薄板層析法鑒定四環(huán)素純PPT課件

1、生物分離工程實(shí)驗(yàn)生物分離工程實(shí)驗(yàn)I 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：第第11/12周周薄板層析法鑒定四環(huán)素成品純度薄板層析法鑒定四環(huán)素成品純度第第14周周PEG400/(NH4)2SO4兩水兩水相系統(tǒng)相圖的制作相系統(tǒng)相圖的制作第第15周周兩水相系統(tǒng)中蛋白質(zhì)分配系數(shù)的測(cè)定兩水相系統(tǒng)中蛋白質(zhì)分配系數(shù)的測(cè)定第第16周周離子交換樹脂總交換容量的測(cè)定離子交換樹脂總交換容量的測(cè)定第1頁/共23頁實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及時(shí)間實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及時(shí)間u薄板層析法鑒定四環(huán)素純度薄板層析法鑒定四環(huán)素純度 實(shí)驗(yàn)一班：第11周 周一，周四 實(shí)驗(yàn)二班：第12周 周一，周四u兩水相萃取相圖制作兩水相萃取相圖制作 實(shí)驗(yàn)一班：第14周 周一 實(shí)驗(yàn)二班：第14周

2、 周四u兩水相萃取蛋白質(zhì)分配系數(shù)測(cè)定兩水相萃取蛋白質(zhì)分配系數(shù)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)一班：第15周 周一 實(shí)驗(yàn)二班：第15周 周四u離子交換樹脂總交換容量的測(cè)定離子交換樹脂總交換容量的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)一班：第16周 周一 實(shí)驗(yàn)二班：第16周 周四第2頁/共23頁實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排表實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排表周次日期星期時(shí)間發(fā)酵實(shí)驗(yàn)5-212分離實(shí)驗(yàn)5-112115月6日星期一13:30實(shí)驗(yàn)一班5月9日星期四13:30實(shí)驗(yàn)一班125月13日星期一13:30實(shí)驗(yàn)二班5月16日星期四13:30實(shí)驗(yàn)二班135月20日星期一13:30實(shí)驗(yàn)二班5月23日星期四13:30實(shí)驗(yàn)一班145月27日星期一13:30實(shí)驗(yàn)二班實(shí)驗(yàn)一班5月30日星期四13

3、:30實(shí)驗(yàn)一班實(shí)驗(yàn)二班156月3日星期一13:30實(shí)驗(yàn)二班實(shí)驗(yàn)一班6月6日星期四13:30實(shí)驗(yàn)一班實(shí)驗(yàn)二班166月8日星期六13:30實(shí)驗(yàn)二班實(shí)驗(yàn)一班6月13日星期四13:30實(shí)驗(yàn)一班實(shí)驗(yàn)二班176月17日星期一13:30實(shí)驗(yàn)二班6月20日星期四13:30實(shí)驗(yàn)一班第3頁/共23頁考核方式考核方式 考勤考勤提問和操作提問和操作實(shí)驗(yàn)報(bào)告：實(shí)驗(yàn)報(bào)告：預(yù)習(xí)報(bào)告預(yù)習(xí)報(bào)告 實(shí)驗(yàn)結(jié)果、討論、思考題實(shí)驗(yàn)結(jié)果、討論、思考題第4頁/共23頁第5頁/共23頁u 加深對(duì)薄板層析法基本原理的理解。u 熟悉薄板層析法的操作過程。u 采用薄板層析法來考察四環(huán)素制品純度。一、目的和要求一、目的和要求第6頁/共23頁（一）層析

4、：色譜 chromatographyu 一種分離技術(shù)。u 任何層析都具有兩個(gè)相，固定相固定不動(dòng)，流動(dòng)相對(duì)固定相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)。u 不同物質(zhì)在兩相間分配差異，隨流動(dòng)相以不同的速度沿固定相移動(dòng)，最終達(dá)到分離的效果。 固定相：固體或液體( (固定在載體上) ) 流動(dòng)相：流過固定相的液體、氣體或超臨界流體。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理第7頁/共23頁（二）層析方法：根據(jù)機(jī)理可以分為： 分配層析 吸附層析 凝膠層析 離子交換層析 親和層析二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)層析的方式：紙層析薄層層析柱層析第8頁/共23頁（三）薄板層析（TLC）u利用不同溶質(zhì)組分在固定相和流動(dòng)相的利用不同溶質(zhì)組分在固定相和流動(dòng)相的兩種液

5、體兩種液體中中分配系數(shù)不同，展層時(shí)形成以不同速度移動(dòng)的區(qū)帶，分配系數(shù)不同，展層時(shí)形成以不同速度移動(dòng)的區(qū)帶，達(dá)到分離。達(dá)到分離。 溶質(zhì)易分配在固定相中溶質(zhì)易分配在固定相中 溶質(zhì)易分配在流動(dòng)相中溶質(zhì)易分配在流動(dòng)相中 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理移動(dòng)速度慢。移動(dòng)速度慢。移動(dòng)速度快。移動(dòng)速度快。第9頁/共23頁 利用阻滯因子Rf值來表征各組分的差別移動(dòng)：0 Rf 1,適宜范圍0.20.8二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 溶質(zhì)移動(dòng)距離 同一時(shí)間流動(dòng)相移動(dòng)距離Rf=第10頁/共23頁二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理固定相：一般為水及各種水溶液、甲酰胺、低級(jí)醇等。流動(dòng)相（展層劑）：與水不溶（或微溶）的有機(jī)溶劑。 薄板層析法：支

