第三章基因組作圖

1、第三章第三章 基因組作圖基因組作圖Genome Mapping這條軌道上的信息中蘊藏多少金錢呢？基因組學領(lǐng)域的風險投資前景我國能在競爭中占據(jù)多少地盤呢？與基因組作圖有關(guān)的諾貝爾獎The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1933摩爾根：遺傳的染色體理論The Nobel Prize in Chemistry 1962沃森和克里克：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)限制性內(nèi)切酶的應用The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978for the discovery of restriction enzymes and their

2、 application to problems of molecular geneticsThe Nobel Prize in Chemistry 1958/1980 桑格研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，成功地測定了胰鳥素的精細結(jié)構(gòu)，因而獲得了1958年的諾貝爾化學獎。60年代后他致力于RNA和DNA結(jié)構(gòu)研究，其測定RNA和DNA序列的方法，1980年再度獲諾貝爾獎。Arber WNathans DSmith HSanger F與基因組作圖有關(guān)的諾貝爾獎The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1993 for his invention of the polym

3、erase chain reaction (PCR) method發(fā)現(xiàn)PCR方法Mullis F染色體研究獲諾貝爾醫(yī)學獎美國人伊麗莎白布萊克本、卡蘿爾格雷德和杰克紹斯塔克，以表彰他們“發(fā)現(xiàn)端粒和端粒酶是如何保護染色體的”。伊麗莎白布萊克本是卡蘿爾格雷德的導師?；蚪M作圖的概念O應用界標或遺傳學標記對基因組進行精細的劃分，進而標示出DNA的堿基序列或基因排列的工作。主要有遺傳圖、物理圖、序列圖、基因圖。一、基因組遺傳圖1、遺傳圖(genetic mapping)概念O 通過遺傳重組所得到的基因在具體染色體上線性排列圖稱為遺傳連鎖圖，簡稱遺傳圖。O 計算連鎖的遺傳標志之間的重組頻率，確定他們的相對

4、距離，一般用厘摩(cM，即減數(shù)分裂的重組頻率為1%)來表示。2、遺傳作圖的基礎(chǔ)連鎖分析是遺傳作圖的基礎(chǔ)。摩爾根總結(jié)了連鎖和交換定律。然而一個重大發(fā)現(xiàn)是在實驗工作的一名大學生(Sturtevant,1913)發(fā)現(xiàn)的：基因間交換（去連鎖）的概率與它們在染色體上的距離成正比例。因而重組頻率是衡量兩個基因間距離的單位。少數(shù)例外：重組熱點區(qū)域3、遺傳作圖標記O 結(jié)構(gòu)基因和DNA多態(tài)性標記可以滿足要求：O 限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)。O 簡單序列長度多態(tài)性（simple sequence length polymor

5、phism, SSLP) :小衛(wèi)星DNA、微衛(wèi)星DNA。O 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)：人類基因組中至少有400萬個SNP，其中只有10萬個可以形成RFLP。 總之：它們是可以識別的結(jié)構(gòu)。4、遺傳作圖的方法 對果蠅和小鼠等物種的連鎖分析，進行有計劃的育種實驗：觀察后代重組率。 對不發(fā)生減數(shù)分裂的細菌的連鎖分析：誘導同源片段交換，觀察子代細胞重組率。O接合：DNA從一個細菌到另一個細菌。O轉(zhuǎn)導：通過噬菌體轉(zhuǎn)移小片段DNA。O轉(zhuǎn)化：受體菌從環(huán)境中攝取供體細胞釋放的DNA片段 對人的連鎖分析，只能通過家系分析完成：分析家庭連續(xù)幾代成員遺傳

