臨床實驗室管理：第四章 實驗方法選擇與檢測系統(tǒng)的性能評價

1、第四章 實驗方法選擇與檢測系統(tǒng)的性能評價學習目的了解新實驗方法的評價標準：實驗室在建立新的方法時，應對方法的基本特性進行評價，以掌握方法的特性，判斷其能否滿足臨床使用要求。評判實驗方法是否規(guī)范，方法的優(yōu)劣，方法是否具有臨床應用價值。第一節(jié)實驗方法選擇實驗方法分級根據(jù)分析方法的正確度和精密度不同分類：1.決定性方法(definitive method)，經(jīng)詳盡研究尚未發(fā)現(xiàn)不準確度或不確定性原因的方法；2.參考方法(reference method)，經(jīng)詳盡研究證實其不準確度與不精密度可以忽略的方法；3.常規(guī)方法(routine method)，可滿足臨床或其它目的需要的日常使用方法。實驗室應根據(jù)

2、檢測工作的需要，選用不同的分析方法。對大多數(shù)實驗室來說，應用廣泛的方法是常規(guī)分析方法。臨床檢驗方法學分類分析物決定性方法參考方法CaID-MS（同位素稀釋）原子吸收分光光度法Cl電量滴定中子活化法電流滴定法KID-MS中子活化法火焰光度法Na重量分析法中子活化法 火焰光度法臨床檢驗方法學分類分析物決定性方法參考方法UreaID-MS尿素酶法GLUID-MS己糖激酶法TBIL-重氮法ALB-免疫化學法TP-凱氏定氮法臨床檢驗方法分類項目名稱決定性方法參考方法常規(guī)方法HbA1c-IFCCNGSP色譜免疫血細胞計數(shù)-ICSH（國際血液學標準化委員會）血細胞分析儀常規(guī)方法參考方法決定性方法準確度應用范

3、圍不同方法間的關系實驗方法選擇原則1.實用性 微量快速、操作簡便、安全無毒、價格低廉；2.可靠性 較高的正確度和精密度，較大的檢測能力。 參考物（標準品）分級1.一級參考物(Primary reference material)，一種穩(wěn)定而均一的物質，數(shù)值由決定性方法確定；2.二級參考物(Secondary reference material)，實驗室自己配置或者商品，數(shù)值由參考方法確定；3.其他參考物（校準物和控制物） 校準物：校準品 控制物：陰性對照和陽性對照實驗方法選擇基本步驟1. 提出問題；2. 收集資料；3. 選定候選方法；4. 候選方法的初步評價主要內容；5. 候選方法的方法學評

4、價。第二節(jié)誤差、測量不確定度及計量學溯源誤差1. 系統(tǒng)誤差（systematic error, SE）； 可用測量正確度反映SE情況 2. 偶然誤差（random error, RE）； 可用測量精密度反映RE的影響程度3. 抽樣誤差（sampling error） 樣品含量越大，抽樣誤差越小測量不確定度測量不確定度（uncertainty of measurement）: 真值不可知，任何測量結果都具有不確定性，反映對測量結果的懷疑程度。A類標準不確定度（統(tǒng)計分析方法得出）； B類標準不確定度（非統(tǒng)計分析方法得出）計量學溯源性計量學溯源性（metrological traceability）

5、: 通過校準鏈，使測量結果能夠與規(guī)定的參考標準聯(lián)系起來的特性。 臨床檢驗結果的溯源性主要由廠家建立。 溯源性和不確定度成反比。第三節(jié)檢驗系統(tǒng)性能評價檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)（testing system） 完成一項檢驗項目涉及的測量方法、儀器、試劑、校準物、質控品、消耗品、操作程序、質量控制程序等因素的組合。檢測系統(tǒng)性能評價六大指標： 1.精密度； 2.正確度； 3.靈敏度； 4.特異度； 5.可報告范圍； 6.參考區(qū)間。1.精密度評價精密度 相同條件下，同一個樣品多次測量結果的一致性。精密度和偶然誤差成反比。重復性實驗是評價方法精密度的途徑：批內重復性實驗；日內重復性實驗；日間重復性實驗。2. 正確

6、度評價正確度： 無限多次測量均值與被測量真值間的一致程度，反映系統(tǒng)誤差情況。正確度評價方法：回收實驗；干擾實驗；方法比較實驗。a.回收實驗 回收實驗： 用于評估實驗方法正確測定在常規(guī)樣品中加入的被測量物的（質量、濃度、活性）能力，通過測定比例系統(tǒng)誤差，對實驗方法的正確度進行評價?；厥諏嶒瀾獫M足以下基本要求：使用常規(guī)樣品基質，如血清或血漿；如果加入的被測物為液體，應盡可能減少其在樣本中的體積比，一般應控制在10%以內保證樣品基質的一致性，原始樣品中應加入不含被測物的相同溶液，作為基礎樣品加入的物質能夠實現(xiàn)準確定量，如稱重、使用標準物質或標準液應選擇有臨床意義的濃度加入基礎樣品，一般加入的濃度應有

