北京大學醫(yī)學部生物物理學系PPT通用課件

1、 Techniques in receptor research 尹長城北京大學醫(yī)學部生物物理學系參考資料參考書受體研究技術 賀師鵬 胡雅兒 夏宗勤 主編北京大學醫(yī)學出版社 2004實驗室網(wǎng)頁/20041027/column/1018.htm 1. 受體概論1.1 受體概念的形成與發(fā)展1.1.1 受體概念的發(fā)展歷史100多年前，J.N. Langley發(fā)現(xiàn)箭毒能明顯對抗煙堿的收縮效應指出藥物可能和細胞中某種特異成分結(jié)合而發(fā)揮作用，當箭毒與這種接受物質(zhì)結(jié)合就阻斷了煙堿的作用他稱這種特異成分為接受物質(zhì) (receptive substance) 1.1 受體概念的形成與發(fā)展1.1.1 受體概念的發(fā)

2、展歷史P. Ehrlich認為細胞上有許多側(cè)鏈，當細胞上的側(cè)鏈基團和毒素分子的基團結(jié)構(gòu)上互補形成類似鑰匙和鎖的關系，兩個基團可相互結(jié)合P. Ehrlich將細胞上的這些側(cè)鏈稱之為受體(receptor)根據(jù)受體理論，研究不同類型化學物質(zhì)對錐蟲的作用，提出了化學受體 (chemoreceptor) 的概念 1.1 受體概念的形成與發(fā)展1.1.1 受體概念的發(fā)展歷史20世紀20年代末，A.J.Clark提出了“占領理論” (occupancy theory)生物活性通過“占領”受體結(jié)合位點而起作用，生物活性物質(zhì)與其特異性受體之間的反應是一個可逆的處于動態(tài)平衡的過程，符合質(zhì)量作用定律提出了生物活性物

3、質(zhì)與相應受體親和力的概念提出了藥物產(chǎn)生的效應與受體的結(jié)合量呈正比關系的概念缺陷：不能解釋不同藥物作用于同一類受體會誘發(fā)不同的反應 1.1 受體概念的形成與發(fā)展1.1.1 受體概念的發(fā)展歷史1954年，E.J. Ariens提出內(nèi)在活性 (intrinsic activity) 的概念活性物質(zhì)所產(chǎn)生的最大效應取決于分子本身的性質(zhì)完全激動劑部分激動劑完全拮抗劑1956年，R.P. Stephenson提出藥物效能 (efficacy) 的概念一種物質(zhì)與受體結(jié)合所產(chǎn)生的效應取決于該物質(zhì)的效能而不取決于占領受體的量1961年，W.D.M. Paton提出速率理論 (rate theory) 配基與受體

4、相互作用，所引起的效應與其占領受體的速率成正比 1.1 受體概念的形成與發(fā)展1.1.1 受體概念的發(fā)展歷史直到20世紀60年代前受體還基本上是一個理論上的概念受體是什么物質(zhì)？位于細胞的什么部位？如何發(fā)揮作用？1.1 受體概念的形成與發(fā)展1.1.1 受體概念的發(fā)展歷史20世紀60年代，受體研究進入新的階段首先，放射性同位素技術開始用于受體的研究，建立了放射性配基結(jié)合分析法 (radioligand binding assay，RBA)使人們能夠在實際上接觸到受體分子，為受體親和力與受體數(shù)量的定量研究提供了可靠和靈敏的方法可以對受體分子進行純化，從而了解到受體分子都是有特定結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子；為從分

5、子水平上研究配基與受體的相互作用打下了基礎RBA的出現(xiàn)大大推進了受體的研究，具有劃時代的意義1.1 受體概念的形成與發(fā)展1.1.1 受體概念的發(fā)展歷史其次，20世紀70年代Sutherland發(fā)現(xiàn)環(huán)核苷酸 (cAMP 或cGMP) 在激素與細胞反應的效應之間充當信使作用，從而提出第二信使學說闡明了神經(jīng)遞質(zhì)和激素作用于受體，引發(fā)信號轉(zhuǎn)導機制并引起細胞功能的變化1.1 受體概念的形成與發(fā)展1.1.1 受體概念的發(fā)展歷史 第三，分子生物學技術推動了受體研究通過DNA分子克隆技術闡明受體蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)通過基因同源性的研究找到很多過去用其它方法難于發(fā)現(xiàn)的受體或受體的新亞型為研究受體結(jié)構(gòu)和功能的關系提供

6、了必不可少的前提1.1 受體概念的形成與發(fā)展1.1.1 受體概念的發(fā)展歷史第四，結(jié)構(gòu)生物學的發(fā)展推動了受體研究通過結(jié)構(gòu)生物學獲得受體蛋白的三維結(jié)構(gòu)信息闡明受體-配體相互作用的本質(zhì)闡明受體疾病的分子機理輔助受體藥物的設計1.1.2 受體的現(xiàn)代概念受體是存在于細胞表面或細胞內(nèi)的，具有特異識別和結(jié)合細胞內(nèi)外某些特定化學信號物質(zhì)的蛋白質(zhì)分子化學信號物質(zhì) (通常也稱配基) 可以是激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細胞因子和生長因子、某些藥物等配基與受體結(jié)合，使受體激活并產(chǎn)生信號轉(zhuǎn)導，啟動細胞內(nèi)相應的生物效應受體研究的內(nèi)容不僅僅限于受體與配基的相互作用，而且還包括受體的激活機制，受體激活后如何啟動后續(xù)信號轉(zhuǎn)導機制，信號轉(zhuǎn)導

