WHO第五版精子形態(tài)解讀

1、WHO人精液實(shí)驗(yàn)室檢查及處理手冊（第5版）精子形態(tài)學(xué)部分解讀浙江省人類精子庫姚康壽 主任醫(yī)師1背景 全球精液檢測標(biāo)準(zhǔn)化的需求，WHO制定了人類精液實(shí)驗(yàn)室操作手冊，用于臨床實(shí)驗(yàn)室和科研。第一版1980年第二版1987年第三版1992年第四版1999年第五版2010年2WHO11980WHO21987WHO31992WHO41999WHO520103中文翻譯本4標(biāo)準(zhǔn)方法可選擇試驗(yàn)研究性試驗(yàn)精子制備精子冷凍精液分析精子制備質(zhì)量保證WHO 5th主要內(nèi)容附錄5正常形態(tài)精子： 通過觀察來自女性生殖道，特別是經(jīng)性交后宮頸粘液或從卵子透明帶表面回收的精子有助于定義具備潛在受精能力的精子。使用這些標(biāo)準(zhǔn)，對所有

2、男性而言，其正常形態(tài)精子百分率的范圍大致為0-30%，很少超過25% 。這個(gè)低數(shù)據(jù)自然產(chǎn)生一個(gè)低的臨界值 （僅為3-5%）。 經(jīng)過“透明帶選擇”的精子，正常形態(tài)率仍然低，約8-25%。 6WHO不同版本精子形態(tài)學(xué)內(nèi)容比較7精子形態(tài)學(xué)分析包括以下步驟 精液涂片的制備固定和染色封片精子形態(tài)評估（應(yīng)制備雙份涂片重復(fù)評估，每張涂片應(yīng)評估至少200個(gè)精子） 。雙份片評估（百分率）結(jié)果比較（差異是否在可接受范圍內(nèi)，如果不可接受，重新讀片） 。取平均值，報(bào)告結(jié)果8精液涂片的制備 充分混勻精液樣本?？焖偃?，避免精子從混懸的精液樣本中沉降。重復(fù)取樣前，再次混勻精液樣本。根據(jù)精液樣本具體不同情況，采用不同的涂片

3、方式。9（a） 對于未稀釋的精液，采用拉薄技術(shù)，將一滴精液（S）沿成角的載玻片背側(cè)邊緣展開，向前拖拉制成涂片。（b） 對于洗滌的精液，采用滴管法，水平持滴管（P）推進(jìn)，將一滴精子懸液（SS），沿載玻片的表面展開。10正常精液標(biāo)本 使用拉薄技術(shù)，取一滴精液在載玻片的表面上涂片。磨砂載玻片的兩面，用不起毛軟紙擦干凈。用HB或No.2鉛筆，在載玻片的磨砂處標(biāo)記上身份編號、日期。根據(jù)精子密度，取5-10l的精液滴在載玻片的一端。用第二張載玻片作為拉片，沿著載玻片的表面拖拉精液滴。涂片經(jīng)空氣干燥后，立即固定、染色。11 一開始，可以用10l的精液，45角度，一秒鐘的時(shí)間涂片。 為了減少涂片上精子間的相互

4、重疊，如果需要，可以改變上述參數(shù)（10l，45，1秒）。 精液的粘稠度越低，涂片的拉薄技術(shù)發(fā)揮得越好，拉薄技術(shù)不適用于高度粘稠的精液。 拉薄技術(shù)12精子密度低的標(biāo)本 假如精子密度低于2106/ml，濃縮標(biāo)本粘稠精液標(biāo)本 精漿高度粘稠時(shí)涂片往往是厚而不均，可以按與液化不良精液標(biāo)本相同的處理方法或者使用洗滌的方法處理。 13染色方法 推薦的染色方法有Papanicolaou染色法Shorr染色法Diff-Quik染色法。 用上述三種染色方法，在光學(xué)顯微鏡亮視野下觀察，精子頭部的頂體區(qū)染成淡藍(lán)色pale blue，頂體后區(qū)染成深藍(lán)色dark blue，中段可能染成紅色，尾部染成藍(lán)色或淡紅色reddi

5、sh。通常位于頭部背后或中段周圍的胞漿小滴染成粉紅色、紅色（巴氏染色）或者橘紅色（Shorr染色）。 14改良巴氏染色步驟1、80%乙醇 30秒2、50%乙醇 30秒3、純水 30秒4、Harris蘇木精 4分鐘5、純水 30秒6、酸性乙醇 48次*7、流水洗 5分鐘8、50%乙醇 30秒9、80%乙醇 30秒10、95%乙醇 至少15分鐘11、橙黃G6 1分鐘12、95%乙醇 30秒13、95%乙醇 30秒14、95%乙醇 30秒15、EA-50 1分鐘16、95%乙醇 30秒17、95%乙醇 30秒18、100%乙醇 15秒19、100%乙醇 15秒15主要溶液的作用乙醇 固定細(xì)胞；并且使

