第八章基因工程技術

1、第八章第八章基因工程技術基因工程技術基因工程相關概念基因工程相關概念基因工程相關的酶學基因工程相關的酶學基因工程的載體基因工程的載體目的基因的制備和分離方法目的基因的制備和分離方法載體與目的基因的連接載體與目的基因的連接重組體的鑒定與分析重組體的鑒定與分析隆基因的表達隆基因的表達本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容重組重組DNA技術的發(fā)展史技術的發(fā)展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗的豌豆雜交試驗1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗1973年年 美國斯坦福大學的科學家構(gòu)建第一個重組美國斯坦福大學的科學家構(gòu)建第一個重組DNA分子分子1977年年 美國南舊金山由

2、博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應用重組程公司，專門應用重組DNA技術制造醫(yī)學上重要的藥物。技術制造醫(yī)學上重要的藥物。1980年年 開始建造第一家應用重組開始建造第一家應用重組DNA技術生產(chǎn)胰島素的工廠技術生產(chǎn)胰島素的工廠1997年年 英國羅林研究所成功的克隆了多莉英國羅林研究所成功的克隆了多莉一、基因工程技術相關概念一、基因工程技術相關概念（一）（一）DNA克隆克隆克隆（克?。╟lone）：）： 來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合?？寺』寺』╟loning）：）： 獲取同一拷貝的過程，即無

3、性繁殖。獲取同一拷貝的過程，即無性繁殖。分子克?。ǚ肿涌寺。―NA克?。┛寺。┘毎寺〖毎寺€體克?。▌游锘蛑参铮﹤€體克?。▌游锘蛑参铮?DNA克隆克隆應用酶學的方法，在體外將各種來源的應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)遺傳物質(zhì)與與載體載體DNADNA接合成一具有自我復制接合成一具有自我復制能力的能力的DNADNA分子分子復制子復制子(replicon)，繼而繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞宿主細胞，篩選出含有目的，篩選出含有目的基因的基因的轉(zhuǎn)化子細胞轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增，提取獲得，再進行擴增，提取獲得大量同一大量同一DNADNA分子，也稱分子，也稱基因克隆或重組基因克隆或

4、重組DNA (recombinant DNA) 。 DNA克隆克隆目的目的: : 分離獲得某一感興趣的基因或分離獲得某一感興趣的基因或DNA; 獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）白質(zhì)）?；蚬こ蹋夯蚬こ蹋?實現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關實現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關的工作，又稱為的工作，又稱為重組重組DNA技術技術 (recom-binant DNA technology)?；蚬こ痰幕具^程和工作原理基因工程的基本過程和工作原理 載體DNA(限制性內(nèi)切酶切開)目的基因宿主細胞重組體已轉(zhuǎn)化的宿主細胞陽性克隆株繁殖表達 在這個過程中：在這個過程中： 1.“基因剪刀基

5、因剪刀” 剪取剪取DNA的酶就像一把的酶就像一把“基因剪刀基因剪刀” 2.“縫紉針縫紉針” 連接不同來源連接不同來源DNA分子的酶就像一根分子的酶就像一根“縫紉針縫紉針”，使二者連在一起使二者連在一起 3.“交通工具交通工具” 使用載體好比一輛車子使用載體好比一輛車子 4.“乘客乘客” 有用基因如有用基因如IL2好比使乘客，車子把乘客送進理想好比使乘客，車子把乘客送進理想天堂（宿主細胞）去繁衍生息，春華秋實，生產(chǎn)我們需要天堂（宿主細胞）去繁衍生息，春華秋實，生產(chǎn)我們需要的產(chǎn)品或開展基因治療（的產(chǎn)品或開展基因治療（IL2/LAK抗癌）。抗癌）。 （二）工具酶（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸

6、內(nèi)切酶DNADNA聚合酶聚合酶I I逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNADNA連接酶連接酶堿性磷酸酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶工具酶限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3- 5磷酸二酯鍵DNA聚合酶探針標記、補平3末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探針標記末端轉(zhuǎn)移酶3末端多聚尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基常用的工具酶：常用的工具酶：一、一、 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶1.1 概念概念 識別識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。的一類內(nèi)切酶。 是細菌內(nèi)存在的保護性酶。分為是

