診斷分子生物學(xué)基本技術(shù)

1、診斷分子生物學(xué)基本技術(shù)診斷分子生物學(xué)基本技術(shù)診斷分子生物學(xué)基本技術(shù)診斷分子生物學(xué)基本技術(shù)基礎(chǔ)知識(shí)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)診斷技術(shù)臨床應(yīng)用ampr半乳糖苷酶N端編碼序列變性與復(fù)性變性與復(fù)性（denaturation and renaturation）變性 在某些理化因素作用下，DNA分子互補(bǔ)堿基對之間的氫鍵斷裂，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)松散，變成單鏈，即變性l增色效應(yīng) 解鏈過程中，DNA的A260增加，并與解鏈溫度有一定的關(guān)系，這重關(guān)系稱為DNA的增色效應(yīng) 復(fù)性 變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條互補(bǔ)鏈可重新恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象即復(fù)性l退火 熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻即可復(fù)性，這一過程稱為退火解鏈溫度解鏈溫度Tm(melt

2、ing temperature)解鏈曲線 在連續(xù)加熱DNA過程中，以溫度對A260的關(guān)系作圖，所得曲線稱為解鏈曲線 解鏈溫度 Tm 在解鏈曲線中，紫外線吸收值達(dá)到達(dá)50%時(shí)的溫度為Tm。在Tm時(shí)，核酸分子內(nèi)50%的雙鏈結(jié)構(gòu)被打開Tm的影響因素l堿基組成 與G+C比例有關(guān)， G+C比例越高，Tm值越高l實(shí)驗(yàn)條件 例如三氯醋酸存在使Tm變小，氯化鈉存在使Tm升高基因載體基因載體（gene vector）概念 把目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞，使之傳代、擴(kuò)增、表達(dá)的工具。特點(diǎn) 自我復(fù)制 遺傳標(biāo)記 插入位點(diǎn)種類 質(zhì)粒 噬菌體 病毒質(zhì)粒質(zhì)粒（plasmid）概念 存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。結(jié)構(gòu)

3、l 起動(dòng)區(qū)（復(fù)制原點(diǎn)Ori）l 標(biāo)記位點(diǎn) 抗抗生素標(biāo)記（抗氨芐青霉素ampr、抗四環(huán)素terr） 半乳糖苷酶 片段l 基因發(fā)動(dòng)子（乳糖操縱子等）l轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)l 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn) 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶（restriction endonuclease)概念 識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。分類 三類 重組技術(shù)中常用一類識(shí)別位點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)即核苷酸結(jié)構(gòu)呈二元旋轉(zhuǎn)對稱。切口類型 平端 AGCT- Alu - AG CT- -TGCA- -TC GA- 粘端 - GAATT C- EcoR1 -G AATTC- -C TTAAG- -CTTAA G-DNADN

4、A連結(jié)酶連結(jié)酶（DNA ligase）概念 連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈的5-P末端，生成磷酸二酯鍵而形成完整的DNA鏈種類 l T4噬菌體DNA連結(jié)酶lT4噬菌體RNA連結(jié)酶l大腸E.coliDNA連結(jié)酶作用l連接粘端l連接平端目的基因目的基因（target gene）概念 需要研究的基因叫目的基因。來源l基因文庫 存在于轉(zhuǎn)化菌內(nèi)、由克隆載體所帶的所有基因組DNA的集合。l化學(xué)合成法 用DNA合成儀利用化學(xué)原理合成該核苷酸序列。lcDNA 以mRNA為模板， 利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補(bǔ)的DNA。l聚合酶鏈反應(yīng) 在體外利用酶促反應(yīng)獲得特異序列的基因組DNA。核酸的分離與純化核酸的

5、分離與純化（the separation and purification of nucleic acid）細(xì)胞的溶解 因標(biāo)本而異 用SDS、Triton x-100 、 超聲破碎等核酸的分離 苯酚使蛋白質(zhì)變性沉淀于有機(jī)相，而核酸保留在水相，將核酸分離核酸的提取 冷乙醇或異丙醇沉淀核酸，離心回收核酸去除雜質(zhì) 70%的乙醇洗滌沉淀，除去處多余的鹽類核酸探針的標(biāo)記核酸探針的標(biāo)記（the labelling probe of nucleic acid）概念 對已知堿基序列的單鏈核酸用示蹤物進(jìn)行標(biāo)記得到核酸探針示蹤物分類 l放射性核素類 優(yōu)點(diǎn) ： 靈敏度高、特異性高、不影響酶促反應(yīng)。缺點(diǎn)：污染環(huán)境、損

