實驗五 還原糖-砷鉬酸比色法

1、一、糖一、糖1. 1. 糖的生理功能糖的生理功能(1)(1)分布廣泛的有機化合物分布廣泛的有機化合物, ,它是某些植物種子它是某些植物種子、根、莖的重要組成部分，也是蔬菜、根、莖的重要組成部分，也是蔬菜、水果等水果等的重要組成部分。的重要組成部分。(2)(2)維持生命活動的主要能量來源。維持生命活動的主要能量來源。(3)(3)是許多植物和微生物細胞壁的重要組成部是許多植物和微生物細胞壁的重要組成部分。分。2.2.測定的意義測定的意義(1)(1)在植物組織中，糖含量可高達在植物組織中，糖含量可高達80%80%左右，在左右，在動物和人組織中，含量較少，約為干重的動物和人組織中，含量較少，約為干重的

2、2%2%。(2)(2)植物中糖的種類和含量分析，對于選種及植物中糖的種類和含量分析，對于選種及控制培育條件有重要的意義?？刂婆嘤龡l件有重要的意義。(3)(3)在微生物發(fā)酵中控制培養(yǎng)基中糖等物質(zhì)的在微生物發(fā)酵中控制培養(yǎng)基中糖等物質(zhì)的含量，對指導(dǎo)生產(chǎn)實踐很重要。含量，對指導(dǎo)生產(chǎn)實踐很重要。(4)(4)在醫(yī)學(xué)方面根據(jù)血糖或尿糖含量的高低診在醫(yī)學(xué)方面根據(jù)血糖或尿糖含量的高低診斷某些疾病。斷某些疾病。3.3.測定的方法測定的方法(1)(1)根據(jù)糖溶液的折射率、比重、旋光活性等根據(jù)糖溶液的折射率、比重、旋光活性等物理性質(zhì)，可用折射儀、波美比重計、旋光物理性質(zhì)，可用折射儀、波美比重計、旋光儀來測定糖含量。儀

3、來測定糖含量。(2)(2)根據(jù)糖的化學(xué)性質(zhì)可用滴定法、比色法定根據(jù)糖的化學(xué)性質(zhì)可用滴定法、比色法定量測定，此外還有氧電極、酶電極等快速微量測定，此外還有氧電極、酶電極等快速微量的定糖方法。量的定糖方法。二、實驗?zāi)康亩嶒災(zāi)康?.1.了解還原糖的生理意義及作用。了解還原糖的生理意義及作用。2.2.掌握砷鉬酸比色法測定還原糖的基本原掌握砷鉬酸比色法測定還原糖的基本原理和操作方法。理和操作方法。三、實驗原理三、實驗原理還原糖還原糖：指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還

4、原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的利用糖的溶解度溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來。雙糖和多糖分別提取出來。對沒有還原性的雙糖和多糖，可用對沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法酸水解法使其使其降解成有還原性的單糖進行測定，再分別求出樣品降解成有還原性的單糖進行測定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計）。中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計）。1、砷鉬酸比色原理、砷鉬酸比色原理（1 1）還原糖在堿性條件下加熱，可以定量地還原）還原糖在堿性條件下加熱，可以定量地還原二價銅離子為一

5、價銅離子，即產(chǎn)生磚紅色地氧化亞二價銅離子為一價銅離子，即產(chǎn)生磚紅色地氧化亞銅沉淀，其本身被氧化。具體反應(yīng)如下：銅沉淀，其本身被氧化。具體反應(yīng)如下：（酒石酸鉀鈉）（酒石酸鉀鈉）磚紅色磚紅色（2 2）氧化亞銅在酸性條件下，可將鉬酸銨還）氧化亞銅在酸性條件下，可將鉬酸銨還原，還原型地鉬酸銨再與砷酸氫二鈉起作用，原，還原型地鉬酸銨再與砷酸氫二鈉起作用，生成一種藍色復(fù)合物即砷鉬藍，其顏色深淺生成一種藍色復(fù)合物即砷鉬藍，其顏色深淺在一定范圍內(nèi)與還原糖地含量在一定范圍內(nèi)與還原糖地含量( (即被還原的即被還原的CuCu2 2O)O)成正比，用標準葡萄糖與砷鉬酸作用，成正比，用標準葡萄糖與砷鉬酸作用，比色后做標

6、準，就可測得樣品還原糖含量。比色后做標準，就可測得樣品還原糖含量。2、測定還原糖其它方法、測定還原糖其它方法(1)(1)蒽酮比色法：蒽酮比色法： 強酸可使糖類脫水生成糠醛，糠醛與強酸可使糖類脫水生成糠醛，糠醛與蒽酮脫水縮合，形成糠醛的衍生物，呈藍綠蒽酮脫水縮合，形成糠醛的衍生物，呈藍綠色，其顏色的深淺與糖含量成正比關(guān)系，在色，其顏色的深淺與糖含量成正比關(guān)系，在620nm620nm波長下可測定其光密度值。波長下可測定其光密度值。(2) 3,5-(2) 3,5-二硝基水楊酸：二硝基水楊酸： 還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，酸及其它產(chǎn)物，3,5-3,5-