6、持物:中性、多孔粉末、無吸附活性、流動(dòng)相自由通過 硅藻土/纖維素/硅膠/氧化鋁等，親水物質(zhì)能儲(chǔ)留水。第11頁/共23頁（四）四環(huán)素 廣譜抗生素廣譜抗生素 四環(huán)素發(fā)酵或保管不當(dāng)時(shí)，生成抗菌作用弱，毒性強(qiáng)的四環(huán)素發(fā)酵或保管不當(dāng)時(shí)，生成抗菌作用弱，毒性強(qiáng)的差向四環(huán)素。差向四環(huán)素。 四環(huán)素易溶于流動(dòng)相液體，差向四環(huán)素易溶于固定相液四環(huán)素易溶于流動(dòng)相液體，差向四環(huán)素易溶于固定相液體。體。 氫化駢四苯環(huán)氫化駢四苯環(huán) （含共軛雙鍵，可紫外吸收，熒光（含共軛雙鍵，可紫外吸收，熒光） 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理第12頁/共23頁本實(shí)驗(yàn)所需儀器 玻璃板 研缽 天平 移液管 硅藻土 EDTA緩沖液 飽和氯化銨缸+架子

7、u展層劑u展層缸u(yù)點(diǎn)樣毛細(xì)管u小刀和直尺u紫外燈u氨水三、主要實(shí)驗(yàn)器材與試劑三、主要實(shí)驗(yàn)器材與試劑第13頁/共23頁（一）溶液配制（已配置）1. 硅藻土處理： 取薄板層析用硅藻土50g，加25ml濃鹽酸和250ml水，攪拌煮沸10min，冷卻，過濾，用蒸餾水洗，直至洗液對(duì)剛果紅指示劑不顯顏色，然后用流動(dòng)相液體洗滌，過濾，105烘箱干燥。2. EDTA緩沖液（固定相）：在40ml甘油中，加入10ml聚乙二醇400，搖勻即得20%（V/V）聚乙二醇400的甘油溶液（保濕），再加入950ml pH7 0.1M EDTA（鰲合）溶液，混勻即得EDTA緩沖液。3. 展層劑（流動(dòng)相）：取pH7 EDTA溶

8、液5ml，緩慢加在200ml（丙酮:氯仿:乙酸乙酯=3:1:1）溶液中，然后倒入展層缸中。4. 樣品配制：稱取100mg成品四環(huán)素，溶于5ml甲醇中得2%（W/V）溶液。四、實(shí)驗(yàn)方法四、實(shí)驗(yàn)方法第14頁/共23頁硅藻土硅藻土 1g 研缽研缽EDTA緩沖液緩沖液2ml蒸餾水蒸餾水0.75ml研勻（顆粒適中、無氣泡）研勻（顆粒適中、無氣泡）置飽和NH4Cl缸室溫放置室溫放置無明顯水漬無明顯水漬厚度涂均勻，厚度涂均勻，特別下邊緣涂滿平整特別下邊緣涂滿平整（二）層析操作四、實(shí)驗(yàn)方法四、實(shí)驗(yàn)方法第15頁/共23頁第16頁/共23頁0.5cm15cm1.5cm均勻均勻無氣泡無氣泡無裂紋無裂紋毛細(xì)管點(diǎn)樣毛細(xì)

9、管點(diǎn)樣點(diǎn)樣點(diǎn)甲醇揮發(fā)點(diǎn)樣點(diǎn)甲醇揮發(fā)干后，將板放入干后，將板放入展層缸內(nèi)，密封展層缸內(nèi)，密封晾干，氨氣熏，晾干，氨氣熏，紫外燈下觀察紫外燈下觀察分別求兩種分別求兩種組分的組分的Rf值值量距離量距離展層劑展層劑0.5cm 溶質(zhì)移動(dòng)距離 同一時(shí)間流動(dòng)相移動(dòng)距離Rf=第17頁/共23頁第18頁/共23頁操作注意點(diǎn)操作注意點(diǎn) 制板：1.在研缽中研磨時(shí)應(yīng)緩慢，注意不能產(chǎn)生氣泡。2.薄板移入飽和氯化銨的缸中時(shí)，不宜太干或太濕，以無明顯水漬為宜。太干展層太快，引起拖尾；太濕展層太慢。 點(diǎn)樣：3.點(diǎn)樣時(shí)，盡量使點(diǎn)樣斑點(diǎn)直徑小。4.點(diǎn)樣后，待溶劑揮發(fā)后再移入展層缸內(nèi)，不要用電吹風(fēng)。 展層：3.注意展層劑浸沒薄層的一端約0.5cm，不能浸沒樣品斑點(diǎn)。4.層析缸蓋子應(yīng)蓋密，減少溶劑揮發(fā)。第19頁/共23頁實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論（一）預(yù)習(xí)1.四環(huán)素的硅藻土薄板層析屬于哪一種層析機(jī)制。固定相和流動(dòng)相分別是什么？2.為了使層析效果好（不拖尾，分離好），操作中注意事項(xiàng)。（二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論1.在紙上描繪出薄板上斑點(diǎn)的圖形，量出各斑點(diǎn)組分的距離，計(jì)算Rf值。2.分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3.總結(jié)本實(shí)驗(yàn)成功或失敗的經(jīng)驗(yàn)