6、害人體。l非放射性核素類 抗原抗體免疫標(biāo)記物地高辛、親和配體標(biāo)記物生物素、熒光標(biāo)記物lFITC、電子密度標(biāo)記物膠體金等。標(biāo)記方法 缺口平移法 隨機(jī)引物法 末端標(biāo)記法缺口平移標(biāo)記法缺口平移標(biāo)記法（The label method of nick level moving）概念 由Dnase 在DNA雙鏈上切出隨機(jī)切口，DNA聚合酶沿缺口水解5端核苷酸和3端修復(fù)加入被標(biāo)記核苷酸同時(shí)進(jìn)行，切口平行推移，可均一標(biāo)記DNA鏈，合成與模板互補(bǔ)的新鏈。優(yōu)點(diǎn) 快速、簡便、成本相對低、比活性較高、標(biāo)記均一，大分子標(biāo)記效果好（1000bp）。缺點(diǎn) 單鏈DNA、RNA、200bp不能用該法標(biāo)記。隨機(jī)引物標(biāo)記法隨機(jī)引

7、物標(biāo)記法(The label method of random primer)概念 采用6個(gè)核苷酸的隨機(jī)引物 與模板DNA結(jié)合的原理將標(biāo)記物摻入到新合成的DNA片段中去，完成探針標(biāo)記反應(yīng)。l隨機(jī)引物 是指有各種可能排列組合順序的混合物，能與任何核酸序列退火雜交，并為DNA聚合酶的反應(yīng)起到引物作用。方法 將雙鏈DNA變性為單鏈，與隨機(jī)引物退火雜交，在含有dNTP底物的示蹤物的存在下，由Klenow片段催化下，從引物3末端開始按5-3方向合成新的互補(bǔ)DNA鏈，即標(biāo)記的DNA探針。優(yōu)點(diǎn) 具有缺口平移標(biāo)記法的優(yōu)點(diǎn)，而且能標(biāo)記任何長度的DNA及RNA。末端標(biāo)記法末端標(biāo)記法（The end- labell

8、ing method ）概念 用核酸修飾酶對核酸片段的5或3末端進(jìn)行部分標(biāo)記，不對全長標(biāo)記。分類 lKlenow片段末端標(biāo)記法 在有標(biāo)記的dNTP存在下， Klenow片段可以填充雙鏈DNA凹陷的3末端，獲得標(biāo)記的DNA探針。lT4DNA聚合酶置換合成標(biāo)記法 利用T4DNA聚合酶的3-5核酸外切酶和5-3核酸內(nèi)切酶的作用，使3末端凹陷，加入有標(biāo)記的dNTP，獲得標(biāo)記的DNA探針，用于末端為3突出粘端和平端的情況。lT4多聚核苷酸激酶標(biāo)記法 T4多聚核苷酸激酶可將-32PATP的- 32P轉(zhuǎn)移到DNA游離的5-OH上，還可催化- 32P與5末端的磷酸基團(tuán)交換，因此無論是否5末端去磷酸均可用此法標(biāo)

9、記。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)核酸擴(kuò)增技術(shù)核酸雜交技術(shù)多態(tài)性的分析核酸序列分析DNA重組技術(shù)雜交核酸技術(shù)雜交核酸技術(shù)（The hybridization technique of nucleic acid） 核酸分子雜交 在DNA復(fù)性過程中，如果把不同的DNA單鏈分子或者把DNA與RNA放在一起，只要存在堿基配對關(guān)系，就可以在不同分子間形成雜化雙鏈，這種分子現(xiàn)象為核酸分子雜交 核酸雜交技術(shù) 利用核酸堿基嚴(yán)格配對的特異性，核酸標(biāo)記物的靈敏度而建立的檢測核酸結(jié)構(gòu)與功能的方法。分類l斑點(diǎn)雜交 用于基因組 DNA或RNA的分析lSouthern blot 用于基因組 DNA的分析lN