6、標記與某基因（或某疾?。┕餐霈F(xiàn)的頻率。家系連鎖分析（PCR-電泳）人類家系譜顯示了小衛(wèi)星DNA等位基因的分離。在這張家系譜中有六對等位基因，但是任何一個人僅有一個（純合）或兩個（雜合）等位基因。遺傳標記系譜連鎖分析圖，“1”片段與疾病基因連鎖5、遺傳圖譜的用途O 提供基因在染色體上的坐標，為基因識別和基因定位創(chuàng)造了條件。O 例如，6000多個遺傳標記能夠把人的基因組分成6000多個區(qū)域，連鎖分析找到某一疾病基因與某一標記緊密連鎖的證據(jù)，可把這一基因定位于這一已知區(qū)域。O 遺傳圖的分子座標也是基因組物理圖繪制的基礎(chǔ)?；蚣岸鄳B(tài)性位點的分布圖距連鎖圖人類1號染色體連鎖圖二、基因組物理圖（phys

7、ical mapping)O 物理圖更精細的圖譜。物理圖的構(gòu)建是基因組測序的基礎(chǔ)，有承上啟下的作用。物理圖與遺傳圖比較：基因間關(guān)系更準確（啤酒酵母3號染色體）。（一）基因組物理圖作圖方法限制酶切作圖：根據(jù)重疊序列確定酶切片段間連接順序，以及遺傳標志之間物理距離的圖譜。熒光原位雜交圖：將分子標記與完整染色體雜交來確定標記的位置。序列標記位點（STS）圖：通過對基因組片段進行PCR和雜交分析，來對短序列進行定位作圖。物理圖作圖方法 ：限制性酶切圖O 有什么方法知道酶切片段之間的關(guān)系呢？答案是：重疊片段。O 重疊群：相互間存在重疊序列的一組克隆，可根據(jù)重疊順序的相對位置將各個克隆首尾連接，構(gòu)成連續(xù)順

8、序圖。O 以連續(xù)的重疊群為基本框架，通過遺傳標記將重疊群排列于染色體上。限制酶切作圖基本方法O DNA分子被兩種識別不同靶序列的限制性酶切和控制條件的部分酶切片段。部分酶切法測定DNA片段位置完全降解：獲得完全酶切片段的數(shù)目和大小的圖譜。部分降解：避免所有切口斷裂的完全降解發(fā)生。部分酶解產(chǎn)物同樣進行電泳分離及自顯影。比較上述二步的自顯影圖譜,根據(jù)片段大小及彼此間的差異即可排出酶切片段在DNA鏈上的位置。O DNA分子被兩種識別不同靶序列的限制性酶切 和控制條件的部分酶切片段。限制酶切作圖基本方法兩種限制酶切 完全酶切如圖如果控制反應條件避免完全酶切發(fā)生,因僅有A或B酶切,可產(chǎn)生部分重疊的片段。

9、 即:這個體系中既有7kb片段,又有8kb片段,兩種片段中有5kb是重疊的。兩種限制酶切點之間的片段為重疊的片段 限制酶切圖技術(shù)路線ODNA片段 酵母人工染色體（YAC）重疊群 篩選陽性YAC酶切 cosmid人工染色體重疊群 陽性cosmid酶切 質(zhì)粒亞克隆 隨機測序 計算機分析串連得大片段。酵母人工染色體（YAC）YAC載體是利用釀酒酵母的染色體的復制元件構(gòu)建的載體。YAC載體必須含有以下元件：端粒重復序列著絲粒自主復制序列Cosmid粘粒cosmid是英文cossite-carrying plasmid 的縮寫, 也稱粘粒、柯斯載體。是人工建造的含有噬菌體DNA的cos序列和質(zhì)粒復制子的

10、特殊類型的質(zhì)粒載體。疾病基因物理圖構(gòu)建和測序（靶基因產(chǎn)物的功能研究）疾病基因篩查：基因芯片。對陽性基因用生物信息學方法和實驗手段驗證。基因芯片技術(shù) 檢測分析圖像分析Detector Detector 1 1Detector Detector 2 2False-color differential False-color differential imageimage篩查后進行結(jié)構(gòu)學和功能學驗證物理圖構(gòu)建O 低精度物理作圖：構(gòu)建覆蓋每條染色體的數(shù)百kb的大片段的圖譜。O 高精度物理作圖：構(gòu)建覆蓋每條染色體的幾十個kb的圖譜。物理圖作圖方法：熒光原位雜交（FISH）作圖O 將一組不同顏色的熒光標記