7、細菌內(nèi)存在的保護性酶。分為I、II、III三類。三類。II類類酶識別序列特點為酶識別序列特點為回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)。 1. 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶1.2 限制性核酸內(nèi)切酶的命名限制性核酸內(nèi)切酶的命名Haemophilus influenzae d 嗜血流感桿菌嗜血流感桿菌d d株株 屬名屬名 種名種名 株名株名Hind III同一菌株中所含的多個不同的限制性內(nèi)切酶同一菌株中所含的多個不同的限制性內(nèi)切酶1.3基本特征：基本特征：限制性核酸內(nèi)切酶識別序列長度為限制性核酸內(nèi)切酶識別序列長度為48個個bp。限制性核酸內(nèi)切酶作用后產(chǎn)生兩種限制性核酸內(nèi)切酶作用后產(chǎn)生兩種末端末端： 平頭末端平頭末端(

8、 (flush end)flush end)和和 粘性末端粘性末端( (sticky end)sticky end)Hind IIIBamH IGCCTAGGATCCG+GTCCAGGACCTG+GTCGACCAGCTGGGATCCCCTAGG 粘性末端粘性末端 AATTCG53ACGTCG535 -端突出端突出3 -端突出端突出限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 同裂酶同裂酶（isoschizomer ），是來源于不同物種但能識），是來源于不同物種但能識別相同別相同DNA序列的限制性內(nèi)切酶，切割位點

9、可以相同也序列的限制性內(nèi)切酶，切割位點可以相同也可以不同。可以不同。 同尾酶同尾酶（isocaudarner），一類識別不同核苷酸序列，一類識別不同核苷酸序列但能切割產(chǎn)生相同末端的限制性內(nèi)切酶，一般是指能產(chǎn)生但能切割產(chǎn)生相同末端的限制性內(nèi)切酶，一般是指能產(chǎn)生相同粘性末端的限制酶。相同粘性末端的限制酶。同尾酶同尾酶產(chǎn)生的相同粘性末端稱產(chǎn)生的相同粘性末端稱配配伍末端伍末端（compatible end），），可用連接酶連接。如可用連接酶連接。如Sal I 與與Xho I，BamH I與與Bgl II。限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（1 1）消化作用：）消化作用：限制性內(nèi)切酶以同源二聚體的限制性內(nèi)

10、切酶以同源二聚體的形式與靶形式與靶DNADNA序列發(fā)生作用識別，靶序列發(fā)生作用識別，靶DNADNA的大小的大小決定產(chǎn)生特定決定產(chǎn)生特定DNADNA片段的大小。片段的大小。（2 2）片段化：單酶切：）片段化：單酶切：n(n(環(huán)狀）或環(huán)狀）或n+1n+1（線性）（線性）1.4 限制性內(nèi)切酶的對限制性內(nèi)切酶的對DNA的消化作用及其片段化的消化作用及其片段化限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶雙酶切：雙酶切：a+ba+b( (環(huán)狀），環(huán)狀），a+b+1(a+b+1(線性）線性）（1 1）對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時）對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時酶切，但應注意：酶切位點太靠近時，先用一酶切，

11、但應注意：酶切位點太靠近時，先用一種酶切，然后再用另一種酶切種酶切，然后再用另一種酶切1.4 限制性內(nèi)切酶的對限制性內(nèi)切酶的對DNA的消化作用及其片段化的消化作用及其片段化限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（1 1）不同不同的的DNADNA片段通過互補的粘性末端連接稱片段通過互補的粘性末端連接稱為為 分子間連接。分子間連接。（2 2）同一同一片段的片段的2 2個互補末端之間的連接稱為個互補末端之間的連接稱為 分子內(nèi)連接分子內(nèi)連接1.5、具有粘性末端的、具有粘性末端的DNA片段的兩種連接方式。片段的兩種連接方式。限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 (1) DNA樣品的純度：樣品的純度： 蛋白質(zhì)、苯酚

