乙肝臨床意義

1、時間分辨臨床意義 乙肝“兩對半”定量檢測及臨床應用乙型肝炎的病因HBVHBV顆粒，又稱Dane顆粒，直徑42nm抵抗力:耐受566小時及一般消毒劑；10010分鐘，或6510小時可滅活。37可保存7天，-20可保存15年流行狀況在在美國美國100125萬慢性患者大部分新感染者為 20-39歲大約 50% 有急性癥狀大約 5,000 由于慢性肝炎死亡 在中國在中國HBsAg攜帶達10%（高發(fā)地區(qū)13%）2800萬乙肝患者每年新發(fā)病人23/10萬感染率5080%,南方高于北方全球全球3 3.5.5億帶菌者億帶菌者, ,幾乎一半幾乎一半在中國在中國乙型肝炎的危害性WHO估計2000年全球慢性HBV感

2、染達4000萬全球因乙肝死亡數(shù)100萬/年慢性HBV感染是引起肝硬化和肝細胞癌的最主要原因肝癌(HCC)在HBV感染者的發(fā)病率是正常人群的1000倍(江蘇啟東,廣西龍安)3040%肝硬化病人的尸檢是HCC,而90%HCC的發(fā)生在肝硬化的基礎上我國每年有數(shù)以萬計的人死于肝硬化和HCC傳播途徑血液傳播藥癖者感染醫(yī)院性傳播科室分布:消化,肝膽,普外和中醫(yī)科(收容肝病多),口腔,化驗,中心實驗室,胃鏡室,普外(接觸機會多)感染機會高,血液,慢性腎衰病人(常需輸血和透析),腫瘤病人,移植病人(免疫低下)針刺感染:受傷者HBsAb6月為慢性感染高濃度表示高復制,100ng/ml常同時伴HBeAg(+)低濃

3、度的HBsAg可能是:在感染的恢復期,病毒低復制或不復制組織病變高度活動時,病毒和抗原已被部分清除可能是病毒變異HBsAg(-)仍有可能HBV感染,排除檢測試劑靈敏度問題,可能是血清中含量的差異乙肝表面抗體(HBsAb)當失去 HBsAg后的恢復指標疫苗注射后的免疫性評價指標在HBV感染恢復期時:多克隆抗體做試劑時,出現(xiàn)HBsAg和HBsAb都為陰性的所謂“窗口期”單克隆抗體做試劑時,3%的病人出現(xiàn)HBsAg和HBsAb都為陽性單一低濃度的HBsAb可能是假陽性(用一步反應夾心法的試劑)單一單克隆抗體的使用會漏檢(亞型或變異)乙肝核心抗體(HBcAb)表示現(xiàn)在或以前感染與恢復或免疫無必然聯(lián)系由

4、于HBcAg的高免疫原性,故HBcAb產(chǎn)生比HBsAb早且多,持續(xù)時間長(長達數(shù)十年)在我國正常人群中有10%的單一HBcAb(+)高濃度的HBcAb表示現(xiàn)行感染,常與HBsAg并存,主要是IgM,伴肝損傷,肝功能指標異常低濃度的HBcAb表示過去感染,常與HBsAb共存,主要是IgG,無肝損傷或已靜息HBcAb含IgM,IgA和IgG,在感染中依此出現(xiàn)和消失,IgG長期存在乙肝核心抗體IgM(HBcIgM)表示急性感染發(fā)病一周出現(xiàn)占90%,也有1個月持續(xù)時間2134周,14%超過1年高滴度是診斷急性乙肝的“標準”(但需特殊標定)IgM(+),即使HBsAg(-),也可診斷急性肝炎IgM(-)

