第25頁/共60頁第二十五頁，共60頁。（5）、預(yù)處理）、預(yù)處理 花藥和花粉的預(yù)處理花藥和花粉的預(yù)處理(chl)措施主要是低溫處理措施主要是低溫處理(chl)耐寒植

11、物比喜溫植物處理耐寒植物比喜溫植物處理(chl)的溫度可低些的溫度可低些較低溫度處理較低溫度處理(chl)時(shí)間要短，較高溫度處理時(shí)間要短，較高溫度處理(chl)時(shí)間宜長時(shí)間宜長水稻水稻(shudo)：5-10,3-12天天小麥小麥(xiomi)：1-5,2-7天天第27頁/共60頁第26頁/共60頁第二十六頁，共60頁。不同不同(b tn)資料有資料有所不同所不同(b tn)！第28頁/共60頁第27頁/共60頁第二十七頁，共60頁。低溫處理的作用(zuyng)機(jī)理： A、低溫可改變花粉粒第一次有絲分裂紡錘體的軸向，形成兩個(gè)均等細(xì)胞，使得花粉朝著胚胎方向發(fā)育； B、低溫使花粉保持較長時(shí)間的活力

12、，使?fàn)I養(yǎng)細(xì)胞得以完成細(xì)胞質(zhì)的改組(giz)而轉(zhuǎn)向胚胎發(fā)生。第29頁/共60頁第28頁/共60頁第二十八頁，共60頁。處理天數(shù)接種花藥（枚）發(fā)生愈傷組織的花藥發(fā)生胚狀體的花數(shù)枚%枚%對照51015202584872390284647043458918530.591.111.002.131.060.69812155230.941.661.660.590.430.69低溫（低溫（3 ）處理）處理(chl)對四季橘花藥愈傷組織和胚狀體形成的對四季橘花藥愈傷組織和胚狀體形成的影響影響處理處理(chl)天數(shù)不天數(shù)不同，效果明顯不同同，效果明顯不同第30頁/共60頁第29頁/共60頁第二十九頁，共60頁。五

13、、外植體制備及接種五、外植體制備及接種材料：未開放的花蕾材料：未開放的花蕾原因：花藥和花粉處于無菌狀態(tài)原因：花藥和花粉處于無菌狀態(tài)滅菌滅菌(mi jn)：表面滅菌：表面滅菌(mi jn)殺滅花蕾表面微生物殺滅花蕾表面微生物 處理強(qiáng)度以輕為好處理強(qiáng)度以輕為好第31頁/共60頁第30頁/共60頁第三十頁，共60頁。1、花藥和花粉培養(yǎng)的表面滅菌、花藥和花粉培養(yǎng)的表面滅菌 70%75%酒精浸潤花蕾酒精浸潤花蕾(huli)30s左右左右;飽和漂白粉溶液中浸泡飽和漂白粉溶液中浸泡1020min，或在，或在0.1%升汞溶液中處理升汞溶液中處理10min左右左右;無菌水漂洗無菌水漂洗35次次.同常規(guī)同常規(guī)(c

14、hnggu)組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)第32頁/共60頁第31頁/共60頁第三十一頁，共60頁。2、獲得、獲得(hud)花粉的花粉的方法方法A、機(jī)械擠壓梯度離心法、機(jī)械擠壓梯度離心法花藥花藥(huyo)消毒消毒用鑷子或小玻璃杵子將花粉從花藥用鑷子或小玻璃杵子將花粉從花藥(huyo)中擠壓出中擠壓出用用30%蔗糖離心收集懸浮上層的完整蔗糖離心收集懸浮上層的完整花粉粒花粉粒用培養(yǎng)基洗滌幾次用培養(yǎng)基洗滌幾次培養(yǎng)培養(yǎng)無菌條件無菌條件(tiojin)下下第33頁/共60頁第32頁/共60頁第三十二頁，共60頁。B、自然散粉法、自然散粉法 消毒后的花藥接種在液體消毒后的花藥接種在液體(yt)培養(yǎng)基中培養(yǎng)基中 一定溫