7、二硝基水楊酸則被還原二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的為棕紅色的3-3-氨基氨基-5-5-硝基水楊酸。在一定范硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計，在成正比關(guān)系，利用分光光度計，在540nm540nm波長波長下測定光密度值，查對標準曲線并計算，便下測定光密度值，查對標準曲線并計算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。可求出樣品中還原糖和總糖的含量。(3)(3)費林試劑滴定法費林試劑滴定法 費林試劑由甲乙兩種溶液混合而成，甲費林試劑由甲乙兩種溶液混合而成，甲液液( (硫酸銅硫酸銅) )與乙液與乙液( (氫氧化鈉氫氧化

8、鈉) )生成天藍色沉生成天藍色沉淀，在堿性溶液中，乙液淀，在堿性溶液中，乙液( (酒石酸鉀鈉酒石酸鉀鈉) )使氫使氫氧化銅溶解生成一種絡(luò)合物，還原糖在堿性氧化銅溶解生成一種絡(luò)合物，還原糖在堿性加熱條件下，可以定量還原費林試劑中加熱條件下，可以定量還原費林試劑中CuCu2 2+ +為為CuCu1+1+, ,使費林試劑脫色，其脫色的程度與還使費林試劑脫色，其脫色的程度與還原糖含量成正比關(guān)系。原糖含量成正比關(guān)系。四、實驗材料、主要儀器和試劑四、實驗材料、主要儀器和試劑 1 1實驗材料實驗材料 ：蘋果2 2儀器儀器（1 1）恒溫水浴鍋）恒溫水浴鍋 （2 2）Spc22-Spc22-可見分光光度計可見分

9、光光度計（3 3）容量瓶（容量瓶（4 4）漏斗（）漏斗（5 5）研缽）研缽3 3試劑試劑（1）銅試劑：）銅試劑：CuSO4、酒石酸鉀鈉、酒石酸鉀鈉、Na2SO4、Na2CO3、NaHCO3（2）砷鉬酸試劑：）砷鉬酸試劑：（NH4)6Mo7O244H2O、Na2HAso47H2O（3） 200g/mL葡萄糖標準液葡萄糖標準液1 1、制作標準曲線、制作標準曲線: : 取取7 7支試管，按下表操作，然后以支試管，按下表操作，然后以標準葡萄糖濃度標準葡萄糖濃度為橫坐標，為橫坐標，對應(yīng)的吸光值對應(yīng)的吸光值為縱坐標繪為縱坐標繪制標準曲線。制標準曲線。管管號號葡萄糖葡萄糖標準液標準液mL蒸餾水蒸餾水mL銅試

10、劑銅試劑mL沸水沸水浴浴砷鉬酸砷鉬酸mLOD620nm葡萄糖濃度葡萄糖濃度（g/ml）0(參比參比)022 10min 冷卻 2 mL 振蕩振蕩2min定定容容到到20 mL0 10.11.910 20.21.820 30.31.730 4 0.41.640 50.51.55060.61.460提取液提取液2ml五、實驗步驟標準葡萄糖溶液濃度(ug/ml)OD值0樣品ODC02 2、還原糖的提取、還原糖的提取 稱取稱取0.5g0.5g蘋果于研缽中蘋果于研缽中加約加約30ml30ml蒸餾水由蒸餾水由漏斗沖入漏斗沖入50ml50ml容量瓶，搖勻容量瓶，搖勻8080水浴浸提水浴浸提30min30mi

11、n冷卻冷卻加加3mlZnSO3mlZnSO4 4加加3ml0.3N3ml0.3N的的Ba(OH)Ba(OH)2 2振蕩后靜置振蕩后靜置上層出現(xiàn)清液后再加一滴上層出現(xiàn)清液后再加一滴Ba(OH)Ba(OH)2 2至無白色沉淀至無白色沉淀定容至定容至50ml50ml。 3 3、還原糖含量的測定、還原糖含量的測定 過濾提取液過濾提取液取濾液取濾液0.5ml0.5ml于于50ml50ml容量瓶中容量瓶中定容定容取稀釋液取稀釋液2ml2ml于刻度試管中于刻度試管中加銅試劑加銅試劑2ml2ml煮沸煮沸10min10min加砷鉬酸試劑加砷鉬酸試劑2ml2ml振蕩振蕩2min2min定容到定容到20ml620nm20ml620nm下比色測定下比色測定記錄結(jié)果記錄結(jié)果查標準曲線。查標準曲線。五、結(jié)果與計算五、結(jié)果與計算 在標準曲線上分別查出相應(yīng)的還原糖毫克數(shù)，在標準曲線上分別查出相應(yīng)的還原糖毫克數(shù)，按下式計算出樣品中還原糖百分含量。按下式計算出樣品中還原糖百分含量。還原糖還原糖(%)=(%)= W101