7、3個或以上不同的濃度水平，并保證對實驗樣本最終的測定結果在檢測方法的線性范圍內?；厥章?=加入濃度回收濃度100%加入濃度=標準液濃度基礎樣品體積標準液體積標準液體積回收濃度=樣本最終測定濃度基礎樣本濃度理想狀態(tài)時的回收率為100%，誤差大的方法其回收率低，準確度較差。b.干擾實驗臨床實驗室測量過程中，干擾物質可以是測量誤差的重要來源。任何一個測量程序都可能存在干擾物質。干擾形成的機制通過與檢測試劑競爭或抑制指示反應；干擾物具有與被測物相似的性質；干擾物可以改變樣品基質的物理性狀；干擾物可通過屏蔽金屬離子（激活劑）、結合活性位點、氧化巰基等改變酶（被測物或試劑）的活性，也可以競爭酶反應過程中的

8、關鍵底物；干擾物發(fā)生與被測物相似的反應；在免疫化學反應過程中，干擾物結構與抗原類似，而與相應抗體發(fā)生交叉反應。c.方法比較實驗 實驗室中使用的檢測方法，隨著科學技術的發(fā)展不斷更新，在引進新方法前或用一種方法替代另一種方法時為保證實驗室檢測結果的連續(xù)性，通常要進行方法學比對和偏差分析，以分析不同的分析方法在測定同一分析項目時結果的差異。 方法學比較實驗要點 在方法學比較中，常將新方法稱為實驗方法；與之比較的方法稱為比較方法。作方法學比較實驗時，有下列幾點應予以考慮。樣品要求 用于方法學比對實驗的樣品，應來源于健康人或患者，無明顯干擾因素，性質穩(wěn)定，并應盡量避免使用儲存樣品。全部樣品應在醫(yī)學決定水

9、平或臨床有意義的范圍內均勻分布。樣品總數(shù)至少為40例，增加樣品數(shù)量可提高可信性?？刹捎脧S家要求的實驗室常規(guī)方法或公認的參考方法。前者注重對方法間偏差的評估，后者偏重于實驗室結果準確度或正確度的評估。對比方法應具有好的精密度，沒有已知的干擾物，與實驗方法單位相同，相對國家標準或參考方法的偏差為已知。 對比方法實驗數(shù)據(jù)的收集和處理1不采用已明確有人為誤差的結果。2將所有無明顯誤差的實驗結果記錄下來。但是，若兩方法結果差值大于任一方法的批內精密度，應查對標本，并重新實驗。若找不出原因，應保留數(shù)據(jù)備考。3. 整個實驗一定要有內部質量控制，失控時結果必須重做。 3. 靈敏度評價檢測限（limit of

10、detection） 也稱分析靈敏度，指檢測系統(tǒng)可檢測出的最低分析濃度。 設置空白樣品，檢測次數(shù)10-20次4.特異度評價 特異度（Specificity, Spe） 又稱特異性或者真陰性率。 無病受試者被判斷為陰性的百分率。 理想的特異度為100%。5.可報告范圍評價 可報告范圍（reportable range） 測量方法可以報告的所有結果范圍； 線性是分析方法重要性能之一。 建立線性范圍的實驗應使用7-11個濃度水平的樣品。6.參考區(qū)間評價 實驗室為檢驗項目提供可靠的參考區(qū)間。選擇合適的統(tǒng)計方法確定95%參考范圍。參考區(qū)間評價 參考區(qū)間建立；參考區(qū)間驗證實驗。定性實驗的臨床應用在臨床實驗

11、室中，定性試驗可用于篩查、診斷、確認、或監(jiān)測為目的的測定。試驗的敏感性、特異性、預測值和效率等，決定了其在臨床應用的范圍。從臨床應用的角度講，定性實驗可分為篩查實驗、診斷實驗和確證實驗。篩查實驗（screening tests）篩查實驗通常用于對整個人群或特定人群中是否存在初測物的檢查，如：大便潛血實驗。通常要求檢驗方法有較高的敏感性，以保證不漏掉真陽性結果。一般情況下，篩查實驗可能產生假陽性結果，但在有較好的確認實驗及不會帶來嚴重后果的前提下，還是很有益處的。 診斷實驗（diagnostic tests）定性實驗用于特定疾病的診斷或臨床可疑指征的判斷，如微生物學培養(yǎng)與細菌鑒定。通常情況下，診

12、斷性實驗要求方法學同時具有較好的敏感性和特異性。在有確認實驗的條件下，可以適當放寬對方法學特異性的要求。確認實驗（confirmatory tests）確認實驗通常在篩查實驗和診斷實驗之后進行，對已做出的檢驗結果進行驗證和確認，以幫助臨床醫(yī)生做出正確的臨床診斷。確認實驗一般設計為有較好的特異性和較高的陽性預測值，如使用熒光密螺旋體抗體吸收實驗（FTA-ABS）作為梅毒初篩實驗的確認實驗。臨界值（cutoff）實驗結果處于（陰、陽性）分界點時的樣本中分析物濃度值；低于此值，定性實驗的結果為陰性；高于此值，定性實驗的結果為陽性。對定性實驗來講，臨界值是唯一的醫(yī)學決定水平。臨界值（cutoff）當樣本中被測物濃度處于臨界水平時，定性實驗重復檢查同一樣本，將產生50%的陽性結果和50%的陰性結果。當樣本濃度在臨界值以上增加時，陽性結果比率增加；而當樣本濃度在臨界值以下減低時，陰性結果比率增加。臨界值的95%區(qū)間當樣本濃度