遺傳病的診斷

1、會計學1遺傳病的診斷遺傳病的診斷 第一節(jié) 現(xiàn)癥患者診斷 (symptomatic diagnosis) 一、常規(guī)臨床診斷1. 病史的收集一般病史：患者的一般發(fā)病情況。家族史:本病在家族中的發(fā)病情況?；橐鍪罚河袩o近親結婚等。生育史:生育年齡，子女健康狀況；有無流產(chǎn)、 死產(chǎn)、早產(chǎn)；有無藥物接觸史、放射線 接觸史等。 2.癥狀和體征的了解 遺傳病的癥狀和體征有和其它疾病的共同性，亦有遺傳病本身的特殊性。 除注意遺傳病的特異性征候群，還應注意身體發(fā)育，智力發(fā)育，性器官發(fā)育情況。 3.臨床輔助檢查 包括實驗室檢查、X線、超聲、心電圖、腦電圖、CT等。 二、 系譜分析 pedigree analysis

2、系譜分析往往是由先證者的癥狀、體征、實驗室檢查和其它輔助檢查作出疾病的診斷后，追溯到家系中其他成員，寫出系譜圖。 在繪制系譜過程中要注意：1.系統(tǒng)、完整 *系譜成員應調(diào)查三代以上，（包括死者） *凡有近親婚配、死胎、流產(chǎn)和嬰兒死亡等，也須詢問清楚，記錄在系譜中。2.去偽存真 注意區(qū)別病人和家屬所提供信息的真?zhèn)巍?對系譜的分析要注意區(qū)別：1.孟德爾遺傳病 包括AD遺傳病、AR遺傳病、XD遺傳病、XR遺傳病、YL疾病等。 系譜分析對這類疾病的分析非常有用，分析時要考慮到某些疾病的遺傳異質(zhì)性、不規(guī)則外顯、外顯不全和延遲顯性等情況，可能會造成一些臨床假象，由于遺傳的異質(zhì)性可能將不同的遺傳病誤認為同一種

3、遺傳病進行分析。 2.非孟德爾遺傳病線粒體遺傳病 ： 線粒體基因突變所致的遺傳病只通過母系遺傳，女性患者的子女都可能患病。線粒體遺傳病表現(xiàn)為晚發(fā)、進行性。多基因?。?其家族性聚集性可能類似于孟德爾遺傳，但不嚴格遵循孟德爾分離規(guī)律。3.具有特殊遺傳學現(xiàn)象的疾病基因組印記 來自雙親的等位基因和染色體區(qū)域的表達不是等同的，這些等位基因在傳遞上符合孟德爾規(guī)律，但在表達方面受傳遞的雙親性別影響,因而產(chǎn)生母源印記或父源印記時，在系譜分析中要加以注意。動態(tài)突變 在孟德爾遺傳疾病中，突變后的基因在世代傳遞中穩(wěn)定存在，但在三核苷酸重復序列擴展所致的遺傳病中，處于突變狀態(tài)的基因在世代傳遞中表現(xiàn)為不穩(wěn)定，其重復單元

4、的數(shù)目發(fā)生改變。（一）染色體檢查 又稱核型分析（karyotape analysis)，即通過血液或組織培養(yǎng)制備染色體標本，進而顯帶、顯微攝影，分組排列對比分析。 是確診染色體病的主要方法。隨著顯帶技術的應用以及高分辯率染色體顯帶技術的出現(xiàn)和改進，能更準確地判斷和發(fā)現(xiàn)更多的染色體數(shù)目和結構異常綜合征，還可以發(fā)現(xiàn)新的微畸變綜合征。三、細胞遺傳學檢查1.標本來源： 現(xiàn)癥病人外周血和身體的各種組織2.染色體檢查適應癥：智能低下、生長遲緩或伴有其他先天畸形者。夫婦中有染色體異常，如平衡結構重排、嵌合體等。家族中已發(fā)現(xiàn)染色體異?；蛳忍旎蝹€體。多發(fā)性流產(chǎn)的婦女及其丈夫。原發(fā)閉經(jīng)和男女不育癥者。35歲以上

5、的高齡孕婦。有兩性內(nèi)外生殖器畸形者。（二）性染色質(zhì)檢查利用發(fā)根鞘細胞，皮膚或口腔上皮細胞，絨毛和羊水細胞檢查X染色質(zhì)或Y染色質(zhì)。用于兩性畸形或性染色體數(shù)目異常疾病的診斷。 優(yōu)點是方法簡單，有一定價值，但確認仍需依靠染色體檢查。 1.X染色質(zhì)檢查 用于由于X染色體數(shù)目異常而引起的性染色體畸變綜合征檢測。 如：Turner綜合征 X染色質(zhì)為陰性。 Klinefelter綜合征 X染色質(zhì)為陽性。2個X染色質(zhì)（三）染色體原位雜交 應用標記的特異性DNA探針與玻片上的細胞中期染色體或間期核的DNA或RNA雜交，在這些核酸不改變其結構和分布格局的情況下，研究核酸片段的位置、相互關系，因此稱為原位雜交。 熒