6、細(xì)胞脫水蘇木精 使細(xì)胞核染成藍(lán)色酸性乙醇 去除胞漿中非特定區(qū)域的染料 （脫色）自來水 去除未與細(xì)胞核結(jié)合的蘇木精橙黃G-6 使胞漿染成粉紅色EA-50 使胞漿染成粉紅色16WHO第4版與第5版巴氏染色主要步驟比較內(nèi)容WHO第4版WHO第5版總步驟：23步19步固定液：95%乙醇+95%乙醚95%乙醇濃度梯度： 80%、70%、50%80%、50% 50%、70%、80%、90% （10秒）50%、80%、95% (15分）蘇木精時(shí)間：3分4分橙黃G6時(shí)間：2分1分EA-50時(shí)間：5分1分酒精浸入時(shí)間：各10次各30秒171、第5版共19步，第4版共23步，減少了4個(gè)步驟。2、由于蘇木精后沒有流

7、水沖洗，導(dǎo)致染液殘留較多，酸性乙醇的更換頻率明顯增加。3、第5版染色所需時(shí)間較4版約增加10分鐘以上。4、染色效果相似。WHO第4版與第5版巴氏染色總結(jié)18WHO第4版與第5版染色效果比較WHO第4版WHO第5版19Shorr染色步驟 1、流水 浸12-15次*2、蘇木精 1-2分鐘3、流水 浸12-15次*4、乙醇胺 浸10次*5、流水 浸12-15次6、50%乙醇 5分鐘7、Shorr溶液 3-5分鐘8、50%乙醇 5分鐘9、75%乙醇 5分鐘10、95%乙醇 5分鐘Shorr染色可以得到與巴氏染色相近的正常形態(tài)精子百分率 20精子形態(tài)的快速染色程序 1、快速染液1 10秒2、快速染液2

8、5秒3、流水 浸10-15次去除多余染劑 一些用快速染色法染的涂片背景很深，染色的質(zhì)量可能比巴氏染色方法差。 21精子封片前的處理 有兩種液體封片劑：溶于乙醇的和不溶于乙醇。使用溶于乙醇的封片劑，染色完成后，在涂片未干的情況下立即使用該封片劑進(jìn)行封片。使用不溶于乙醇的封片劑，將涂片在二甲苯中浸1分鐘（在通風(fēng)柜中操作），瀝干1-2秒鐘后立即封片，封片時(shí)應(yīng)保持涂片的濕潤。22精子涂片的封片 1、滴2-3小滴封片劑在載玻片上。2、將蓋玻片（24 mm 50 mm 或 24 mm 60 mm最合適）直接放置在載玻片上。3、蓋玻片先接觸封片劑，從載玻片的長邊開始放置，以防止產(chǎn)生氣泡。4、如有需要，輕輕地

9、按壓蓋玻片的頂端以使氣泡移到載玻片的邊緣。5、擦掉載玻片底下多余的二甲苯（如果使用二甲苯）。6、在通風(fēng)柜內(nèi)，把已封片的涂片水平地放在載玻片烘干架上，或者放在吸水紙上干燥24小時(shí)。23精子形態(tài)學(xué)評估標(biāo)準(zhǔn)在評估精子正常形態(tài)時(shí)應(yīng)采用嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)（Kruger et al.,1986; Menkveld et al., 1990; Coetzee et al., 1998）。精子包括頭、頸、中段、主段和末端。由于通過光學(xué)顯微鏡很難觀察到精子末端，因此可以認(rèn)為細(xì)胞是由頭（和頸）和尾（中段和主段）組成。只有頭和尾都正常的精子才認(rèn)為是正常的。所有處于臨界狀態(tài)的精子均認(rèn)為是異常。24精子頭部判斷標(biāo)準(zhǔn)分類WHO第5

10、版WHO第4版正常標(biāo)準(zhǔn)精子頭外形上應(yīng)該光滑、規(guī)則，大體上呈橢圓形；長度95%可信限區(qū)間為3.7-4.7；寬度95%可信限區(qū)間為2.5-3.2；長寬比95%可信限區(qū)間為1.3-1.8頂體界限清晰，占頭部的40%-70%；精子頭的形狀必須是橢圓形的，長度為4.05.0m;寬為2.53.5m；長寬比為1.501.75之間；頂體界限清晰，占頭 部的40%-70%異常標(biāo)準(zhǔn)有空泡的頭（超過2個(gè)空泡或未染色的空泡區(qū)域占頭部的20%以上）頂體后區(qū)有空泡、頂體過小或頂體過大的頭（小于頭部的40%或大于頭部的70%） 有空泡的頭（未染色的空泡區(qū)域占頭部的20%以上）；頂體過小頭（小于頭部的40%）WHO第5版與第

