RNA干擾技術(shù)在生物醫(yī)藥發(fā)展的意義與前景

1、L/O/G/ORNA干擾技術(shù)在生物醫(yī)藥發(fā)展干擾技術(shù)在生物醫(yī)藥發(fā)展的意義與前景的意義與前景梅洛梅洛(Craig Mello)生于生于1960年，是被恐龍骨引入科學(xué)世界的。年，是被恐龍骨引入科學(xué)世界的。梅洛童年時(shí)經(jīng)常跟著父親在美國梅洛童年時(shí)經(jīng)常跟著父親在美國西部尋找化石。從那時(shí)起，他就西部尋找化石。從那時(shí)起，他就迷上了遠(yuǎn)古時(shí)代、地球歷史和人迷上了遠(yuǎn)古時(shí)代、地球歷史和人類生命的起源等問題。高中時(shí)代，類生命的起源等問題。高中時(shí)代，梅洛的興趣逐漸轉(zhuǎn)移到了基因工梅洛的興趣逐漸轉(zhuǎn)移到了基因工程方面。程方面。法爾法爾(Andrew Fire)1959年出年出生在美國加利福尼亞州，本科在生在美國加利福尼亞州，本

2、科在加利福尼亞大學(xué)伯克利分校主修加利福尼亞大學(xué)伯克利分校主修數(shù)學(xué)，僅用數(shù)學(xué)，僅用3年時(shí)間就拿到學(xué)位。年時(shí)間就拿到學(xué)位。與梅洛類似，他逐漸對(duì)涉及生命與梅洛類似，他逐漸對(duì)涉及生命奧秘的遺傳學(xué)產(chǎn)生興趣，并將其奧秘的遺傳學(xué)產(chǎn)生興趣，并將其作為自己終身的學(xué)術(shù)追求。作為自己終身的學(xué)術(shù)追求。Craig MelloAndrew Fire1.RNAi的發(fā)現(xiàn)的發(fā)現(xiàn)90年代初，美國和荷蘭的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植物實(shí)驗(yàn)組Rich Jorgensen和同事在對(duì)矮牽牛(petunias)進(jìn)行的研究，發(fā)現(xiàn)一個(gè)奇怪的現(xiàn)象：(cosuppression)野生型試驗(yàn)預(yù)測19951995年，康乃爾大學(xué)的年，康乃爾大學(xué)的Su GuoSu Gu

3、o博士博士在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲(C.elegans)(C.elegans)的的par-1par-1基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)意想不到的現(xiàn)象。了一個(gè)意想不到的現(xiàn)象。利用反義利用反義RNARNA技術(shù)特異性地阻斷上技術(shù)特異性地阻斷上述基因的表達(dá)，而同時(shí)在對(duì)照實(shí)驗(yàn)述基因的表達(dá)，而同時(shí)在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中給線蟲注射正義中給線蟲注射正義RNARNA以期觀察到以期觀察到基因表達(dá)的增強(qiáng)，但得到的結(jié)果是基因表達(dá)的增強(qiáng)，但得到的結(jié)果是二者都同樣地切斷了二者都同樣地切斷了par-1par-1基因的基因的表達(dá)途徑。這是與傳統(tǒng)上的解釋正表達(dá)途徑。這是與傳統(tǒng)上的解釋正好相反。該研究小組一直未能給這

4、好相反。該研究小組一直未能給這個(gè)意外以合理解釋。個(gè)意外以合理解釋。 1.RNAi的發(fā)現(xiàn)的發(fā)現(xiàn)1998年，fire和mello對(duì)以上實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究：1.RNAi的發(fā)現(xiàn)的發(fā)現(xiàn)正義正義RNA，反義，反義RNA對(duì)對(duì)unc-22基因的表達(dá)基因的表達(dá)表現(xiàn)輕微的干涉作用，而二者混合物卻表現(xiàn)輕微的干涉作用，而二者混合物卻引起了高效的沉默作用引起了高效的沉默作用基因沉默?；虺聊?。正義RNA、反義RNA、二者混合物C.elegans，以干涉unc-22基因的表達(dá)電泳結(jié)果顯示上述的正義和反義RNA混合物的主要成分是dsRNA。進(jìn)一步研究表明只有與靶基因mRNA有同源序列的dsRNA才具有干涉作用。l由此他們認(rèn)為，

5、Guo實(shí)驗(yàn)中令人意想不到的結(jié)果是由于對(duì)照組正義RNA中混有少量dsRNA的緣故。l于是，F(xiàn)ire和mello提出在Celegans體內(nèi)dsRNA對(duì)有其同源序列的mRNA表 達(dá)具有高效的干涉作用。并將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾。1.RNAi的發(fā)現(xiàn)的發(fā)現(xiàn)1.RNAi的發(fā)現(xiàn)的發(fā)現(xiàn) 在1999年短短的一年間,發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象廣泛存在于從植物、真菌、線蟲、昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠、猴一直到人類的幾乎所有的真核生物細(xì)胞中。2000年，又先后發(fā)現(xiàn)小鼠早期胚胎中和大腸桿菌中也存在RNA干擾現(xiàn)象。 推 測RNA干擾是自然界中生物體抵抗外源基因或病毒侵入、 抑制轉(zhuǎn)座子活性，保持基因自穩(wěn)的一種方式。 2.RNAi