6、光原位雜交（FISH）： 用生物素、地高辛配基等標記物標記的DNA探針進行原位雜交后，用熒光標記的生物素親和蛋白和抗親和蛋白的抗體進行免疫檢測和放大，使探針雜交的區(qū)域發(fā)出熒光，這種原位雜交稱為熒光原位雜交?？赏瓿煞钦扼w的檢測。 3個雜交信號,經(jīng)選擇性人工流產(chǎn)后確診為Down綜合征患兒。 四、生物化學檢查 單基因遺傳病往往是由于基因突變導致酶和蛋白質(zhì)的改變或缺如，使一些器官的發(fā)育和正常的代謝發(fā)生改變，并在臨床上表現(xiàn)出一系列癥狀。 因此，酶和蛋白質(zhì)的定性和定量分析可反映基因結構的改變，是診斷單基因病的主要方法之一，由于主要采用生化手段故稱之為生物化學檢查。 五、 基因診斷 gene diagno

7、sis 采用分子生物學方法在DNA水平或RNA水平對某一基因進行分析，從而對特定的疾病進行診斷。 基因診斷特點: 針對直接病因診斷。 特異性強,靈敏度高。適應性強,診斷范圍廣,因基因探針可為任何來 源、任何種類,其探針序列可為未知或已知,待 檢測的目的基因可為一個特定基因或基因組合。目的基因是否處于活化狀態(tài)均可,無組織和發(fā) 育特異性,因此可用于檢測一些具有組織表達 特異性和分化階段表達特異性的基因。（一）基因診斷的基本技術 * 分子雜交技術 * 聚合酶鏈式反應(PCR)技術 * DNA序列測定技術 * 基因芯片技術 分子雜交技術 molecular hybridization 原理：雙鏈DNA

8、在加熱到一定溫度以上或在堿性溶液中會變性成為兩條單鏈，互補的兩條DNA單鏈在一定條件下結合成為雙鏈。即能夠進行雜交。這種結合是特異的，即嚴格按照堿基互補的原則進行，它不僅能在DNA和DNA之間進行，也能在DNA和RNA之間進行。 因此 ，當一段已知基因的核酸序列作為探針，與變性后的單鏈DNA接觸時，如果兩者的堿基完全配對，它們即互補地結合成雙鏈，從而表明被測基因組DNA中含有已知的基因序列。 基因探針（Probe）： 是一段帶有標記的，與待測基因有關的核酸序列。探針種類: 基因組探針（genomic probe） cDNA探針（cDNA probe） 寡核苷酸探針（oligonucleotid

9、e probe） 2.斑點雜交法 又稱等位基因特異的寡核苷酸(ASO)探針雜交。 用人工合成的20個堿基左右長度的ASO探針，一般要合成兩種探針：正常探針，突變探針。 將待測的細胞或DNA直接點在硝酸纖維膜或尼龍膜上，將標記有同位素（或其他標記）的變性探針與其進行雜交，通過放射自顯影，判斷受檢基因的有無以及基因的拷貝數(shù)，進行基因診斷。 聚合酶鏈反應 polymerase chain reaction，PCR 聚合酶鏈反應技術是在體外迅速的選擇擴增特定的靶DNA的方法。又稱體外DNA克隆技術。PCR的原理：（1）按靶DNA片段的5和3端的堿基順序各合成兩條引物（長約20個堿基的寡核苷酸）；（2）

10、將待測DNA變性后，加入四種單核苷酸（dNTP），引物和耐熱DNA聚合酶（Taq 酶）；（3）反應液進行熱循環(huán)，每一周期經(jīng)過變性（92-95），復性（40-60）和延伸（65-72）三個階段產(chǎn)生倍增的DNA。一般進行20-40個周期。PCR相關技術及應用： 多重PCR RT-PCR Amp-FLP PCR-ASO PCR-SSCP 定量PCR PCR-DGGE1 2 3 4 5a b1：正常人 2,4,5：純合體患者 3：雜合體(2的弟弟)左為泳動變位模式：a 正常人；b 純合體患者PCR-SSCPGAAGAGTGTTATCTCCAC DNA測序技術(DNA sequenceing Maxan