12、、氯仿、乙醇、蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、NaCl等。等。l 加大酶的用量，加大酶的用量，1g DNA 用用10U酶酶l 加大反應總體積加大反應總體積l 延長反應時間延長反應時間1.6 影響限制性內(nèi)切酶活性的因素影響限制性內(nèi)切酶活性的因素限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(2) DNA樣品的甲基化程度：基因工程常常使用丟失了甲基化酶樣品的甲基化程度：基因工程常常使用丟失了甲基化酶的大腸桿菌來制備質(zhì)粒的大腸桿菌來制備質(zhì)粒 大腸桿菌的大腸桿菌的dam甲基化酶甲基化酶在在5GATC3序列中的腺嘌呤序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI

13、等，但等，但BamH I、Bgl II、Sau3A I不受影響。不受影響。 大腸桿菌的大腸桿菌的dcm甲基化酶甲基化酶在在5 CCAGG 3或或5 CCTGG 3序序列中的胞嘧啶列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有位上引入甲基，受其影響的酶有EcoR II等等 哺乳動物的甲基化酶在哺乳動物的甲基化酶在5 CG 3序列中的序列中的C5位上引入甲基。位上引入甲基。影響酶切反應的因素影響酶切反應的因素限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(3)底物底物DNA分子的構(gòu)型：底物分子的構(gòu)型：底物DNA不同構(gòu)不同構(gòu)型對核酸限制性內(nèi)切酶活性有較大的影響。型對核酸限制性內(nèi)切酶活性有較大的影響。(4) 反應的溫

14、度：大多數(shù)為反應的溫度：大多數(shù)為37 影響酶切反應的因素影響酶切反應的因素限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(5)反應體系的組成：反應體系的組成： 緩沖液的種類，緩沖液的種類，pH值，高濃度的酶、高濃度的甘油、低值，高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、添加二巰基丙醇，二二硫蘇糖醇（離子強度、添加二巰基丙醇，二二硫蘇糖醇（DTT），），BSA DMSO等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的發(fā)生低特異性，即所謂的Star activity現(xiàn)象?，F(xiàn)象。 EcoR I在正常條件下識別并切割在正常條件下識別并切割5 GAATTC3 序列，但序列

15、，但在甘油濃度超過在甘油濃度超過5%（v/v）時，也可切割時，也可切割5 PuPuATPyPy 3或或5 AATT 3。(6)酶量、反應體積、酶切時間合理使用。酶量、反應體積、酶切時間合理使用。影響酶切反應的因素影響酶切反應的因素 二、二、DNA連接酶連接酶定義：可以催化具有定義：可以催化具有5-磷?；土柞；?羥基末端形成磷酸羥基末端形成磷酸二酯酶鍵的酶。二酯酶鍵的酶。 二、二、DNA連接酶連接酶 （1 1）催化雙鏈）催化雙鏈DNADNA上缺口處的磷酸二酯鍵形成上缺口處的磷酸二酯鍵形成2.1 催化的反應催化的反應二、二、 DNA連接酶連接酶2.1 催化的反應催化的反應（2 2）催化）催化R

16、NA-DNARNA-DNA雙鏈中的雙鏈中的DNADNA鏈缺口處的磷酸二酯鍵形鏈缺口處的磷酸二酯鍵形成成二、二、 DNA連接酶連接酶（3 3）連接多個平頭雙鏈）連接多個平頭雙鏈DNA分子：分子：2.1 催化的反應催化的反應三、聚合酶三、聚合酶作用：以作用：以RNA或或DNA為模板催化為模板催化RNA或或DNA的合成的合成1. DNA聚合酶聚合酶 I 大片段大片段 (Klenow片段片段)三、聚合酶三、聚合酶323個氨基酸個氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604個氨基酸個氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活核酸外切酶活性性N 端

17、端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶/枯草桿菌蛋白水解酶枯草桿菌蛋白水解酶DNA-pol 在模板和引物在模板和引物 (DNA或或RNA) 存在的條件下，以存在的條件下，以dNTP作底物，沿作底物，沿53方向合成與模板互補的方向合成與模板互補的DNA。能夠用于能夠用于M13雙脫氧法測序。雙脫氧法測序。53 DNA Polymerase活性活性單鏈特異性的單鏈特異性的35外切核酸酶活性外切核酸酶活性53外切酶活性35外切酶活性5335l 修補經(jīng)限制性酶消化修補經(jīng)限制性酶消化dsDNA得到的得到的3隱蔽末端，隱蔽末端，使其成為平頭末端。使其成為平頭末端。l 使用隨機引物進行使用隨機引物進行DNA標記標記l

