醫(yī)院醫(yī)療機(jī)構(gòu)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)及應(yīng)用介紹

1、結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)及應(yīng)用主講：xxx 時(shí)間：xx年x月x日Diagnostic technology and applications01.結(jié)核病檢測技術(shù)發(fā)展目 錄02.免疫學(xué)檢測 03.結(jié)核DNA檢測技術(shù)04.常見的RNA檢測技術(shù)結(jié)核病檢測技術(shù)發(fā)展Logo Click here to enter your text and change the color or size of the textPart 01全球范圍內(nèi)結(jié)核病疫情急劇惡化全球1/3人口（約20億）已感染了結(jié)核菌， 人口的大規(guī)模流動(dòng)結(jié)核病與艾滋病同時(shí)流行結(jié)核菌耐多藥菌株的出現(xiàn)我國是世界上僅低于印度和印尼的第三結(jié)核病大國患病率高

2、， 新發(fā)患者93萬/年，結(jié)核菌感染率為約40 死亡率高，每年死亡人數(shù)達(dá)13萬耐藥率高早期快速診斷與治療成為制約結(jié)核病防控的關(guān)鍵因素常規(guī)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測方法診斷陽性率不到60。細(xì)菌學(xué)檢測的新方法發(fā)光二極管熒光顯微鏡（LED）液體培養(yǎng)（可同時(shí)縮短培養(yǎng)時(shí)間）自動(dòng)化涂片/染色技術(shù)（夾層杯法）分枝桿菌固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)比較液體培養(yǎng)（BD MGIT960）固體培養(yǎng)（羅氏L-J）疑似新發(fā)患者報(bào)陽時(shí)間（d）13.637.1428.6710.04復(fù)診患者報(bào)陽時(shí)間(d)22.949.5528.5310.40疑似新發(fā)患者陽性率32.00%17.90%復(fù)診患者陽性率9.30%2.60%污染率6.57%4.0%免疫學(xué)檢

3、測 Logo Click here to enter your text and change the color or size of the textPart 02WHO關(guān)于血清學(xué)檢測聲明2011年7月20日，世界衛(wèi)生組織（ WHO ）正式聲明，要求禁止將 血清學(xué)檢測方法 （抗原，抗體，蛋白芯片等）用于肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷。WHO warns against the use of inaccurate commercialserological tests for pulmonary and extra-pulmonaryTB.蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展 3、4、7種結(jié)核桿菌優(yōu)勢表位抗原（16KD

4、、38KD、MPT64、ESAT-6、CFP10、Mtb8、Mtb8.4、 Mtb16.3）制備多靶點(diǎn)蛋白微陣列大量的文獻(xiàn)報(bào)道其敏感性特異性均顯著高于涂片與培養(yǎng)法可用于結(jié)核病的臨床輔助診斷，提高痰涂片和痰培養(yǎng)假陰性的檢測率結(jié)核桿菌特異抗原：ESAT-6與CFP10ESAT-6 : 早期抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6）CFP10 : 培養(yǎng)濾液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10）由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丟失RD1和RD2絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌(NTM)也不存在RD1和RD2區(qū)準(zhǔn)

5、確T-SPOT臨床診斷性能只針對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群敏感，與絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無交叉反應(yīng)美國FDA數(shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：特異性94.1%(478/508) 靈敏度基本不受免疫力低下/受抑制影響，在肺外結(jié)核患者中有很高的檢出率美國FDA數(shù)據(jù)：靈敏度95.6%(175/183)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：靈敏度95.3%(624/655)特異性 T-SPOT相關(guān)指南T-SPOT.TB是采用-干擾素釋放試驗(yàn)（IGRA）原理，獲得美國FDA認(rèn)證、歐盟CE認(rèn)證和首個(gè)中國CFDA認(rèn)證的商業(yè)化產(chǎn)品列入歐美25個(gè)國家結(jié)核診療指南 2011年英國NICE指南、2010年美國最

6、新結(jié)核診療指南、 2010年加拿大結(jié)核指南美國CDC推薦卡介苗（BCG）接種人群結(jié)核感染檢測首選 國內(nèi)風(fēng)濕科和消化科已列入專家共識(shí)T-SPOT.快速T-SPOT的實(shí)驗(yàn)步驟假陰性：感染階段不同（窗口期）少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不全/基礎(chǔ)疾病的情況，如HIV感染者、腫瘤患者、嬰幼兒等特殊肺外結(jié)核：結(jié)核性腦膜炎、粟粒性結(jié)核靈敏度相對較低實(shí)驗(yàn)非正常操作：細(xì)胞計(jì)數(shù)不夠等T-SPOT結(jié)果解讀-陰性結(jié)果T-SPOT的應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)：使用血液標(biāo)本，取樣簡單；可用于肺內(nèi)和肺外結(jié)核檢測；陰性預(yù)測值很高，可用于排除結(jié)核感染。缺點(diǎn)： 陽性預(yù)測值約80%，不能用于結(jié)核的確診 不能確定是否是肺結(jié)核（肺外） 不能區(qū)分是活動(dòng)性和潛伏性結(jié)核