5、,即使HBsAg(+),卻可能是慢性HBV感染重疊其它病原的急性病變暴發(fā)性乙型肝炎:可檢出48倍的IgM濃度慢性乙型肝炎:肝細胞破壞,釋放HBcAg產(chǎn)生免疫應答,可檢出低水平IgM反應肝組織炎癥:濃度與炎癥程度相關反應病毒復制和干擾素治療的監(jiān)控:對-干擾素有效治療的慢性乙肝病人,在Hbe血清轉(zhuǎn)換前常有IgM滴度升高,后降至治療前水平乙肝e抗原(HBeAg)病毒復制相關,常與HBV-DNA水平一致于急性慢性感染中存在缺乏的話, 不代表病毒復制不存在在中國,30%的HBV感染者HBeAg(+),其中:80%自然陰轉(zhuǎn)10%持續(xù)HBeAg(+)10%應病毒變異而陰性藥物治療的一個監(jiān)測指標多個國際著名藥

6、廠肝炎治療藥物的評價,如Glaxo的拉米呋定,施貴寶的恩替卡韋,Roche公司的干擾素等,包括全國唯一一家CAP認證的實驗室-美迪生(MDS),使用雅培的肝炎試劑進行藥物臨床評估乙肝e抗體(HBeAb)當與 HBeAg 消失出現(xiàn)表示病毒復制漸趨靜息HBe血清轉(zhuǎn)換似為HBV感染過程的一個轉(zhuǎn)折點但在慢性活動性肝病HBeAb(+)未必表示病毒不復制有些HBeAg消失后不出現(xiàn)HBeAb當與 HBV-DNA 并存時可能表示前C區(qū)變異只有一種IgG抗體在HBV感染病人中,HBeAg和HBeAb同時陽性的有34%乙肝血清指標一般簡圖不一致或不常見的血清指標模式HBsAg 陽性 AntiHBc陰性HBsAg，

7、Anti-HBs 和 AntiHBc陽性單一AntiHBc陽性HBsAg陰性，HBeAg陽性HBeAg和Anti- Hbe同時陽性單一HBsAg急性HBV感染的早期,應隨之出現(xiàn)HBeAg,HBc-IgM,如仍單獨出現(xiàn),需做確認在慢行HBV感染中,HBsAg和HBcAb共存占95%,并常伴HBeAg或HBeAb,無HBe可出現(xiàn)在轉(zhuǎn)換“窗期”,或感染恢復期HBeAb已消失,HBsAg不伴HBcAb很少見,一旦出現(xiàn)為HBcAb缺失單一HBsAb注射HB疫苗或高價乙肝免疫球蛋白(HBIG)正常人群(非人工免疫)有510%的陽性率如濃度較低,注意非特異性反應一般為IgM抗體,無保護性,仍可再感染HBVH

8、BsAg和HBsAb并存少數(shù)感染恢復期可出現(xiàn),常規(guī)試劑可能是非特異性反應在慢性HBV感染者中有35%二者共存,但并不表明HBsAg的清除或感染的恢復,可能是:前后感染二種HBV亞型,或HBsAg與抗體間低親和反應S基因變異,HBsAg抗原性改變,原型HBsAb不能清除IFN治療出現(xiàn)HBsAb血清轉(zhuǎn)換,因S基因變異,而未能清除HBsAgHB疫苗接種,有正常的HBsAb應答HBsAg(-)而HBeAg(+)編碼HBeAg的基因片段的短暫整合Source: Lau JNY, et al. J Hepatol, 1993;17: 258HBV感染,但HBcAb(-)抗原復合:高HBV復制,HBcAb被

9、過量的HBcAg所掩蔽種族差異:我國7個民族的HBV感染,HBcAb缺失3.440%免疫缺陷:缺乏HBcAg特異的T細胞,體外無淋巴細胞增殖反應,單核細胞不能吞噬HBcAg顆粒,可能是抗原提呈細胞的缺陷HBsAg攜帶母親出生的嬰兒,由于母體的HBcAb的阻斷,可無HBcAb的應答在免疫缺陷病人中出現(xiàn)腫瘤病人化療所引起的免疫耐受病毒變異:前C區(qū)缺失和其它變異單一的HBcAb(+)小孩:HBsAg(+)的母親由于胎盤的屏障不能傳遞HBsAg給胎兒,但HBcAb可通過,出生后將逐漸消失成人:感染后恢復感染后恢復: :急性感染后“窗期”,主要是IgM抗體,隨后出現(xiàn)HBsAb,但也可由于免疫應答較低未產(chǎn)