6、的機(jī)制的機(jī)制 RNAi：RNA interference（RNA干擾）； dsRNA：double-stranded RNA(雙鏈RNA)，包含正義鏈和反義鏈； Dicer：RNase 家族成員，是dsRNA的特異性核酸內(nèi)切酶 siRNA：Small interfering RNA (小干擾性RNA)， RNAi的關(guān)鍵效應(yīng)分子，21-23nt大小的雙鏈RNA； RISC： RNA-induced silencing complex（ RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物），具有核酸內(nèi)切、外切以及解旋酶活性； RdRP：RNA-dependent RNA polymerases，依賴RNA的RNA聚合酶，是RN

7、Ai的調(diào)節(jié)因子，使RNAi可以在生物體內(nèi)傳遞；2.RNAi的機(jī)制的機(jī)制RISCRNAi：是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由dsRNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，也就是序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默基因沉默。2.RNAi的機(jī)制的機(jī)制2.RNAi的機(jī)制的機(jī)制轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing, TGS) 轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS)TGS是轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞核內(nèi)RNA 合成受到了阻止而導(dǎo)致基因沉默。這種類型的基因沉默，可能是因?yàn)榛蛱禺惖募谆鴮?dǎo)致；PTGS 則是指基因能夠

8、在細(xì)胞核里被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄，但在細(xì)胞質(zhì)里卻無相應(yīng)的mRNA 存在這一現(xiàn)象?；虺聊?、siRNA的形成的形成2.RNAi的機(jī)制的機(jī)制siRNAs（21-23nt）long dsRNADicer 2、siRNA介導(dǎo)的介導(dǎo)的mRNA 降解降解 3、RNAi效應(yīng)的放大效應(yīng)的放大2.RNAi的機(jī)制的機(jī)制RISC: RNA-Induced Silencing ComplexExdonucleaseHomology search activityEndonucleaseHelicase53Target mRNAOH35P形成RISC復(fù)合物，降解目的mRNACapAAAAAACapAAAAAACapAAAAAA

9、循環(huán)復(fù)制酶Dicer切割3.RNAi在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用12333在功能基因組學(xué)中的應(yīng)用在功能基因組學(xué)中的應(yīng)用在基因治療中的應(yīng)用在基因治療中的應(yīng)用在神經(jīng)性疾病中的應(yīng)用在神經(jīng)性疾病中的應(yīng)用3.RNAi在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用目的：確定特定基因的功能方法：使其功能喪失或降低應(yīng)用：利用RNAi技術(shù)證明ag-1基因與擬南芥花的發(fā)育有關(guān)（1）在功能基因組學(xué)中的應(yīng)用）在功能基因組學(xué)中的應(yīng)用AIDS（獲得性免疫缺陷綜合征）（獲得性免疫缺陷綜合征）HIV（人體免疫缺陷病毒）（人體免疫缺陷病毒）CorecepterCCR-5設(shè)計(jì)合成的設(shè)計(jì)合成的lenti病毒載體引入病毒載體引

10、入siRNA，激發(fā)，激發(fā)RNAi抑制了抑制了coreceptor-CCR5進(jìn)入人體外周淋巴細(xì)進(jìn)入人體外周淋巴細(xì)胞。由此治療胞。由此治療HIV-1病毒感染性疾病的可行性大大病毒感染性疾病的可行性大大增加。增加。（2）在基因治療中的應(yīng)用（）在基因治療中的應(yīng)用（AIDS）3.RNAi在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用Lieberman J成功地利用成功地利用RNAi技術(shù)治愈了實(shí)驗(yàn)鼠技術(shù)治愈了實(shí)驗(yàn)鼠的肝炎的肝炎HBV（乙型肝炎病毒）（乙型肝炎病毒）Fas基因基因?qū)嶒?yàn)：給實(shí)驗(yàn)鼠尾部靜脈注入實(shí)驗(yàn)：給實(shí)驗(yàn)鼠尾部靜脈注入siRNA，以，以“沉默沉默”Fas基基因因結(jié)果結(jié)果：90%肝細(xì)胞接受這種肝細(xì)胞接受

11、這種RNA分子，并且使得分子，并且使得Fas蛋白蛋白含量降低到含量降低到10%；接受治療的小鼠成活率為；接受治療的小鼠成活率為82.5%；而未；而未接受治療的小鼠有接受治療的小鼠有40%在在3d內(nèi)死亡。內(nèi)死亡。不能用于人類。不能用于人類。（2）在基因治療中的應(yīng)用（）在基因治療中的應(yīng)用（HBV）3.RNAi在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用 腫瘤 傳統(tǒng)技術(shù)：單個(gè)癌基因 RNAi：針對(duì)具有同源性的多個(gè)基因 Kras基因 抑制血管生成（2）在基因治療中的應(yīng)用（腫瘤）在基因治療中的應(yīng)用（腫瘤）3.RNAi在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用用RNAi特異性地抑制癌基因、癌相關(guān)基因或突變基因的