11、探針與單個變性的染色體雜交，分辨出每種雜交信號，從而測定出各探針序列的相對位置。O 探針間位置關(guān)系提供了DNA序列與基因組圖譜間的聯(lián)系。物理圖作圖方法：序列標記位點（STS）作圖O STS 來源于基因的編碼序列，是染色體上位置已定的、核苷酸序列已知的、且在基因組中只有一份拷貝的DNA短片斷位點，片段長200500bp。 O 基本特征：唯一性。STS作圖方法 酶切和部分酶切的制作重疊DNA片段。 分析兩個STS位點共存于一個片段的概率（位置越近，共存機會越大），計算STS位點的距離（分離率）繪制圖譜。物理圖譜的用途基因組物理圖譜是DNA順序測定的基礎(chǔ), 它是測序工作的第一步。為基因的定位、克隆與

12、基因之間的相互關(guān)系分析提供了有效的途徑。三、基因組測序O兩種不同的戰(zhàn)略:O全基因組隨機測序戰(zhàn)略（美國Celera公司）。O以物理圖為基礎(chǔ)的以大片斷克隆為單位的定向測序戰(zhàn)略（公共領(lǐng)域測序計劃）。O兩者的最大區(qū)別在于是否依賴基因組作圖。1、全基因組鳥槍法O 隨機先將整個基因組打碎成小片段進行測序，最終利用超級計算機根據(jù)序列之間的重疊關(guān)系進行排序和組裝，并確定它們在基因組中的正確位置。O 優(yōu)點：速度快，簡單易行，成本較低。O 缺點：最終排序結(jié)果的拼接組裝比較困難，尤其在部分重復序列較高的地方難度較大。2、逐個克隆法O對連續(xù)克隆系中排定的YAC克隆逐個進行亞克隆測序并進行組裝：O遺傳圖-物理圖-亞克隆

13、測序-計算機拼裝。O理想狀況下，整條染色體就是由一個完整的重疊群構(gòu)成。基因組“草圖”和“完成圖O 草圖繪制的是整個基因組的框架，完成圖則是基因組序列測定的完成結(jié)果和最終目標。O 完成圖完全覆蓋所測物種的基因組,準確率超過99.99%的全DNA序列圖。完成圖將為人們提供更詳盡、更準確的基因圖譜。四、基因圖譜O在識別基因組所包含的蛋白質(zhì)編碼序列的基礎(chǔ)上，繪制的有關(guān)基因序列、位置及表達模式等信息的圖譜。1. 基因圖譜制作方法:通過基因的表達產(chǎn)物mRNA反追到染色體的位置。用cDNA或EST作為“探針”進行分子雜交，鑒別出與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的基因。2. 結(jié)構(gòu)基因的分布在人類DNA中有基因密集的“城市中心”，G

14、C含量很高（淺帶）。而在基因稀少的“沙漠”區(qū)，AT含量很高（深帶）。緊鄰基因富集區(qū)處常有GC重復區(qū)，可能調(diào)節(jié)基因活性。3. 人類基因組重復序列O重復順序沒有編碼功能，參與染色體的結(jié)構(gòu)形成和動態(tài)變化。O重復順序比較：人類：50%、擬南芥：11%、線蟲：7%、果蠅：3%、細菌：0。4. 人類基因組的特色 一個基因可產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)，原因是人類mRNA“可變剪接”和蛋白質(zhì)化學修飾增強。人類基因數(shù)約為線蟲或果蠅兩倍，蛋白質(zhì)為三倍以上。 每個基因家族的成員較多，尤其是與發(fā)育和免疫相關(guān)的基因家族。 人類在5千萬年前已停止積累重復DNA，但嚙齒類似乎還在繼續(xù)積累。5、不同人種的基因組圖O對白、黑、黃三人種進行