10、生HBsAb,也可出現(xiàn)HBsAb后再消失低水平感染狀態(tài)低水平感染狀態(tài): :單一HBcAb(+)活動性慢性肝炎病人,60%可檢出HBV-DNA(+),單一HBcAb(+)的“健康”人中,30%可檢出病毒.這種無癥狀攜帶狀態(tài),可較長時間存在(注意數(shù)學后感染).相對濃度越高,HBV-DNA的檢出率越高,低相對濃度常預示過去感染不常見模式的問題解釋用新波試劑有部分病例不符常見模式原因:試劑靈敏度提高病毒變異,亞型抗原復合物的形成主動或被動免疫的表現(xiàn)藥物治療的表現(xiàn)種族差異免疫缺陷或耐受對于這些情況,建議繼續(xù)跟蹤75-85%75-85%急性發(fā)病急性發(fā)病血清轉(zhuǎn)換圖血清轉(zhuǎn)換圖慢性乙肝攜帶者后期慢性乙肝攜帶者后

11、期( (小三陽小三陽) )慢性乙肝攜帶者無血清學轉(zhuǎn)變慢性乙肝攜帶者無血清學轉(zhuǎn)變( (大大三陽三陽) )乙肝表面抗原乙肝表面抗原“消失消失”變異變異什么是 HBsAg 消失變異? 當感染乙肝病毒后，病毒在人體內(nèi)復制當病毒復制時，變異會自然發(fā)生。在某些條件下，會加速其發(fā)生變異是改變了核酸序列，從而導致氨基酸序列的改變對于選擇性壓力下，乙肝 HBsAg 變異可能會出現(xiàn)在疫苗和治療中如: HBIG 治療。野生型的HBV可能被中和，而變異株仍然存在，并具有活性References: Oon, C.J. et al. 1995. Molecular epidemiology of Hepatitis B

12、virus vaccine variants in Singapore. Vaccine 13: 699-702. Coleman, P.F. et al. 1999. Immunoassay Detection of Hepatitis B Surface Antigen Mutants. Journal of Medical Virology 59: 19-24. Hunt, C.M. et al. 2000. Clinical Relevance of Hepatitis B Viral Mutations. Hepatology 31: 1037-1044.HBsAg消失變異在哪些情況

13、下經(jīng)常發(fā)生至少有以下三種情況: 1) 在HBsAg陰性個體中仍有HBV存在 2) 對于母親HBsAg陽性，新生兒疫苗接種失敗 3) 對于正位肝移植，免疫預防劑失敗(OLT) Reference: Locarnini, S. A. 1998. Hepatitis B Virus Surface Antigen and Polymerase Gene Variants: PotentialVirological and Clinical Significance. Hepatology 27: 294 - 297. orthotopic哪些是最常發(fā)生的HBsAg 變異通常于免疫區(qū)段稱 “a” 決定

14、簇,aa124-147其中更容易變異的為接近于aa141145(此部位是抗體必需結(jié)合的部位)。最多的據(jù)報道是Gly-145-Arg抗原,抗體是免疫反應的核心!References: Coleman, P. F. et al. 1999. Immunoassay Detection of Hepatitis B Surface Antigen Mutants. J. Med. Virol. 59: 19 - 24. Ijaz, S. et al. Novel Immunoassay for the Detection of Hepatitis B Surface Escape Mutants a

15、nd Its Application in Liver Transplant Recipients. J. Med. Virol. 63: 210 - 216. 為什么HBsAg變異重要Kalinina et al.第一個報道，HBV S 于暴肝中分離的變異導致嚴重的病毒分泌缺陷，此現(xiàn)象造成細胞迅速死亡，而肝衰竭。Gly 145 Arg 為其中的一個變異造成暴肝。Kalinina, et al. 2001. A Dominant Hepatitis B Virus Population Defective in Virus Secretion Because of Several S-Gene