12、過度表達(dá)，使這類基因保持在靜默或休眠狀態(tài)，從而有望用這種新的手段治療各種惡性腫瘤。 慢性疼痛 RNAi是一種有潛力的新方法 ，通過導(dǎo)入可選擇性降解疼痛相關(guān)蛋白的siRNA，從而解除疼痛，而且作為新的基因敲除手段，可用于發(fā)現(xiàn)疼痛通路中的新基因。 2003年，有人向鞘內(nèi)注射靶向P2X3受體siRNA，有效降低了機(jī)械性痛覺過敏和觸覺超敏。 這個(gè)結(jié)果表明RNAi可作為慢性疼痛研究與治療一條新的途徑。（3）在神經(jīng)性疾病中的應(yīng)用（慢性疼痛）在神經(jīng)性疾病中的應(yīng)用（慢性疼痛）3.RNAi在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用3.RNAi在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用 阿爾茨海默病（AD） 淀粉樣前

13、體蛋白基因(App)、早老素1基因(PS1)、早老素2基因(PS2)、載脂蛋白E 4基因(apo E 4)； 通過RNAi阻斷與AD發(fā)病有關(guān)的基因，可達(dá)到防治和治療AD的目的（3）在神經(jīng)性疾病中的應(yīng)用（阿爾茨海默?。┰谏窠?jīng)性疾病中的應(yīng)用（阿爾茨海默?。┮话慵夹g(shù)路線一般技術(shù)路線4.RNAi的研究方法的研究方法4.RNAi的研究方法的研究方法siRNA序列的設(shè)計(jì)序列的設(shè)計(jì)siRNA的一般結(jié)構(gòu)：的一般結(jié)構(gòu)： 21-23nt dsRNA dTdT（UU）（UU）dTdT （1）siRNA的序列應(yīng)當(dāng)選擇靶基因的外顯子序列，而且要避免距離起始密碼和終止密碼很近的地方； （2）避免連續(xù)的3個(gè)G； （3）不要

14、針對(duì)5和3端的非編碼區(qū)； （4）GC含量最好在4555%之間；4.RNAi的研究方法的研究方法siRNA序列的設(shè)計(jì)序列的設(shè)計(jì)siRNA設(shè)計(jì)的原則：設(shè)計(jì)的原則：4.RNAi的研究方法的研究方法 序列同源性分析序列同源性分析：將siRNA序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列 / EST同源的序列。 陰性對(duì)照陰性對(duì)照：通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒有同源性。siRNA序列的設(shè)計(jì)序列的設(shè)計(jì)4.RNAi的研究方法的研究方法l以核苷酸單體為原料，通過化學(xué)方法合成兩條互補(bǔ)的長約 2123 nt的RNA單鏈，然后退火形成

15、雙鏈復(fù)合體，這種方法所獲得的產(chǎn)物純度、干擾效率高，合成簡單，但是制備周期長，作用時(shí)間短，而且價(jià)格昂貴，限制了其應(yīng)用和推廣。l是最貴的方法，但是卻是最方便的。l許多公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點(diǎn)包括價(jià)格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。l最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究；l不適用于：篩選siRNA等長時(shí)間的研究。化學(xué)合成化學(xué)合成siRNA4.RNAi的研究方法的研究方法體外轉(zhuǎn)錄合成體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAT7聚合酶和目標(biāo)序列正反兩條鏈聚合酶和目標(biāo)序列正反兩條鏈退火退火DNA雙鏈雙鏈正、反兩條正、反兩條RNA鏈鏈轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄雜交

16、后用雜交后用RNA酶消化酶消化siRNA4.RNAi的研究方法的研究方法 siRNA表達(dá)載體在細(xì)胞中表達(dá)表達(dá)載體在細(xì)胞中表達(dá)siRNAs 以以PCR制備的制備的siRNA表達(dá)框進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)框進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)錄體內(nèi)轉(zhuǎn)錄合成體內(nèi)轉(zhuǎn)錄合成siRNAsiRNA表達(dá)載體表達(dá)載體BD Clontech公司推出的RNAi-Ready pSIREN 載體選用RNA聚合酶III家族的啟動(dòng)子，可在其下游插入一小段編碼發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA的DNA模板構(gòu)建成表達(dá)載體。siRNA表達(dá)框架表達(dá)框架(siRNA expresion casetes，SECs)是一種由是一種由PCR得得到的到的siRNA表達(dá)模板，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無需事前克隆到表達(dá)模板，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無需事前克隆到載體中。載體中。 siRNA表達(dá)框表達(dá)框表達(dá)框架包括：表達(dá)框架包括：一個(gè)RNA pol III啟動(dòng)子一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA一個(gè)RNA pol III終止位點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：SECs不需要載體克隆、測序等頗不需要載體克隆、測序等頗為費(fèi)時(shí)的步驟，可以直接由為費(fèi)時(shí)的步驟，可以直接由PCR得到。得到。SECs成為篩選成為篩選siRNA最有效工具。最有效工