18、 在在cDNA的克隆中用于的克隆中用于cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成l 雙脫氧法雙脫氧法DNA序列測定序列測定 (Sanger法法)。用途用途隨機引物隨機引物DNADNA標記步驟標記步驟1.來源來源 源于源于T4噬菌體感染的噬菌體感染的E.coli。2. 酶的活性酶的活性，相似于，相似于Klenow片段，但遠遠強于片段，但遠遠強于Klenow片段片段 （1）53 聚合活性聚合活性 （ 2 ） 3 5 外 切 酶 活 性 （外 切 酶 活 性 （ T 4 pol/Klenow）3.基因工程中用途與基因工程中用途與Klenow片段一致（參前，標記片段一致（參前，標記末端，填平末端，填平5末端），

19、不同的是可對末端），不同的是可對3突出端的突出端的DNA分子進行標記。這是用其強勁的分子進行標記。這是用其強勁的35外外切酶活性切除切酶活性切除33突出端，產(chǎn)生突出端，產(chǎn)生33凹端凹端。 2. T4-DNA聚合酶聚合酶T4-DNA聚合酶聚合酶T4-DNA聚合酶聚合酶3.TaqDNA聚合酶聚合酶(Taq DNA pol，Taq pol） 該酶是一種耐熱的依賴于該酶是一種耐熱的依賴于DNA的的DNA聚合酶，聚合酶，具有具有53聚合活性以及依賴聚合活性以及依賴53聚合酶作用的聚合酶作用的外切酶活性，聚合酶的最適反應溫度是外切酶活性，聚合酶的最適反應溫度是7580,37 ,37 活性有活性有1010。

20、 該酶的主要用途是進行該酶的主要用途是進行PCRPCR反應（詳參聚合反應（詳參聚合酶鏈，酶鏈，polymerase chain reactionpolymerase chain reaction） 逆轉(zhuǎn)錄酶是逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶多功能酶，有三種酶活性：，有三種酶活性：1. 1. 逆轉(zhuǎn)錄活性：逆轉(zhuǎn)錄活性：即以即以RNARNA為模板合成為模板合成DNADNA2. 2. RNaseRNase活性：活性：水解水解RNARNA:DNA:DNA中的中的RNARNA3. DNA 3. DNA polpol活性：活性：以以DNADNA為模板合成為模板合成DNADNA特點：無外切酶活性，轉(zhuǎn)錄錯誤率高特點：無外切酶

21、活性，轉(zhuǎn)錄錯誤率高2 21010-4-4。 4.逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶3. DNA 3. DNA polpol活性：活性：以以DNADNA為模板合成為模板合成DNADNA特點：無外切酶活性，轉(zhuǎn)錄錯誤率高特點：無外切酶活性，轉(zhuǎn)錄錯誤率高2 21010-4-4。2. 2. RNaseRNase活性：活性：水解水解RNARNA:DNA:DNA中的中的RNARNA3. DNA 3. DNA polpol活性：活性：以以DNADNA為模板合成為模板合成DNADNA特點：無外切酶活性，轉(zhuǎn)錄錯誤率高特點：無外切酶活性，轉(zhuǎn)錄錯誤率高2 21010-4-4。5353TTTTpoly A tail35CCC353GGG

22、5逆轉(zhuǎn)錄活性逆轉(zhuǎn)錄活性RNaseRNase活性活性RNA:DNARNA:DNA雜合鏈雜合鏈RNARNA模板模板單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNADNA DNA polpol活性活性l 一種無需模板的一種無需模板的DNADNA聚合酶，催化脫氧核苷酸結(jié)合到聚合酶，催化脫氧核苷酸結(jié)合到DNADNA分子的分子的3 3羥基端。帶有突出、凹陷或平滑末端的單雙鏈羥基端。帶有突出、凹陷或平滑末端的單雙鏈DNADNA分子均可作為分子均可作為TdTTdT的底物。的底物。l 用途：用途： 催化催化DNADNA的的33末端添加同聚物末端添加同聚物 DNADNA的的33末端標記末端標記 給載體或給載體或cDNAc

