2提質(zhì)粒_XXXX年分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)ppt課件

1、實(shí) 驗(yàn) 一質(zhì)粒DNA的提取及鑒定.背景實(shí)際知識(shí)Section 1.掌握質(zhì)粒信息和用途，學(xué)會(huì)本人看質(zhì)粒圖譜掌握快速提取小量質(zhì)粒DNA的方法了解質(zhì)粒DNA提取的根本原理掌握瓊脂糖凝膠電泳的方法1.1.1 實(shí) 驗(yàn) 目 的.1.1.2 載 體定義：基因工程中攜帶目的基因進(jìn)入宿主 細(xì)胞進(jìn)展擴(kuò)增和表達(dá)的工具。類型：大腸桿菌中的質(zhì)粒、噬菌體、M13噬菌體、噬菌粒外，還有酵母人工染色體載體及動(dòng)、植物病毒載體等。.載體的根本條件復(fù)制子：一段具有特殊構(gòu)造的DNA序列，使與之結(jié)合的外源基因復(fù)制。可檢測(cè)的遺傳表型：如抗藥性、顯色表型反響。限制性內(nèi)切酶的單一識(shí)別位點(diǎn)：便于外源基因的插入。適宜的拷貝數(shù)：較高的拷貝數(shù)不僅有

2、利于載體的制備；使細(xì)胞中克隆基因的劑量添加。1.1.2 載 體.質(zhì) 粒 載 體是染色體外小型的雙鏈環(huán)狀的DNA，常用載體之一自我復(fù)制具有適宜的限制酶切位點(diǎn)挑選標(biāo)志 可編碼某些遺傳性狀 如抗藥性、耐受重金屬、產(chǎn)生細(xì)菌素等，被質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌也獲得了額外的特性高拷貝數(shù)小分子量1-200Kb 高穩(wěn)定性1.1.2 載 體.克隆載體表達(dá)載體原核真核穿越載體pGEM-T, pENTRpET28a(+), pGEX, pMAL pcDNA3.0, pEGFP-N3, pRK 質(zhì) 粒 載 體 的分類根據(jù)用途分類1.1.2 載 體.質(zhì)粒原核載體1.1.2 載 體.1.1.2 載 體.質(zhì)粒真核載體1.1.2 載 體

3、.1.1.3 質(zhì)粒提取普通步驟細(xì)菌培育物的生長(zhǎng)細(xì)菌的收獲和裂解質(zhì)粒DNA的純化.質(zhì)粒提取的常用方法堿解法、煮沸法cDNA、pDNA變性、復(fù)性不同苯酚抽提法酸性、低離子強(qiáng)度時(shí)超螺旋在水相分布CsCl法EB插入呵斥DNA浮力密度不同SDS 裂解法高鹽濃度下大分子沉淀，質(zhì)粒在上清玻璃纖維膜法(試劑盒)1.1.3 質(zhì)粒提取.堿裂解法提取質(zhì)粒DNA目的要求 經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的方法和技術(shù)。1.1.3 質(zhì)粒提取.實(shí)驗(yàn)原理 根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差別來分別質(zhì)粒DNA。在pH12.0-12.5，線性的DNA雙螺旋構(gòu)造解開而被變性，雖然在這樣的條件下，質(zhì)粒DN

4、A的氫鍵斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈仍嚴(yán)密結(jié)合。當(dāng)參與pH4.8的KAc高鹽緩沖液中和pH至中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開，復(fù)性慢，纏繞構(gòu)成網(wǎng)狀構(gòu)造。經(jīng)過離心，染色體DNA與RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一同絮狀沉淀下來而被除去。堿裂解法提取質(zhì)粒DNA1.1.3 質(zhì)粒提取.實(shí)驗(yàn)操作Section 2.1.2.1 實(shí)驗(yàn)資料含質(zhì)粒載體pET28a和含目的基因質(zhì)粒pEGFP-N3的大腸桿菌DH5a溶液I 50 mmol/L 葡萄糖 5 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷Tris.HClpH8.0 10 mmol/L 乙二胺四乙酸EDTApH8 .0

