層析分離純化技術(shù)策略通用PPT課件

1、蛋白層析分離純化技術(shù)1分離和純化蛋白質(zhì)的各種方法主要是利用蛋白質(zhì)之間各種特性的差異，包括1.分子的大小和形狀2.酸堿性質(zhì)3.溶解度4.吸附性質(zhì)5.對配體分子的特異生物學(xué)親和力。 2常用測定方法：1. 根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子質(zhì)量2. 凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量3. 聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子質(zhì)量4.滲透壓法5.沉降分析法（離心）3沉淀蛋白質(zhì)的方法(1) 鹽析法(2) 有機溶劑沉淀法(3) 重金屬鹽沉淀法(4) 加熱變性沉淀法4蛋白質(zhì)純化策略融合蛋白質(zhì)非融合蛋白質(zhì)表達簡單純化一步 親和層析90 - 97 % 純度更高純度三步純化策略粗提中度純化精細純化多步純化5高效純化策略粗提純化精細

2、純化載量速度分辯率回收率6減少處理步驟得率 (%)95% / 步90% / 步85% / 步80% / 步75% / 步02040608010012345678步驟7準備工作 考慮:純度水平需要量保持生物活性有效和經(jīng)濟 蛋白質(zhì)特性:穩(wěn)定性- pH- 離子強度- 溫度分子量等電點8pH 的重要性: 蛋白質(zhì)凈電荷隨 pH 改變滴定曲線蛋白質(zhì)凈電荷 1210穩(wěn)定性范圍用陽離子交換用陰離子交換3pH不同 pH 下的分離情況21+-9pH 的重要性: 蛋白質(zhì)凈電荷隨 pH 改變流動相的 pH 選擇性VVV陽離子陰離子pH0+-VVVVVAbsAbsAbsAbs表面凈電荷Abs Abs Abs Abs10

3、樣品準備考慮:根據(jù)蛋白質(zhì)來源選擇不同萃取方法使用溫和的步驟減少酸化和釋放蛋白酶在室溫以下快速處理用緩沖液維持 pH, 離子強度目的: 穩(wěn)定樣品11三步純化策略Step 純度粗提 中度純化 精細純化 樣品準備,萃取,凈化 達到最高純度去除大部分雜質(zhì) 分離, 濃縮和穩(wěn)定樣品12三步純化策略步驟粗提精細純化層析填料的顆粒大小中度純化13三步純化策略步驟粗提精細純化流速中度純化14三步純化策略步驟粗提精細純化分辯率中度純化15前處理分離純化某一蛋白質(zhì)，首先要求把蛋白質(zhì)從原來的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)，不丟失生物活性。動物材料應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織，種子材料應(yīng)先去殼甚至

4、去種皮以免受雜質(zhì)的污染，油料種子最好先用低沸點的有機溶劑如乙醚等脫脂。然后根據(jù)不同的情況，選擇適當?shù)姆椒ǎ瑢⒔M織和細胞破碎。16樣品預(yù)處理污染物害處預(yù)防措施絮狀物堵柱膜過濾、離心、勻漿脂類阻斷配基、引致凝集、非特異吸附離心、如可跟目標分子兼容，可用有機溶劑核酸阻斷配基、高黏度添加硫酸鏈霉素、硫酸精蛋白或錳鹽沉淀核酸、添加核酸酶蛋白酶分解目標分子添加蛋白酶抑制劑、用親和層析去除蛋白酶、縮短粗分時間、低溫操作17粗提目的純化粗樣快速濃縮 (減少體積) 和穩(wěn)定樣品 (去除蛋白酶)最適用層析技術(shù): 離子交換 / 疏水層析分辯率快速回收率載量18粗提: 離子交換填料預(yù)裝柱 20ml顆粒大小流速HiPre

5、p 16/10 Q XL & SP XL 90 m 10 ml/minHiPrep 16/10 DEAE & CM 90 m 10 ml/minSepharose Big BeadsSTREAMLINESepharose Fast Flow19粗提: 疏水層析填料高載量高流速HiPrep 16/10 Phenyl (高 & 低取代)HiPrep 16/10 ButylHiPrep 16/10 OctylHiTrapHIC 選擇試劑盒放大20中度純化目的 去除大部分雜質(zhì)最適用層析技術(shù): 離子交換 / 疏水層析HiLoad離子交換和疏水層析預(yù)裝柱分辯率快速回收率載量21中度純化: 離子交換填料Se

6、pharose HP 34 mQ & SP150 cm/hr小包裝和預(yù)裝柱 交聯(lián)瓊脂醣SOURCE 30 mSepharose High PerformanceSOURCE 30 Q & S 25 mg 上樣載量3 m: Mini Q & SMini Beads Q & S 2 mg上樣載量26精細純化:離子交換和疏水層析填料RESOURCE15 mQ, S, Phenyl, Ether, Isopropyl1 ml 預(yù)裝柱流速高達10 ml/min RESOURCE HIC Test Kit27精細純化:反相層析填料SephasilRPCSOURCE RPC硅膠3 mC2/C18聚苯乙烯/二