10、orthern blot 用于以知mRNA表達(dá)水平的分析l原位雜交 細(xì)胞內(nèi)雜交，用于DNA或RNA的分析Southern blotSouthern blot（1 1）概念 用轉(zhuǎn)膜法進(jìn)行DNA雜交分析步驟l提取消化 提取基因組DNA并將其經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化成片段l電泳 將DNA片段在瓊脂糖凝膠中電泳變性使其成為單鏈l轉(zhuǎn)膜 將硝酸纖維素（nitrocellulose,NC）膜放在膠上，上面放吸水紙，利用毛細(xì)作用使膠中DNA片段轉(zhuǎn)移到NC膜上l雜交 此雜交膜在雜交 液中與探針雜交l顯影 用放射自顯影顯示出雜交分子帶Southern blot （2） 重物重物吸水紙吸水紙濾紙凝膠緩沖液Northern

11、 blotNorthern blot概念 用轉(zhuǎn)膜法進(jìn)行RNA雜交分析步驟l提取 總RNA的提取l電泳 將RNA片段在瓊脂糖凝膠中電泳變性，防止發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)形成l轉(zhuǎn)膜 NC膜放在膠上，上面放吸水紙，利用毛細(xì)作用使膠中RNA片段轉(zhuǎn)移到NC膜上l雜交 此雜交膜在雜交 液中與DNA探針雜交l顯影 用放射自顯影顯示出雜交分子帶l注意 所用試劑均用0.1% DEPC水配制l注意 所有器具均需高溫處理斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交（dot hybridization technique ）概念 核酸與探針直接在NC膜上雜交的方法步驟l提取 提取DNA或RNA樣品l點(diǎn)樣 樣品點(diǎn)在NC膜上， 烘烤使其固定在膜上l雜交 將膜、探

12、針、雜交液封入雜交袋中，雜交l顯影 用放射自顯影顯示出雜交分子點(diǎn)原位雜交原位雜交（in situ hybridization）概念 保持細(xì)胞形態(tài)，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行核酸雜交步驟l固定標(biāo)本 涂片或組織切片置微波爐中照射，固定標(biāo)本 l雜交 將探針（常用生物素標(biāo)記法）復(fù)蓋在標(biāo)本上，加入雜交液，雜交l顯色 載玻片放入緩沖液中，加入底物，顯色。l攝影 顯微鏡下觀察結(jié)果，攝影核酸雜交技術(shù)與基因診斷核酸雜交技術(shù)與基因診斷（ The hybridization technique of nucleic acid and diagnosis ）限制性內(nèi)切酶酶譜分析法l概念 利用限制性內(nèi)切酶和特異性DNA探針來檢測是否

13、存在基因突變l原理 當(dāng)待測DNA序列發(fā)生突變時(shí)會(huì)導(dǎo)致某些限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的改變，其片段的長度與數(shù)量在電泳遷移率上會(huì)隨之改變。借此做出診斷l(xiāng)應(yīng)用 檢測基因突變的位點(diǎn)與數(shù)量核酸雜交技術(shù)與基因診斷核酸雜交技術(shù)與基因診斷（ The hybridization technique of nucleic acid and diagnosis ）DNA限制性片段多態(tài)性分析（RELP）l概念 DNA多態(tài)性發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上，酶解該片段會(huì)產(chǎn)生長度不同的片段，此片段為遺傳標(biāo)志，檢測致病基因的帶者l原理 在人類基因組中，平均約200對堿基可發(fā)生一對突變（稱為中性突變），中性突變導(dǎo)致個(gè)體間的差異，叫DNA多

14、態(tài)性。在某家族中，致病基因與特異多態(tài)性緊密連鎖，此多態(tài)性為遺傳標(biāo)志l應(yīng)用 遺傳病的基因診斷核酸雜交技術(shù)與基因診斷核酸雜交技術(shù)與基因診斷（ The hybridization technique of nucleic acid and diagnosis ）等位基因特異寡核苷酸探針雜交l概念 根據(jù)已知遺傳病基因突變的核苷酸序列，人工合成寡核苷酸探針（突變與正常），分別與受檢者雜交，判斷其為突變的純合子、雜合子、新的突變類型或正常l原理 若受檢者只與突變探針雜交，則為突變純合子；若與兩種探針雜交，則為突變雜合子；若與正常探針雜交，則不存在該突變基因；若與兩者均不雜交，提示新的突變。聚合酶鏈反應(yīng)聚合