23、DNA加上互補的同聚尾，造成人工粘液末端可以重組。加上互補的同聚尾，造成人工粘液末端可以重組。1. 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶(Terminal Transferase，TdT ) 四、四、DNA和和RNA的修飾酶的修飾酶l 能催化除去能催化除去DNA的的5磷酸基團，磷酸基團，5-P變?yōu)樽優(yōu)?-OH；l 處理后的處理后的DNA片段缺少連接酶所要求的片段缺少連接酶所要求的5磷酸末端，磷酸末端，因此它們不能進行自連接?？梢栽诳寺r降低載體因此它們不能進行自連接?？梢栽诳寺r降低載體DNA的背景。的背景。l 小牛腸堿性磷酸酶小牛腸堿性磷酸酶(Calf Intestinal ， CIP) 和細菌堿性磷酸酶（

24、和細菌堿性磷酸酶（bacteria Intestinal BIP)2. 堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase） 四、四、DNA和和RNA的修飾酶的修飾酶來源：米曲霉來源：米曲霉功能：降解功能：降解ssDNAssDNA或或RNARNA，形成，形成55磷酸末端的單或磷酸末端的單或寡核苷酸。并且對寡核苷酸。并且對DNADNA底物的活性比對底物的活性比對RNARNA強。強。（1 1）內(nèi)切）內(nèi)切單單鏈鏈DNADNA或或RNARNA基本反應基本反應 五、核酸酶五、核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶單鏈核酸內(nèi)切酶: S1核酸酶核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶單鏈核酸內(nèi)切酶: S1核酸酶核酸酶（2 2）內(nèi)切

25、）內(nèi)切帶缺口或缺刻的帶缺口或缺刻的雙鏈雙鏈DNADNA或或RNARNA基本反應基本反應S1核酸酶核酸酶重要用途：重要用途： S1S1作圖（作圖（S1 mappingS1 mapping）是一種對是一種對RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的末端和剪接位點進行轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的末端和剪接位點進行作圖作圖的方法。的方法。雙鏈雙鏈DNA變性后，與變性后，與mRNA雜交，外顯子區(qū)段與雜交，外顯子區(qū)段與mRNA雜交雜交形成雙鏈，而形成雙鏈，而DNA的其余部分仍為單鏈分子。通過電泳，確的其余部分仍為單鏈分子。通過電泳，確定不被降解的定不被降解的DNA片段的大小，即可確定片段的大小，即可確定mRNA的末端以及的末端以及位于基因內(nèi)部的內(nèi)含

26、子的位置。位于基因內(nèi)部的內(nèi)含子的位置。 S1 mapping應用：應用： 研究研究RNA的一級結(jié)構(gòu)的一級結(jié)構(gòu) 在已知基因的序列后測定在已知基因的序列后測定mRNA起點和終點起點和終點 還可以檢測前體還可以檢測前體RNA-mRNA的剪接點的剪接點S1核酸酶作圖核酸酶作圖第三節(jié)：基因工程的載體（第三節(jié)：基因工程的載體（vectorvector）定義：定義： 是指用來攜帶外源目的基因、實現(xiàn)外源是指用來攜帶外源目的基因、實現(xiàn)外源DNA克隆或克隆或/和表達蛋白質(zhì)的和表達蛋白質(zhì)的DNA分子。分子。常用的載體：常用的載體： 質(zhì)粒、噬菌體質(zhì)粒、噬菌體DNA、病毒病毒DNA1.1. 能自主復制，并目的基因的插入

27、不影響其復制能力；能自主復制，并目的基因的插入不影響其復制能力；2.2. 有克隆位點（外源有克隆位點（外源DNADNA插入點），常具有多個單一酶插入點），常具有多個單一酶 切位點，稱為多克隆位點；切位點，稱為多克隆位點；3.3.含有不影響生長和復制的非必要區(qū)域，可以與外源含有不影響生長和復制的非必要區(qū)域，可以與外源DNADNA連連接重組。接重組。4.4.具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體篩選和鑒定；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體篩選和鑒定；5.5.分子量小，以容納較大的外源分子量小，以容納較大的外源DNADNA。載體的選擇標準載體的選擇標準來源分類：質(zhì)粒載體來源分類：質(zhì)粒載體噬菌體載體