16、 Mutations from a Patient With Fulminant Hepatitis. Hepatology 34: 385 - 394.為什么HBsAg變異重要影響乙肝防疫(疫苗),流行(血站, 醫(yī)院篩查)和診斷假陰性結(jié)果將會產(chǎn)生不必要的復雜性或延誤診斷.漏檢漏檢HBsAgHBsAg部分后果部分后果q90% 感染HBV 的新生兒將成為慢性攜帶者。根據(jù)美國CDC的統(tǒng)計此人群中的死亡率為 15-25% (見CDC website )q美國 CDC 估計美國 22,000 HBV陽性的母親將產(chǎn)子。有變異情況的約 1.0-4.6%。所以在美國此人群中

17、, 每年有220-1012 人發(fā)生變異未經(jīng)統(tǒng)計的其他人群的漏檢未經(jīng)統(tǒng)計的其他人群的漏檢q長期慢性乙肝病人的病毒突變q經(jīng)歷多種治療方案的乙肝病人-治療壓力q病毒復雜共感染人群q免疫系統(tǒng)疾病的乙肝人群q其他(移植等)低水平HBsAg測定的重要性國內(nèi)低水平HBsAg病人的分布情況正常人群中低水平的HBsAg(5ng/ml)為23%在HBsAg(+)人群中占2324%其中1ng/ml占45%左右(在低水平HBsAg樣品中)提高檢測靈敏度的重要性中國肝炎人口多,基數(shù)大造成確診的困難醫(yī)院內(nèi)的感染輸血傳播母嬰傳播的阻斷HBsAb定量在疫苗評估中的推薦German Permanent Vaccination

18、Commission(STIKO)國內(nèi)疫苗評價標準無應答者:無抗體產(chǎn)生(5%人群百分比) - 加強計量復種低應答者:100mIU/ml (20%人群百分比) 無須復種德國STIKO疫苗評價推薦無應答者:無抗體產(chǎn)生 - 復種并隨訪Anti-HBs低應答者:100mIU/ml 10年后復種 血清乙肝標志物（兩對半）定性測定始于80年代中期，對乙肝的疾病診斷、病程監(jiān)測、療效觀察起到了一定的作用。肝炎的恢復是一個動態(tài)過程，用陽性或陰性來判定結(jié)果會給臨床帶來許多困惑。隨著臨床醫(yī)學的迅速發(fā)展，定性檢測已遠遠不能滿足臨床及患者的要求。由于受檢測抗原抗體“定性”結(jié)果不是“陰性”就是“陽性”，只能作程序式的、機

19、械的判斷，對某些結(jié)果不能作出合理解釋，存在較大的缺陷，無法動態(tài)觀察病情和療效變化，為臨床所能提供的信息有限。隨著醫(yī)學檢驗中新型標記方法的建立（時間分辨熒光免疫分析技術），使得“兩對半”定量測定成為可行，大大彌補了酶標（ELISA）定性檢測的不足之處。乙肝“兩對半”檢測歷史提高了檢測的靈敏度 時間分辨熒光免疫技術（TRF）檢測HbsAg靈敏度可達0.2ng/ml，而酶標（ELISA）檢測HbsAg靈敏度是1ng/ml，也就是說只有血清中的HbsAg達到1ng/ml酶標才會呈陽性。 急性乙肝早期診斷 急性乙肝早期：TRF定量能及早檢出HbsAg，確證HBV感染，幾乎能與preS1同時檢測，在病程觀

20、察中大大縮短“窗口期”時間，而酶標在乙肝早期檢測往往HbsAg呈陰性。慢性乙肝：一些患者由于機體對HBV包膜蛋白(HbsAg)表達較低，酶標檢測可出現(xiàn)HbsAg和抗-Hbs均陰性的情況，而TRF技術則可避免這些情況的出現(xiàn)，為正確判斷病情提供依據(jù) 變異病毒的檢測病毒發(fā)生變異后，表達量較低，常規(guī)ELISA測不出抗原，而TRF定量具有極高的靈敏度，可發(fā)現(xiàn)并極有可能同時檢測出HbsAg和抗-Hbs。血清中HbsAg含量和病人對HbsAg細胞免疫成反比關系，而肝功能改變則與此種細胞免疫成正比。定量HbsAg是反映這一關系的唯一手段。 一些群體如醫(yī)護工作者、病人家屬等，由于長期密切接觸，但又非直接經(jīng)血傳播