7、不能區(qū)分某些非結(jié)核分枝桿菌（堪薩斯、蘇氏、戈登、海 分枝桿菌） 操作復(fù)雜，時(shí)間長；對于原發(fā)感染初期或免疫低下人群，可能存在假陰性。結(jié)核DNA檢測技術(shù)Logo Click here to enter your text and change the color or size of the textPart 03熒光定量 PCR是應(yīng)用最為廣泛的TB-DNA定量PCR檢測方法具有靈敏度高（10CFU/ml）、特異性強(qiáng)、線性關(guān)系好、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）是在恒溫下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，因此操作更為簡便，反應(yīng)更加快速。65擴(kuò)增40min即可用肉眼觀察結(jié)果。擴(kuò)增陽性標(biāo)本呈現(xiàn)綠色熒光，反之

8、為陰性。是結(jié)核分枝桿菌DNA檢測技術(shù)的代表-靈敏、快速、特異、簡捷將會(huì)極大地推動(dòng)結(jié)核病的防治工作同時(shí)鑒定MTC與21種NTMMSM恥垢分枝桿菌 MTC結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群MTR次要分枝桿菌MIN胞內(nèi)分枝桿菌MAV鳥分枝桿菌MGA胃分枝桿菌MKA堪薩斯分枝桿菌MSC瘰癘分枝桿菌MUA母牛分枝桿菌MCH龜分枝桿菌龜亞種MAB龜分枝桿菌膿腫亞種MSZ蘇爾加分枝桿菌MMA海/潰瘍分枝桿菌MXE蟾蜍分枝桿菌MDI迪氏分枝桿菌MFO偶發(fā)/豬分枝桿菌MGI淺黃分枝桿菌MSI猿猴分枝桿菌MTE土分枝桿菌MPH草分枝桿菌CC質(zhì)控點(diǎn)MNO不產(chǎn)色分枝桿菌MGO戈登分枝桿菌 GeneXpert應(yīng)用TB復(fù)合群鑒定。利福平

9、耐藥檢測 。WHO推薦XpertMTB/RIF檢測試劑活菌檢測技術(shù)，可用作肺結(jié)核治療效果評估據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道：每個(gè)結(jié)核分枝桿菌含有約2000個(gè)拷貝rRNA研究表明：rRNA與結(jié)核分枝桿菌的生活力有著很好的相關(guān)性， rRNA可以反映結(jié)核分枝桿菌的死菌活菌狀態(tài)研究表明：在用藥治療期內(nèi)，隨著結(jié)核分枝桿菌的死亡，rRNA大約在7天左右時(shí)間全部降解。而DNA含量幾乎保持不變常見的RNA檢測技術(shù)Logo Click here to enter your text and change the color or size of the textPart 04 TBSAT 檢測技術(shù)靈敏 檢測下限1-10條菌/ml污

10、染率低 RNA易降解，環(huán)境中存在時(shí)間短快速 42恒溫?cái)U(kuò)增,30分鐘內(nèi)擴(kuò)增10億倍特異 rRNA特異性非常高簡便 無提取步驟，擴(kuò)增結(jié)束即得出結(jié)果。 SAT技術(shù)是將核酸恒溫?cái)U(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光 檢測相結(jié)合的一種新型RNA檢測技術(shù)。RNA診斷技術(shù)的優(yōu)勢靈敏度高：RNA DNA拷貝數(shù)與臨床相關(guān)性好：區(qū)分“死活菌”：可以診斷“活動(dòng)性感染”：活動(dòng)性感染：RNA轉(zhuǎn)錄活躍潛伏感染：RNA不轉(zhuǎn)錄不易污染：靶標(biāo)和擴(kuò)增產(chǎn)物都是RNATB-SAT檢測區(qū)分MTB和NTMNovel Real-Time Simultaneous Amplification and Testing Method To Accurately and

11、 Rapidly Detect Mycobacterium tuberculosis Complex J.Clin.Microbiol.2012,50(3):646.DOL:10.1128/JCM.05853-11.結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTB）：人型結(jié)核分枝桿菌牛型結(jié)核分枝桿菌非洲型結(jié)核分枝桿菌非結(jié)核分枝桿菌（NTM）：研究表明，TB-SAT可以區(qū)分如下NTM：堪薩斯分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、龜分枝桿菌、戈登分枝桿菌、海分枝桿菌等18種活菌檢測技術(shù)，可用作肺結(jié)核治療效果評估據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道：每個(gè)結(jié)核分枝桿菌含有約2000個(gè)拷貝rRNA研究表明：rRNA與結(jié)核分枝桿菌的生活力有著很好的相關(guān)性， rRNA可以反映結(jié)核分枝桿菌的死菌活菌狀態(tài)研究表明：在用藥治療期內(nèi)，隨著結(jié)核分枝桿菌的死亡，rRNA大約在7天左右時(shí)間全部降解。而DNA含量幾乎保持不變SAT與培養(yǎng)的監(jiān)測結(jié)果一致監(jiān)測項(xiàng)目 陽性患者數(shù)（%）0月0.5月1月2月4月6月集菌涂片150（100.0）53（35.3）20（13.3）9（6.0）4（2.7）6（4.0）羅氏培養(yǎng)150（100.0）83（55.3）32（21.3）16（10.7）12（8.0）12（8.0）TB-PCR148（98.7）84（56.0）47（31.3）20（13.3）12（8.0）13（8.7）SAT法150（100.0）86（57.3）35