28、噬菌體載體病毒載體病毒載體人工染色體載體人工染色體載體用途分類：克隆載體用途分類：克隆載體表達載體表達載體 穿梭載體穿梭載體常用載體常用載體: :克隆載體克隆載體(cloning vector)能使插入的外源能使插入的外源DNA序列被復制、擴增序列被復制、擴增而不能表達，這樣的載體為而不能表達，這樣的載體為克隆載體克隆載體。表達載體表達載體(expression vector) 使插入的外源使插入的外源DNA序列轉(zhuǎn)錄翻譯，表達序列轉(zhuǎn)錄翻譯，表達出多肽鏈，出多肽鏈，這樣的這樣的載體稱為表達載體。載體稱為表達載體。這類載體中含有來源不同的復制子結(jié)構(gòu)，這類載體中含有來源不同的復制子結(jié)構(gòu)，即具備即具備

29、原核細胞原核細胞復制所需的序列結(jié)構(gòu)，又具復制所需的序列結(jié)構(gòu)，又具有能使外源片段在有能使外源片段在真核細胞真核細胞表達所需的結(jié)構(gòu)表達所需的結(jié)構(gòu)元件和相應的選擇標記基因元件和相應的選擇標記基因,所以能在兩種受所以能在兩種受體細胞中復制并檢測，克隆的外源基因在此體細胞中復制并檢測，克隆的外源基因在此類載體直接從一種受體轉(zhuǎn)入另一種受體中進類載體直接從一種受體轉(zhuǎn)入另一種受體中進行復制和表達行復制和表達穿梭載體（穿梭載體（shuttle vector)1.質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid） 質(zhì)粒是生物細胞內(nèi)能獨立于寄主染色體而自主復制、并被穩(wěn)定質(zhì)粒是生物細胞內(nèi)能獨立于寄主染色體而自主復制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸

30、分子遺傳的一類核酸分子。常見于原核細菌和真菌中。常見于原核細菌和真菌中。絕大多數(shù)的天然絕大多數(shù)的天然DNADNA質(zhì)粒具有質(zhì)粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)共價、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即構(gòu)，即cccDNAcccDNA。大小約為大小約為1-1-300300kbkb。質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid）1.1 1.1 質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒的構(gòu)建 天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎進行人體的要求，因此往往需要以多種野生

31、型質(zhì)粒為基礎進行人工構(gòu)建。工構(gòu)建。 目前實驗室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個野目前實驗室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：生型質(zhì)粒構(gòu)建的： pSC101： 8.8 kb, 拷貝數(shù)拷貝數(shù)5 , 四環(huán)素抗性標記基因四環(huán)素抗性標記基因Tcr ColE1： 6.5 kb ，拷貝數(shù)拷貝數(shù)20 - 30 大腸桿菌內(nèi)毒素標大腸桿菌內(nèi)毒素標 記基因記基因E1 RSF2124： ColE1衍生質(zhì)粒，氨芐青霉素抗性標記基因衍生質(zhì)粒，氨芐青霉素抗性標記基因 Apr質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid）1.2 1.2 分類分類人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質(zhì)粒：突變拷貝數(shù)控制基因，拷

32、貝數(shù)1千-3千，便于擴增基因低拷貝質(zhì)粒：來自pSC101pSC101，拷貝數(shù)小于1010， 表達某些毒性基因溫敏質(zhì)粒：在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測序質(zhì)粒：含有測序通用引物互補序列和多酶接頭polylinker整合質(zhì)粒：裝有整合促進基因及位點，便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒：裝有針對兩種不同受體的復制起點，便于基因克隆表達質(zhì)粒：裝有強化外源基因表達的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒：裝有報告基因，便于啟動子等元件的克隆篩選質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid）1.3 1.3 重要的大腸桿菌質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid）重要的大腸桿菌質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒細菌人工染色體（細菌人工