7、乙烯基苯120 : 肽類C4, C8, C185 and 12 m硅膠100 : 肽類300 : 蛋白質(zhì)pH 1 - 12 (14)肽類5, 15 and 30 m28Source30 m15 m5 m離子交換/疏水層析/反相層析反相層析離子交換/反相層析29適用於三步純化策略的層析技術(shù)蛋白質(zhì)性質(zhì)層析技術(shù)凈電荷離子交換(IEX)大小凝膠過濾(GF)疏水性疏水層析(HIC), 反相層析(RPC)生物辯識 (配基特異性)親和層析(AC)配基特異性，凈電荷, 擴張柱床吸附技術(shù) (EBA) 疏水性有AC, IEX or HIC30適用於三步純化策略的層析技術(shù)層析技術(shù)主要特色粗提中度純化精細純化IEX高

8、分辨率高載量快速HIC分辨率好載量一般快速AC高分辨率高載量快速GF高分辨率RPC高分辨率31適用於三步純化策略的層析技術(shù)層析技術(shù)樣品起始狀態(tài)樣品結(jié)束狀態(tài)IEX低離子強度高離子強度或 pH 改變樣品體積不受限制樣品被濃縮HIC高離子強度低離子強度樣品被濃縮AC特異性結(jié)合特異性洗脫條件樣品體積不受限制樣品被濃縮GF樣品體積受限制交換緩沖液 (2 M (NH4)2SO4容易氧化43DAOCS - 一般準則在所有緩沖液中加 DTT 使所有半胱氨酸殘基保持還原狀態(tài)加入蛋白酶抑制劑以保持生物活性用 SDS PAGE 檢查每一個組份中 DAOCS利用酶測定法測量生物活性44準備樣品懸浮細菌細胞在溶解緩沖液

9、中超聲震蕩破碎細胞DNA 沉淀利用離心沉淀來源:從 S. Clavuligerus 克隆得到的DAOCS 基因 和在大腸桿菌的胞漿中擴增45選擇粗提的層析技術(shù)陰離子交換: 快速, 濃縮樣品處理最簡單分離基礎(chǔ): 電荷因為 DACOS 的酸性 pI 和不穩(wěn)定性，所以緩沖液選擇中性 pH46粗提 - 在 KTAFPLC 上優(yōu)化梯度線性梯度步級梯度優(yōu)化梯度層析柱:HiPrep 16/10 Q XL系統(tǒng):KTAFPLC0102030min01002003001002003004000020406080mAUmlmS/cm01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm010

10、20min01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm01020min47選擇中度純化技術(shù)HIC: 分離基礎(chǔ): 疏水性蛋白質(zhì)疏水性質(zhì)很難預(yù)測: 篩選適合填料HIC 可以跟 IEX 互補銜接, 減少樣品處理步驟 (只需要加鹽)DAOCS 在高鹽下能保持穩(wěn)定48選擇精細純化的層析技術(shù)GF:分離基礎(chǔ): 分子量差異 GF: 最適合分離雙體，寡聚體和聚合物49DAOCS - 優(yōu)化好的粗提步驟層析柱:HiPrep 16/10 Q XL系統(tǒng):KTAFPLC濃縮樣品快速去除有害物質(zhì)01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm50DAOCS -

11、優(yōu)化好的中度純化步驟層析柱: SOURCE 15ISO內(nèi)徑 16 mm, 長度 50 mm系統(tǒng):KTAFPLCHIC 和 IEX 互補濃縮樣品除去大部分雜質(zhì)01002001002003004000mlA280 nm51DAOCS -優(yōu)化好的精細純化步驟層析柱: HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade系統(tǒng): KTAFPLC去除聚合物和余下的少量污染物交換緩沖液08060402010020040060080010000mlmAU52DAOCS - 用 SDS分析4321MMM-LMW 低分子量標記1-樣品2-組份 - Q Sepharose XL3-組份- SOUR

12、CE 15ISO4-組份- Superdex 75 pg67k43k30k53DAOCS 純化 - 結(jié)果粗提中度純化精細純化08060402010020040060080010000mlmAU01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm01002001002003004000mlmAu54DAOCS 純化 - 結(jié)果DAOCS 的高分辨電子密度圖譜結(jié)晶 DAOCS 的 X-射線繞射圖感謝瑞典農(nóng)業(yè)科技大學(xué)的 Prof. Inger Andersson 和 Dr. Anke Terwisscha van Scheltinga, 以及瑞典 Uppsala 大學(xué)生化系的 Dr. Karin Valegrd 提供以上圖片55中度純化DAO