15、酶鏈反應(yīng)PCRPCR（polymerase chain reaction，PCR）概念 用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段原理 以待擴(kuò)增的DNA為模板，以一對與模板5和3末端互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引屋，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制，合成新鏈，反復(fù)重復(fù)這一過程，可使目的DNA片段得到擴(kuò)增?；静襟E l變性 95 使模板DNA完全變性為單鏈l應(yīng)退火 較Tm低5，使引物與模板DNA退火結(jié)合l延伸 72 DNA聚合酶以dNTP為底物催化DNA的合成反應(yīng)PCRPCR與基因診斷與基因診斷（PCR and gene diagnosis）目的基因的克?。０鍨閏DNA或基因組）l利用特異性

16、引物獲得已知的目的基因l利用簡并引物獲得同源性的基因片段l利用隨機(jī)引物隨機(jī)克隆基因基因的體外突變l可以隨機(jī)設(shè)計(jì)引物在體外進(jìn)行基因的嵌合、缺失、點(diǎn)突變等改造DNA的微量分析l病原微生物的微量檢測l突變基因的篩選l法醫(yī)學(xué)的鑒定lDNA序列分析PCRPCR引物的設(shè)計(jì)引物的設(shè)計(jì)（ The design of PCR primer）長度 以擴(kuò)增片段而定，一般1530個(gè)堿基，引物越長，特異性越強(qiáng)堿基 GC含量以45%55%為佳，GC應(yīng)隨機(jī)分布Tm值 Tm值應(yīng)底于延長溫度引物內(nèi)和引物間不宜形成二級結(jié)構(gòu)特異性 特異性強(qiáng)，不擴(kuò)增目的基因以外的DNAPCRPCR擴(kuò)增條件的設(shè)計(jì)擴(kuò)增條件的設(shè)計(jì)（The design

17、of PCR extension condition）退火 一般Tm5，與目的基因長度有關(guān)，目的基因短，退火溫度 可底，時(shí)間可短。退火溫度 太高，有時(shí)會(huì)得不擴(kuò)增產(chǎn)物，退火溫度 太低，容易得不到產(chǎn)物延伸 與目的基因長度有關(guān)，一般認(rèn)為DNA聚合酶的聚合速度1000bp/min.時(shí)間太短，會(huì)得不到產(chǎn)物，時(shí)間太長，會(huì)出現(xiàn)Smear.擴(kuò)增次數(shù) 擴(kuò)增次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足，擴(kuò)增次數(shù)太多，提高靈敏度，易造成非特異性擴(kuò)增，會(huì)出現(xiàn)Smear.引物 引物過多，易出現(xiàn)雙引物聚合，電泳出現(xiàn)小于100bp的帶，引物過少，擴(kuò)增量少。PCRPCR技術(shù)探討技術(shù)探討（The investigation of PCR techni

18、que） Smear 現(xiàn)象l原因原因酶量過多變性時(shí)間過短變性溫度過低dNTP量過少延伸時(shí)間過長循環(huán)次數(shù)過多模板量過多l(xiāng)建議建議0.5U遞減變性時(shí)間5秒遞增變性溫度0.5遞增50um遞增10秒遞減2個(gè)循環(huán)遞減模板量20%遞減PCRPCR技術(shù)探討技術(shù)探討（The investigation of PCR technique 非特異性擴(kuò)增l原因原因引物濃度過高引物設(shè)計(jì)不合理酶量過多循環(huán)次數(shù)過多變性溫度過低延伸時(shí)間過短模板量過多l(xiāng)建議建議0.1um遞減改變引物位置與長度0.5U遞減2個(gè)循環(huán)遞減2遞增10秒遞增酶量20%遞減單鏈構(gòu)象多態(tài)分析技術(shù)單鏈構(gòu)象多態(tài)分析技術(shù)（The analysis techni

19、que of single strand conformational polymorphism ）概念 由DNA單鏈構(gòu)象所決定遷移率的電泳技術(shù)原理 在中性聚丙烯凝膠電泳時(shí)，DNA單鏈的遷移率除與長短有關(guān)，更取決于DNA自身折疊形成的由堿基順序決定的構(gòu)象，甚至單個(gè)堿基不同，遷移率就不同，因此檢測出含有基因突變的DNA或RNA片段 特點(diǎn) 這項(xiàng)技術(shù)具有簡便、快速、敏感、和經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，適用于大樣本基因變異的篩查SSCPSSCP技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用（The application of SSCP technique）適用于大樣本基因變異的篩查用于癌基因和抗癌基因突變的檢測DNA多態(tài)性分析復(fù)等位基因的分