33、染色體（BAC）（具體見人工載體）（具體見人工載體）噬菌體噬菌體DNADNA噬菌體噬菌體DNADNA噬菌體噬菌體DNADNA 噬菌體作為構(gòu)建克隆載體的依據(jù)噬菌體作為構(gòu)建克隆載體的依據(jù)1. 噬菌體是一種溫和的噬菌體，對大腸桿菌具有噬菌體是一種溫和的噬菌體，對大腸桿菌具有較大的感染性。較大的感染性。2. 能承載較大的外源能承載較大的外源DNA片段片段3. 在在 噬菌體分子上有多種限制性內(nèi)切酶的位點噬菌體分子上有多種限制性內(nèi)切酶的位點 DNA DNA載體的構(gòu)建載體的構(gòu)建 -DNA-DNA載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建：縮短長度縮短長度，提高裝載量。提高裝載量。 野生型野生型-DNA包裝的上限為包裝的上限為5

34、1kb，本身長度為本身長度為48.5kb，插插入的外源入的外源DNA片段不大于片段不大于2.5kb。 -DNA上約有上約有40-50%的片段是復制和裂解所非必需的，可的片段是復制和裂解所非必需的，可切除。根據(jù)切除的多少，可將切除。根據(jù)切除的多少，可將-DNA分成兩大類載體：分成兩大類載體： l插入型載體插入型載體l取代型載體取代型載體 DNA DNA載體的構(gòu)建載體的構(gòu)建插入型載體：適用于插入型載體：適用于cDNAcDNA的克隆和小片段的克隆和小片段DNADNA的克隆，的克隆，含有插入失活的基因片段。如含有插入失活的基因片段。如-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。 DNA DNA載體的構(gòu)建載體的構(gòu)建取代型

35、載體：具有多個限制性內(nèi)切酶的位點，酶切取代型載體：具有多個限制性內(nèi)切酶的位點，酶切后，除去當中的非必需成分，由外源后，除去當中的非必需成分，由外源DNADNA取代，才取代，才能形成能形成噬菌斑噬菌斑。DNADNA載體的特點載體的特點l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌；l-DNA載體的裝載能力為25 kb，遠遠大于質(zhì)粒的裝載量；l重組-DNA分子的篩選較為方便；l重組-DNA分子的提取較為簡便；l-DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達 外源基因。 即粘粒，帶有即粘粒，帶有cos 位點位點的質(zhì)粒（的質(zhì)粒（cos site-carrying plasmid）,是是

36、一類人工構(gòu)建的含有一類人工構(gòu)建的含有-DNA cos序列和質(zhì)粒復序列和質(zhì)粒復制子的特殊類型載體。制子的特殊類型載體。 1.8kb的-DNA片段+ pBR322片段。 裝載范圍為31- 45 kb。粘尾質(zhì)粒（粘尾質(zhì)粒（cosmidcosmid）l 能像能像-DNA-DNA那樣進行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細胞；那樣進行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細胞；l 能像質(zhì)粒那樣在受體細胞中自主復制；能像質(zhì)粒那樣在受體細胞中自主復制；l 重組操作簡便，篩選容易；重組操作簡便，篩選容易；l 加入特異啟動子加入特異啟動子T3T7SP6T3T7SP6，利于雙向表達；，利于雙向表達；l 裝載量大（裝載量大（45 45 k

37、bkb），且克隆片段具有一定的大小范圍；且克隆片段具有一定的大小范圍；l 接上能夠在真核細胞生活的元件，則可以在真核細胞表接上能夠在真核細胞生活的元件，則可以在真核細胞表達。達。cosmidcosmid的優(yōu)點的優(yōu)點 M13 M13單鏈噬菌體單鏈噬菌體DNADNA外型呈絲狀由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成DNA全長6407個核苷酸DNA上至少有10個基因不裂解宿主細胞，但抑制其生長3.1 3.1 大腸桿菌大腸桿菌M13M13噬菌體的結(jié)構(gòu)噬菌體的結(jié)構(gòu)2700個蛋白分子2.2 M132.2 M13單鏈噬菌體單鏈噬菌體DNADNA感染周期感染周期M13M13單鏈噬菌體單鏈噬菌體DNADNAM13 DNA