15、度下振蕩培養(yǎng)一定溫度下振蕩培養(yǎng) 花粉自行散落到培養(yǎng)基中花粉自行散落到培養(yǎng)基中 除去花藥壁除去花藥壁 花粉重新培養(yǎng)在新鮮培養(yǎng)基上花粉重新培養(yǎng)在新鮮培養(yǎng)基上無菌條件無菌條件(tiojin)下下第34頁/共60頁第33頁/共60頁第三十三頁，共60頁。3、培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法的選擇、培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法的選擇最常用的培養(yǎng)基是最常用的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。培養(yǎng)方法：培養(yǎng)方法： 平板培養(yǎng)平板培養(yǎng) 液體液體(yt)培養(yǎng)培養(yǎng) 雙層培養(yǎng)雙層培養(yǎng) 看護(hù)培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng) 微室培養(yǎng)微室培養(yǎng)第35頁/共60頁第34頁/共60頁第三十四頁，共60頁。1、平板、平板(pngbn)培養(yǎng)培養(yǎng) 花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基花粉置瓊脂固化培養(yǎng)

16、基上培養(yǎng)。上培養(yǎng)。2、液體培養(yǎng)、液體培養(yǎng) 花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。需震蕩，以利通氣。3、雙層培養(yǎng)、雙層培養(yǎng) 花粉置固體花粉置固體-液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝。培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。 第36頁/共60頁第35頁/共60頁第三十五頁，共60頁。第37頁/共60頁第36頁/共60頁第三十六頁，共60頁。第38頁/共60頁第37頁/共60頁第三十七頁，共60頁。4、影響(yngxing)因素 光照 溫度 濕度 p

17、H 培養(yǎng)基 成分 蔗糖濃度 激素第39頁/共60頁第38頁/共60頁第三十八頁，共60頁。第40頁/共60頁第39頁/共60頁第三十九頁，共60頁。花藥和花粉培養(yǎng)的主要目的是制備(zhbi)單倍體植株。但其再生植株并不都是單倍體。因此，必須對獲得的花藥和花粉植株進(jìn)行倍性鑒定。六、單倍體植株六、單倍體植株(zhzh)的鑒定的鑒定第41頁/共60頁第40頁/共60頁第四十頁，共60頁。第42頁/共60頁第41頁/共60頁第四十一頁，共60頁。第43頁/共60頁第42頁/共60頁第四十二頁，共60頁。第44頁/共60頁第43頁/共60頁第四十三頁，共60頁。大大縮短育種大大縮短育種(y zhng)周

18、期周期第45頁/共60頁第44頁/共60頁第四十四頁，共60頁。-選幼年選幼年(yunin)樹樹花蕾花蕾第46頁/共60頁第45頁/共60頁第四十五頁，共60頁。取花蕾（鏡檢）取花蕾（鏡檢）預(yù)培養(yǎng)數(shù)天預(yù)培養(yǎng)數(shù)天取花藥取花藥消毒消毒分離花分離花粉粉接種接種培養(yǎng)培養(yǎng)愈傷組織發(fā)生愈傷組織發(fā)生第47頁/共60頁第46頁/共60頁第四十六頁，共60頁。部分花藥(huyo)通過胚狀體途徑形成小植株煙草(ynco)花藥培養(yǎng)第48頁/共60頁第47頁/共60頁第四十七頁，共60頁。a) 球形胚 d) 魚雷形胚蕓苔屬小孢子(boz)培養(yǎng)蕓薹蕓薹(ynti)：油：油菜花菜花第49頁/共60頁第48頁/共60頁第四十八頁，共60頁。第50頁/共60頁第49頁/共60頁第四十九頁，共60頁。Late stage embryos (21 days) (B. napus)第51頁/共60頁第50頁/共60頁第五十頁，共60頁。部分花藥產(chǎn)生(chnshng)愈傷組織接種在平板(pngbn)上的水稻花藥水稻花藥培養(yǎng)第52頁/共60頁第51頁/共60頁第五十一頁，共60頁