5、溶液II 0.4 mol/L NaOH， 2% SDS用前等體積混合 溶液III 5 mmol/L 乙酸鉀 ， 冰乙酸 ，H2O .苯酚：氯仿25：24氯仿：異戊醇(24：1)無水乙醇， 70%乙醇(-20C保管) TE緩沖液: 10mmol/L Tris.HCl, 1 mmol/L EDTA(pH8.0)胰RNA酶 1.2.1 實(shí)驗(yàn)資料.1.2.2 實(shí)驗(yàn)程序義務(wù)分配：A1和B1提取pET28a質(zhì)粒A2和B2提取pEGFP-N3質(zhì)粒.1、細(xì)菌培育和搜集將3ml含Kan的LB液體培育基參與到試管中，接入含質(zhì)粒的大腸桿菌，37振蕩培育過夜。已完成取2.5mL培育物倒入微量離心管EP管中, 1000

6、0rpm離心1min，吸去培育液。.2、細(xì)菌裂解及質(zhì)粒的提取將細(xì)胞沉淀懸浮于100ul溶液I中,充分震蕩混勻。加200ul溶液II(新穎配制),蓋緊管蓋,悄然混勻內(nèi)容物,將離心管放冰上5min。加150ul溶液III(冰上預(yù)冷),蓋緊管口,悄然顛倒數(shù)次使混勻。冰上放置5min。12000rpm離心10min,將上清轉(zhuǎn)至另一EP管作好標(biāo)志中。1.2.2 實(shí)驗(yàn)程序.向上清中參與等體積450ul酚:氯仿(1:1) 留意下層是有機(jī)相,反復(fù)混勻。12000rpm,離心2分鐘,將上清小心地轉(zhuǎn)移到另一離心管標(biāo)志！中參與等體積450ul氯仿:異戊醇 (24:1),反復(fù)混勻。12000rpm,離心2分鐘，取上清

7、液于新的EP管中。3、質(zhì) 粒 的 純 化1.2.2 實(shí)驗(yàn)程序.4、質(zhì)粒的濃縮參與2倍體積900ul無水乙醇,混勻后,室溫放置10min。12000rpm離心5分鐘，倒去上清液,把離心管倒扣在吸水紙上,吸干液體。用1ml 70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀, 振蕩并離心, 12000rpm離心2分鐘，倒去上清液, 空氣中枯燥510min。1.2.2 實(shí)驗(yàn)程序.5、質(zhì)粒的溶解和保管加20ul TE緩沖液,其中含有100ug/ml的胰RNA酶,使DNA完全溶解。-20保管。1.2.2 實(shí)驗(yàn)程序.樣品保管1A1 1A2 1B1 1B2 2A1 2A2 2B1 2B2 3A1 3A2 3B1 3B2 4 5

8、67 8 910 11 1213 14 151.2.2 實(shí)驗(yàn)程序.6、質(zhì)粒DNA的電泳檢測(cè)1瓊脂糖凝膠的制備每4人制備一塊瓊脂糖凝膠6個(gè)泳道0.2克瓊脂糖+20毫升TAE緩沖液，電爐融膠充分溶解，略微冷卻加2lgoldviewna顯示液，倒在電泳膠槽中，使膠凝固(20min)。1.2.2 實(shí)驗(yàn)程序.2瓊脂糖凝膠電泳每人1個(gè)樣品，pET28a或pEGFP-N3。取3l質(zhì)粒DNA+1.0l點(diǎn)樣緩沖液，在parafilm膜上混勻后全部點(diǎn)至瓊脂糖凝膠孔記住本人點(diǎn)樣位置。接通電泳儀和電泳槽的電源(留意正負(fù)極)-+恒壓150V,電泳10-20分鐘紫外燈下察看并記錄結(jié)果(對(duì)面實(shí)驗(yàn)室拍照片)分析結(jié)果。1.2.

9、2 實(shí)驗(yàn)程序.負(fù)極正極1A11A21B11B22A12A22B12B2Marker1.2.2 實(shí)驗(yàn)程序.實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵點(diǎn)溶液I參與后充分懸浮溶液II一次性參與后輕柔地顛倒混勻溶液III參與后輕柔地顛倒混勻酚抽提后小心汲取上清無水乙醇和70%乙醇不要弄混微量加樣器的正確運(yùn)用.移液器排氣式和排液式1選擇一支量程適宜的移液器2設(shè)置移液量3裝槍頭4檢驗(yàn)移液量5汲取一定體積的液體6目測(cè)吸入槍頭的液體體積能否合理7釋放液體8退下槍頭.實(shí)驗(yàn)要求：每人提取質(zhì)粒2份pET28a和pEGFP-N3各一份溶液每大組一套槍每2人一套Tips 2人一套3盒.思 考 題分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用的載體有哪些？它們的特點(diǎn)是什么？分別基因組DNA和質(zhì)粒