20、析遺傳病的致病基因分析基因制圖SSCPSSCP技術(shù)流程技術(shù)流程（The procedure of SSCP technique）總RNA的提取逆轉(zhuǎn)錄合成cDNAPCR特異擴(kuò)增目的基因目的基因變性在中性聚丙烯凝膠電泳凝膠的處理l同位素標(biāo)記的樣品放射自顯影l(fā)銀染法或溴化乙錠（EB）染色參考條件參考條件（reference condition）長度 目的基因小于400bp分離單鏈效果好，突變檢出率高溫度 溫度高，不利于分離突變DNA，最好采用恒溫4或2026交聯(lián)度 低交聯(lián)度、大孔徑的聚丙烯酰胺凝膠有利于DNA互補(bǔ)鏈的分離，對DNA構(gòu)型變化敏感，建議用12%C甘油 是核酸的弱變性劑，能部分打開DNA單

21、鏈的折疊結(jié)構(gòu)，但濃度過大，降低遷移率，建議用510%的甘油電壓 影響分析結(jié)果，建議先用低電壓，后加大電壓的條件，分辨率高，電泳時(shí)間短SSCPSSCP正常結(jié)果分析正常結(jié)果分析（The analysis of SSCP normal result）位置 DNA單鏈在電泳中的位置無法預(yù)先確定，應(yīng)設(shè)立未變性樣品對照條帶數(shù) 由于單鏈構(gòu)象的多樣性，中間狀態(tài)的存在，可以出現(xiàn)多條單鏈突變條帶 不一定在兩條單鏈都表現(xiàn)出，有時(shí)可見于一條單鏈上假陰性 用該法不能證明無突變發(fā)生，若無突變發(fā)生可以改變電泳條件假陽性 篩選出泳動(dòng)變位，不能完全排除假陽性核酸序列分析核酸序列分析(The sequence analysis

22、of nucleic acid)DNA末斷合成終止法l原理 在待測DNA的3末端人工合成引物，在DNA聚合酶的作用下，復(fù)制鏈延長，在ddNTP(2,3雙脫氧核糖核苷三磷酸)存在下，復(fù)制延長隨機(jī)受阻，形成分子量大小不等的片段。電泳分離，自顯影，讀分析堿基片段l步驟 l 標(biāo)記 將單鏈模板DNA分成4份，每一管加入32PdATP、dNTP、引物和酶，每管還加入4種ddNTP中的一種，進(jìn)行反應(yīng)l電泳 聚丙烯酰胺凝膠高壓（1600V）電泳，復(fù)制延長隨機(jī)受阻，可形成一個(gè)核苷酸的差異的大小不等的片段l顯影 電泳后干燥，對X光片進(jìn)行放射自顯影 l圖譜 自下往上讀，得到5-3的堿基序列，其互補(bǔ)鏈?zhǔn)谴郎y的DNA的

23、3-5堿基序列核酸序列分析核酸序列分析(The sequence analysis of nucleic acid)復(fù)制模板l基因工程 M13是單鏈?zhǔn)删w，轉(zhuǎn)染宿主菌復(fù)制為雙鏈增殖，又以單鏈透出菌體。把待測DNA重組插入雙鏈M13復(fù)制型DNA中，經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增，可分離得到單鏈M13DNA，即復(fù)制模板lcDNA 提取樣品總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為DNA，特異擴(kuò)增目的基因，純化，即復(fù)制模板基因工程基因工程（gene engineering）概述 基因工程又稱重組體DNA技術(shù)，是指在體外將不同來源的DNA分子進(jìn)行重新組合，并使它們在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中實(shí)現(xiàn)增殖表達(dá)的遺傳操作主要步驟l目的基因的獲取l載體的選擇與構(gòu)建l復(fù)制子的形成l轉(zhuǎn)化l篩選復(fù)制子l表達(dá)外源基因復(fù)制子復(fù)制子（replicon）概念 即重組DNA，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)與載體DNA結(jié)合成具有自我復(fù)制能力的DNA分子構(gòu)建方式 l粘性末端連接 l平端連接l同聚物加尾連接 同聚物加尾連接同聚物加尾連接（The ligation of adding- tail polymer）概念 利用同聚物序列，如多聚A與多聚T之間的退火作用完成連接。步驟 l粘性末端 在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造粘性末端l連接 在連接酶作用下