11、和Gilbert首先建立了化學方法，Sanger建立了DNA測序的酶學方法。 最新的DNA自動測序法以不同熒光色素標記的四種不同脫氧核苷酸為原料進行酶促合成反應，經(jīng)過凝膠電泳分離，應用激光分析及計算機處理就能直接讀出堿基順序。極大地推進了生命科學的發(fā)展和人類基因組計劃的進程，而且測序的長度可以達到1000bp以上。 DNA測序（DNA Sequencing)是檢測未知突變和已知突變基因的最基本和最重要的實驗手段?；蛐酒夹g 基因芯片技術是近年來發(fā)展十分迅速的大規(guī)模、高通量分子檢測技術。其基本原理是核酸雜交，其基本過程是將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，形

12、成矩陣點?，F(xiàn)在的技術可以做到在1cm2上排列成千上萬個“點”。 樣品DNA/RNA通過PCR擴增、體外轉錄等技術摻入熒光標記分子，然后按堿基配對原理進行雜交，再通過熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，并配以計算機系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號做出比較和檢測，得出所要的信息。 （二）基因診斷的途經(jīng)1.直接診斷 檢測突變基因 直接診斷是直接檢測致病突變的基因。它通常使用基因本身或緊鄰的DNA序列作為探針，或通過PCR擴增產(chǎn)物，以探查基因無突變、缺失等異常及其性質(zhì)，這稱為直接基因診斷，它適用已知基因異常的疾病。2. 間接診斷 基因連鎖分析 當致病基因雖然已知但其異常尚屬未知或突變類型較多時；或致病基因本身尚屬

13、未知時，但被檢測基因有緊密連鎖的DNA多態(tài)標記，可以通過對受檢者及其家系進行連鎖分析，以推斷前者是否獲得了帶有致病基因的染色體。 （三）基因診斷的方法選擇： 各種遺傳病的基因異常是不同的，同一遺傳病也可以有不同的基因異常，但這些異常大體可分為基因缺失和突變兩大類型。根據(jù)對基因異常類型的了解，可以采用不同的診斷方法。 遺傳的基因診斷方法基因異常 方法 探針、引物或限制酶基因缺失 基因組DNA印跡雜交PCR擴增 缺失基因的探針 引物包括缺失或在缺失部位內(nèi)點突變 RFLP分析ASO雜交 突變導致其切點消失的限制酶 PCR產(chǎn)物的多態(tài)性分析 正常和異常的ASO探針 （RFLP、SSCP、DGGE） 引物

14、包括突變部位基因已知 基因內(nèi)或旁側序列多態(tài)性 基因內(nèi)或旁但異常不明 （RFLP、 SSCP、AMPFLP） 側序列探針或引物 連鎖分析 基因未知 與疾病連鎖的多態(tài)性， 與疾病連鎖的多態(tài) 如SSCP、AMPFLP連鎖分析， 位點探針或引物 RFLP位點單體型連鎖分析（四）基因診斷在遺傳病診斷中的應用1 對單基因病的基因診斷（1）點突變型遺傳病的基因診斷鐮形細胞性貧血的基因診斷 Normal probeMutation probe無過氧化氫酶血癥（acatalasemia) 是一種常染色體隱性遺傳病，患者過氧化氫酶活性只有正常人的0.2%0.4%，雜合體血液中過氧化氫酶活性則處于中間水平。過氧化氫

15、酶基因由13個外顯子和12個內(nèi)含子組成。應用32P標記PCR反應中底物方法，擴增第4個外顯子和內(nèi)含子附近的203bp片段，應用SSCP法可清楚地判斷患者和雜合體。 aa/aa aa/- aa/a- a-/- -/-14kb10kb10kb 4kbBamH IBamH I左側：16號染色體上攜有數(shù)目不同的基因右側：a基因探針雜交的結果 -地貧基因缺失的診斷正常貧血癥狀攜帶者HbH（2）基因缺失型遺傳病的診斷DMDBMD的缺失型診斷：（3）基因異常不明的遺傳病的診斷 以苯丙酮尿癥( PKU )的基因診斷為例。RFLP分析： 一個PKU家系的RFLP單體型分析 PKU，AR1 21 2 35.6 K

16、b5.2 Kb4.2 Kb4.0 KbHind Sph11.0 Kb 9.7 Kb 7.0 KbPKU家系PAH基因STR連鎖分析 2多基因遺傳病的基因診斷 人類基因組多態(tài)性是多基因病基因診斷的基礎，易感基因多態(tài)性的檢測能幫助我們理解多基因病發(fā)生的機制，有助于對疾病的診斷和分類。 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些多基因病相關基因，如載脂蛋白E基因（ApoE）的多態(tài)性與阿爾茨海默?。ˋD）有高度相關性，血管緊張肽轉換酶基因的多態(tài)性與原發(fā)性高血壓和心肌梗死高度相關。3 對腫瘤的基因診斷ras基因突變的檢測 ras基因突變的檢測可采用PCR-ASO方法進行，已知ras基因突變的熱點在12、13及61密碼子。 p53