21、感染成急性乙肝，而是長期少量感染，并刺激機體產(chǎn)生一定的免疫力，可能呈低濃度感染，特別應當引起人們的足夠重視，密切關注并采取措施防止發(fā)展成乙肝或慢性攜帶者。發(fā)現(xiàn)低濃度HbsAg攜帶者 以動態(tài)觀察療效和病情監(jiān)測疾病的發(fā)生、發(fā)展、療效、預后是一個動態(tài)的變化的過程，TRF定量檢測乙肝“兩對半”各項標志物的濃度變化可對乙肝的病程、治療、預后起一個全程動態(tài)檢測的作用，能夠為醫(yī)生對病情療效作出合理的解釋提供依據(jù)，指導治療。 HbsAg和抗-Hbs的動態(tài)變化定量分析HbsAg和抗-Hbs的濃度變化，可以預見急性乙肝是否處于恢復期。如HbsAg濃度降低，抗-Hbs的濃度逐漸升高，可說明病情正往恢復期發(fā)展。反之，

22、HbsAg濃度處于較高水平或上升趨勢，而抗-Hbs一直處于較底水平，則容易發(fā)展為慢性乙肝或攜帶者。 HbeAg和抗-Hbe的動態(tài)變化定量分析HbeAg和抗-Hbe的濃度變化，可以反映病情變化和治療效果。定量測定能明確檢測HbeAg向抗-Hbe轉(zhuǎn)換的時期，即表現(xiàn)為HbeAg濃度（NCU）下降和抗-Hbe濃度（NCU）升高的過程。高濃度的HbeAg還可間接提示病毒處于高復制狀態(tài)，具有較高的傳染性。高濃度的抗-Hbe一方面提示病情的好轉(zhuǎn)，而在某些時候（如肝功能指標很差）可能與肝壞死、肝硬化、肝癌有關?？?Hbc指標的變化抗-Hbc濃度的高低可以反映病毒感染的狀態(tài)。高濃度的抗-Hbc提示乙肝急性感染，

23、恢復期濃度降低。慢性乙肝呈抗-Hbc持續(xù)高濃度。而低濃度的抗-Hbc一般為恢復期或既往感染。有利于對慢性肝炎活動性和非活動性的判斷。非活動性慢性乙肝各項指標相對穩(wěn)定，活動性往往呈進行性變化。一步法(固相載體,樣品和標記物同時一起孵育,并在最后檢測前只有一步?jīng)_洗)，這對較多干擾物質(zhì)的疾病，如:肝炎，甲狀腺激素和腫瘤標志物，容易產(chǎn)生干擾而使分析的靈敏度和特異性都受到影響二步法(二個沖洗步驟，一次在固相載體和樣品孵育之后，第二次在加入標記物孵育之后)可以確保好的結(jié)果。如：消除非特異性蛋白結(jié)合，內(nèi)源性的干擾物質(zhì)和HOOK效應兩步?jīng)_洗法-可避免此效應高濃度樣品高濃度的結(jié)合物前帶/后帶效應的機制固相載體一步法 和 兩步法 比較一步法一步法優(yōu)點：相同的其他因素時，一步法可增加靈敏度可降低成本，包括：勞動力和時間，自動化儀器缺點：夾心法有HOOK效應(10000ng/ml)非特異性反應其他樣本質(zhì)素的干擾兩步法兩步法優(yōu)點： 特異性較好 無HOOK效應 結(jié)果穩(wěn)定，精密度較好 仍具有相當?shù)撵`敏度（其 它因素有提高空間）缺點： 成本相對略高 一般操作時間延長 HbeAg陽性慢性肝炎，由于HBV野生型感染引起，其自然史分HbeAg陽性期和抗-Hbe陽性期。定量測定能明確檢測HbeAg向抗-Hbe轉(zhuǎn)化的時期，即表現(xiàn)為HbeAg濃度（NCU）的下降和抗-Hbe（NCU）濃度（NCU）升高的過程?？?Hb