11、4版精子形態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)比較25精子中段判斷標(biāo)準(zhǔn)分類WHO第5版WHO第4版正常標(biāo)準(zhǔn)中段應(yīng)細(xì)，規(guī)則，大約與頭部長度相等，并且主軸與頭部長軸一致；長度95%可信限區(qū)間為3.3-5.2寬度95%可信限區(qū)間為0.5-0.7 ；中段應(yīng)細(xì)，大約為頭部長度的1.5倍，并且在軸線上緊貼頭部；寬度1m異常標(biāo)準(zhǔn)缺陷包括：中段急劇彎曲；中段非對稱地接在頭部、粗的或不規(guī)則的中段、異常細(xì)的中段以及上述缺陷的任何組合。 缺陷包括：中段“彎曲”（頸和尾形成的角度大于頭部長軸的90）中段非對稱地接在頭部、粗的或不規(guī)則的中段、異常細(xì)的中段以及上述缺陷的任何組合。WHO第5版與第4版精子形態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)比較26WHO第5版與第4版精子

12、形態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)比較27WHO第四版與第五版精子形態(tài)學(xué)評估標(biāo)準(zhǔn)比較研究研究目的：比較WHO第四版與第五版精子形態(tài)學(xué)評估標(biāo)準(zhǔn)的變化。研究對象： 1000個(gè)精子圖片、一張精子形態(tài)質(zhì)控片研究方法： 1、用WHO第四版的評估標(biāo)準(zhǔn)，對上述精子進(jìn)行評估。 2、精子庫9名工作人員學(xué)習(xí)第五版精子形態(tài)學(xué)評估標(biāo)準(zhǔn)及精子圖譜，并進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制，統(tǒng)一評估標(biāo)準(zhǔn)，工作人員之間無顯著差異。 3、用WHO第五版的評估標(biāo)準(zhǔn)，對上述精子再次進(jìn)行評估。 4、比較上述兩種標(biāo)準(zhǔn)分析結(jié)果的差異。研究結(jié)果： WHO第五版與第四版相比： 1、形態(tài)正常精子百分率高、頭部異常率低、尾部異常率低，有顯著差異； 2、頸和中段異常率、胞漿小滴率無顯著差

13、異。28兩種標(biāo)準(zhǔn)評估結(jié)果比較29WHO第5版與第4版精子形態(tài)學(xué)評估標(biāo)準(zhǔn)的主要區(qū)別1、頭部外形輪廓判斷變的寬松，僅要求大致成橢圓形。2、對頭部空泡的判斷更嚴(yán)格，多于2個(gè)空泡或者頂頭后區(qū)空泡，都判斷為異常。3、頸部的長度有原來頭部的1.5倍縮短為1倍，并且寬度比第4版要更細(xì)。4、尾部只有尖銳的折角才判斷為異常，而不再以彎曲角度90度為界限。5、胞漿小滴的標(biāo)準(zhǔn)無差異。30 5th-WHO手冊精液參考值下限參數(shù)參考值下限精液體積（ml）1.5（1.4-1.7）精子總數(shù)（106 / 次射精）39（33-46）精子濃度（106/ml）15（12-16）總活動(dòng)率（PR+NP，%）40（38-42）前向活動(dòng)率

14、（PR，%）32（31-34）存活率（存活精子，%）58（55-63）精子形態(tài)學(xué)（正常形態(tài)，%）4（3.0-4.0）其他參數(shù)pH7.2過氧化物酶陽性白細(xì)胞（106/ml）1.0MAR試驗(yàn)（附著粒上的活動(dòng)精子，%）50免疫珠試驗(yàn)（附著珠上的活動(dòng)精子，%）20%3、頂體頂體70% 頂體40% 44中段和主段（8）彎曲不自然的折角（見插圖2.13g和e）卷曲明顯易判的異常雙尾明顯易判的異常插入尾部插入的位置位于頭部長軸的一側(cè)輪廓不規(guī)則外形輪廓不規(guī)則環(huán)狀尾部彎曲成環(huán)狀粗明顯易判的異常太長明顯易判的異常45 對于頸和中段異常的描述 增粗輪廓不規(guī)則插入彎曲1、中段異常2、胞漿小滴胞滴小于1/3（CD）胞滴大于1/3(ERC)46 對于主段異常的描述 雙尾環(huán)狀卷曲短尾粗彎曲47細(xì)胞（9）桿菌細(xì)菌退化的白細(xì)胞明顯易判的異常退化的精子細(xì)胞明顯易判的異常巨噬細(xì)胞白細(xì)胞中的巨噬細(xì)胞單核細(xì)胞無顆粒白細(xì)胞上皮細(xì)胞來自男性泌尿生殖管道精子細(xì)胞未成熟的生殖細(xì)胞精母細(xì)胞未成熟的生殖細(xì)胞多核型白細(xì)胞多核型白細(xì)胞48非精子細(xì)胞 （一）退化的巨噬細(xì)胞多核型白細(xì)胞上皮細(xì)胞 桿 菌單核細(xì)胞吞噬中的巨噬細(xì)胞退化