17、基因的檢測 目前常用PCR法進行檢測p53突變的熱點是外顯子5-8，一般可先選用外顯子5-8的引物進行擴增，其后再進行突變位點的詳盡分析，甚至測序。另一初步檢測p53基因突變的方法為PCR-SSCP，然后測序。 （五）疾病基因診斷的展望未來的基因診斷主要發(fā)展方向 *胚胎著床前診斷在囊胚8個細胞期，通過對其中一個細胞的染色體核型分折和原位雜交，從而將人類的遺傳缺陷控制在最早期階段； *母體外周血中胎兒細胞分析技術； *對常見病、多發(fā)病如心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病、精神疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、哮喘、近視眼等進行分子診斷。第二節(jié) 癥狀前診斷（pre-symptomatic diagnosis） 指

18、在遺傳病的臨床癥狀出現(xiàn)前所作的診斷。 是針對一些常染色體顯性(AD)遺傳病的雜合子個體的一種診斷方法。這些個體往往發(fā)病年齡延遲，如果能在雜合子個體生育之前或出現(xiàn)癥狀之前就作出診斷，可以避免他將致病基因傳遞給后代，減少遺傳病的發(fā)病率。 常染色體顯性雜合子個體的癥狀前診斷方法有三種：1家系分析法和風險估計 2生化學檢查3基因分析 新生兒篩查（neonatal screening）也是一種癥狀前的診斷。是對已出生的新生兒進行某些遺傳病的診斷，是出生后預防和治療某些遺傳病的有效方法。 第三節(jié) 產(chǎn)前診斷（prenatal diagnosis） 產(chǎn)前診斷又稱宮內(nèi)診斷（intrauterine diagno

19、sis）是對胚胎或胎兒在出生前是否患有某種遺傳病或先天畸形作出準確的診斷。 一、產(chǎn)前診斷的適應征135歲以上的高齡孕婦或夫婦一方有明顯致畸因素接 觸史；2夫婦之一有染色體數(shù)目或結構異常者；或曾生育過 染色體病患兒的孕婦；3已知或推測孕婦是AR或XR攜帶者；曾生育過某種單 基因遺傳病患兒的孕婦；4曾生育過先天畸形（尤其是神經(jīng)管畸形）的孕婦；5有原因不明的自然流產(chǎn)，畸胎，死產(chǎn)及新生兒死亡 的孕婦。二、產(chǎn)前診斷的方法儀器診斷 包括：X線檢查 超聲波檢查 胎兒鏡檢查細胞學方法（染色體檢查；染色質(zhì)檢查） 生化學方法（蛋白質(zhì)或酶檢查；代謝產(chǎn)物檢查） 分子生物學方法（基因分析）三、產(chǎn)前診斷的標本及采集技術可

20、用于檢測的標本： 羊水上清液、羊水細胞 絨毛 臍帶血、孕婦外周血中胎兒細胞 孕婦血清和尿液 受精卵、胚胎組織 羊膜穿刺術（amniocentesis） 羊膜穿刺術一般在妊娠1618周時進行。因為此時羊水量多、胎兒浮動，穿刺時容易進針，且不易傷及胎兒。取材最好是在B超監(jiān)視下進行。絨毛吸取術chorionic villi aspiration sampling, CVS 絨毛吸取術一般可在妊娠早期79周時進行。取樣最好在B超監(jiān)視下進行。臍帶穿刺術（cordocentesis） 臍帶穿刺術可在B超監(jiān)視下進行。用一細針經(jīng)孕婦腹壁進入胎兒的臍帶，抽取胎兒臍靜脈血。 一般在孕中期（妊娠18周）進行。 孕婦

21、外周血分離胎兒細胞分離 孕婦外周血分離胎兒細胞是一項非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷技術，并易于被孕婦接受。孕婦外周血中的胎兒細胞至少有3種，即滋養(yǎng)葉細胞、有核紅細胞和淋巴細胞。 目前許多學者都致力于解決胎兒細胞的識別、富集和如何排除母血的“污染”等。此方法將以簡便、經(jīng)濟的特點在遺傳病的預防中發(fā)揮作用。植入前診斷（preimplantation diagnosis） 植入前診斷是利用微操作技術和DNA擴增技術對胚泡植入前進行檢測。 植入前遺傳學診斷 （preimplantation genetic diagnosis,PSD） 是指用分子或細胞遺傳學技術對體外受精的胚胎進行遺傳學診斷，確定正常后再將胚胎植入子宮。 獲得植入前胚胎的主要方法： 子宮沖洗 體外授精 植入前診斷的基本技術：胚胎組織微活檢： 目前多采用在68個細胞期，通過顯微操作技術取出12個細胞進行染色體或基因的檢查。PCR技術： 單細胞PCR技術主要用于單基因