38、M13 DNA載體的構(gòu)建載體的構(gòu)建M13M13單鏈噬菌體單鏈噬菌體DNADNA 使克隆的使克隆的DNADNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細外片段以特定單鏈的形式輸出受體細外, , 在在DNADNA定向突變中非常有用；定向突變中非常有用； M13M13重組分子篩選簡便；重組分子篩選簡便； 被被M13M13噬菌體感染的受體細胞生長緩慢，形成混濁斑，易噬菌體感染的受體細胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認挑選。且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大；于辨認挑選。且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大； 但但M13-DNAM13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.51.5k

39、bkb。M13 DNAM13 DNA載體的特點載體的特點 -DNA載體和載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為載體的裝載量最大分別為25 kb和和1. 5 kb。但在很多情況下，往往需要克隆更但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源大的外源DNA片段。考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建片段?？妓官|(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進一步提高噬菌體就是為了進一步提高噬菌體DNA的裝載量。的裝載量。六、真核細胞載體六、真核細胞載體（一）哺乳動物細胞的病毒載體（一）哺乳動物細胞的病毒載體 ( (二）酵母載體二）酵母載體（三）桿狀病毒載體（三）桿狀病毒載體人工染色體（人工染色體（ artificial chrom

40、osome）載體載體l 人類、動植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至人類、動植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千上千kb kb 的的DNADNA片段，考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量遠不片段，考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量遠不能滿足需要。能滿足需要。l 將細菌接合因子或酵母菌染色體上的將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)復制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。 當大片段的外源當大片段的外源DNADNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人工染色體，它能像天然染色體那樣，在受體

41、細胞中穩(wěn)組人工染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復制并遺傳。定的復制并遺傳。l常用的人造染色體載體：常用的人造染色體載體： 細菌人工染色體（細菌人工染色體（BACBAC）； 酵母人工染色體（酵母人工染色體（YACYAC）; ; P1 P1人工染色體（人工染色體（P1-derived P1-derived artificial chromosome, artificial chromosome, PAC PAC ）l 細菌人工染色體通常是在大腸桿菌性因子細菌人工染色體通常是在大腸桿菌性因子F F質(zhì)粒的基礎上質(zhì)粒的基礎上構(gòu)建的，其裝載量范圍在構(gòu)建的，其裝載量范圍在50-300 50-

42、300 kbkb之間。之間。l 各種類型的各種類型的pBACspBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝。在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝。l pBACspBACs主要適用于：主要適用于： 克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（gene clustergene cluster）結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 構(gòu)建動植物基因文庫構(gòu)建動植物基因文庫1.1. 細菌人工染色體（細菌人工染色體（BACBAC）l 是利用釀酒酵母染色體的復制元件構(gòu)建的載體。是利用釀酒酵母染色體的復制元件構(gòu)建的載體。YACYAC 載載體在酵母中復制的必需元件包括復制起點序列即體在酵母中復制的必需元件包括復制起點序列即自主復自主復制序列（制序列（auto

43、nomously replicating sequenceautonomously replicating sequence， ARSARS）、）、著絲粒著絲粒 （centromerecentromere , , CENCEN）和和端粒（端粒（TELTEL）。）。l 裝載的裝載的 DNA DNA 片段大小一般可達片段大小一般可達 200-500 200-500kbkb，有的可達有的可達 1 1Mb Mb 以上，甚至達到以上，甚至達到 2 2Mb Mb 。l 工作環(huán)境：在釀酒酵母中。工作環(huán)境：在釀酒酵母中。2. 2. 酵母人工染色體（酵母人工染色體（YACYAC）酵母人工染色體（酵母人工染色體（YACYAC）l 噬菌體噬菌體P1P1載體載體：與與載體非常類似，也是將天然載體非常類似，也是將天然噬噬菌菌體基因組中的一段區(qū)域缺失，其容量也取決于缺失區(qū)體基因組中的一段區(qū)域缺失，其容量也取決于缺失區(qū)段的大小和段的大小和噬噬菌體顆粒能容納的空間?？寺〉钠慰删w顆粒能容納的空間?？寺〉钠慰蛇_達125125kbkb。l P1P1人工染色體：人工染色體：P1P1衍