15、大樣本的全基因組測序和序列比較，探索人類基因組在不同人群中的多態(tài)性分布和變化規(guī)律。O是國際合作進行的千人個體基因組多態(tài)性研究的一部分。O世界上第一個黃種人基因組序列圖由華大基因研究院完成。命名為炎黃一號。黃種人的基因組圖黃種人突變位點與白種人不盡相同，不能完 全照搬國外的診斷標準。 開展黃種人基因與疾病關(guān)系的研究， 將為黃 種人的疾病治療提供更準確和更有針對性的 “基因標準圖庫”，“好比為你的基因做了一張參考CT”。6、個人基因組圖譜O 2020年后，每個人都可能擁有自己的基因組圖譜，這意味著實現(xiàn)個體化診斷、個體化治療。已經(jīng)完成個人基因組圖譜的有：“DNA之父”詹姆斯沃森、基因組研究先鋒Cra

16、ig Venter的個人基因組序列圖（均為白人）。根據(jù)投資者預測，這些重量級人物的基因組圖譜的繪制，預示著個人基因組時代的大幕已經(jīng)拉開。將來可達到10002000美元/人。7、基因組單體型單體型（haplotype）:每條染色體上帶有各個基因座上的某個等位基因。一條染色體上這些不同的等位基因組合就是不同的單體型。（1）單體型圖的基礎(chǔ)OHapMap的科學基礎(chǔ)是染色體上的SNP的“板塊”（block）結(jié)構(gòu)。SNPs在一段染色體上是成組遺傳的，每個板塊在進化上非常保守，在多世代的傳遞中極少發(fā)生DNA重組，其SNPs的構(gòu)成在單個染色體上的模式，即單體型。（2）人類基因組單體型圖計劃是人類基因組研究領(lǐng)域

17、的又一重大研究計劃。將在已完成的人類全基因組序列圖的基礎(chǔ)上，確定人類不同族群中經(jīng)世代遺傳仍保持完整的單體型圖。并將這些不同的單體型標上標簽。（3）基因組單體型圖）-中國卷第一屆國際人類基因組單體型圖計劃戰(zhàn)略會議確定了5個國家的任務：美國31，日本25，英國24，加拿大10，中國10。“中國卷”的具體內(nèi)容是構(gòu)建3號、21號染色體和8號染色體短臂的人類基因組單體型圖。樣品將分別取自亞、歐、非裔人群，我國將提供一半的亞裔樣品，占到研究樣品總數(shù)的16。這意味著我國雖然只做10的構(gòu)建工作，但可以得到幾十份全基因組規(guī)模的單體型圖，并且獲得與其它族裔的比對結(jié)果。我國樣品將在北京師范大學進行采集。（4）中國10單體型圖計劃O北京、香港和臺灣地區(qū)的科學家將共同參加這一重大國際合作科研項目，進行國際交流，并統(tǒng)一向國際中心提交數(shù)據(jù)。O中國協(xié)調(diào)組由楊煥明院士任組長。香港大學、香港科技大學和香港中文大學計劃共同承擔單體型圖2的任務，臺灣中研院下屬的生物醫(yī)學科學研究所計劃承擔約1.5左右的工作。其余6.5%任務由大陸科學家承擔。（5）基因組單體型圖的意義是人類基因組的遺傳整合圖，將對基因組的研究更為全面、有效、準確、經(jīng)濟。是人類起源、進化、遷徙的基因組信息和研究工具。有助于不同群體的遺傳多態(tài)性研究，疾病與遺傳的關(guān)聯(lián)分析，致病基因的確定，藥效及副作用。（6）單體型圖-中國卷基因組南方研究中心黃薇研究員，繪