7、的具體途徑，以及如何引起相應的生物學效應等等1.2 受體與配基結(jié)合反應的基本特性 1. 飽和性對某種特定的細胞來說，每種特定的受體，其數(shù)量有一定限度因此，配基與受體結(jié)合的反應具有飽和性 當配基濃度逐步增加，它和受體的特異結(jié)合也會逐步增加，但是當升高到一定濃度，會使絕大多數(shù)受體都被配基結(jié)合，再增加濃度，復合物的升高就很有限，表現(xiàn)出受體被飽和的現(xiàn)象。特異的受體結(jié)合反應其受體呈高親和性和低容量，非特異結(jié)合則呈低親和性和高容量1.2 受體與配基結(jié)合反應的基本特性2. 可逆性內(nèi)源性配基和特異受體的結(jié)合反應屬于可逆反應當周圍的配基濃度降低時，形成的復合物就會解離，重新變成游離的配基和受體這種可逆性是受體對

8、周圍環(huán)境變化快速和正確反應的基礎外源性配基則有兩類不同的情況很多外源性配基和受體的結(jié)合也是可逆反應，解離后的配基是原形另有一類不可逆阻斷劑與受體形成的復合物是不可逆的，最終導致受體分子的破壞和配基的代謝變化1.2 受體與配基結(jié)合反應的基本特性 3. 特異性受體具有特異識別配基的性能，特定的受體只識別特定的配基受體識別配基的基礎是受體某個部位的立體結(jié)構(gòu)，即受體蛋白的構(gòu)象各種受體的識別能力是不同的，受體識別能力強，受體特異性就好受體的識別還和配基的構(gòu)型和構(gòu)象有關,只有存在嚴格構(gòu)型和構(gòu)象的配基分子才能選擇性地與其受體結(jié)合受體的特異性還表現(xiàn)在器官或組織的專一性（稱靶器官），如子宮、陰道、乳腺等器官對雌

9、激素敏感，因為這些器官上雌激素體受體的數(shù)量明顯高于非靶器官1.2 受體與配基結(jié)合反應的基本特性 受體的親和力受體和配基的結(jié)合能力，受體親和力高說明受體和配基容易結(jié)合而不容易解離受體親和力的定量指標是受體的解離平衡常數(shù)Kd (親和常數(shù)Ka的倒數(shù))，Kd越大則親和力越小受體的Kd值一般在10-8-10-12molL之間。Kd值小于10-9mol/L的通常稱為高親和力受體的親和力和配基種類有關，評價Kd 值的絕對值大小必須指明配基的種類1.2 受體與配基結(jié)合反應的基本特性4. 生物效應的相關性受體的主要功能是介導配基的生物學效應，如果一種蛋白能與某種物質(zhì)相結(jié)合而并不介導特定的生物學效應，那么這種蛋白

10、不能稱之為受體生物效應和受體結(jié)合反應需有兩方面的匹配:一是濃度上的匹配，二是組織分布的匹配如果某種化合物與某種受體有結(jié)合，但該化合物的結(jié)合濃度明顯不同于它引起生物效應的濃度，或者它引起生物效應的組織和它結(jié)合的組織不一致，那么這種化合物和受體的結(jié)合是否屬于特異結(jié)合就有疑問1.3 受體與配基相互作用1.3.1 受體和配基的相互作用力和結(jié)合能受體與配基的相互作用的本質(zhì)為物理化學過程作用力源自于帶電荷基團間的靜電作用或者非極性分子間的吸引作用配基與受體的相互作用既然是一種物理化學過程，必然有成鍵過程，一定有能量釋放1.3 受體與配基相互作用根據(jù)Hammett方程R是氣體常數(shù), T是絕對溫度, Ka是結(jié)

11、合平衡常數(shù) G是成鍵時釋放的自由能，其值與Ka的對數(shù)成正比，所以Ka值是評估成鍵作用能力的物理量, 是受體和配基的結(jié)合能力的物理量 化學鍵類型與自由能的關系化學鍵類型 G (KJmol-1)共價鍵 - (170420)離子鍵 - (2142)偶極鍵 - (429)氫鍵 - (429)疏水鍵 - 4范特華力 - (24)1.3 受體與配基相互作用實驗證據(jù)表明，配體與受體相互作用是可逆反應它們之間的作用力是屬于較弱的次級鍵靜電作用氫鍵范德華力疏水鍵等1.3 受體與配基相互作用1. 靜電作用靜電作用是指荷電基團、偶極以及誘導偶極之間的靜電吸引力靜電作用包括離子鍵、離子-偶極相互作用和偶極-偶極相互作

12、用等三個方面 受體蛋白質(zhì)的表面都有可電離的基團和偶極基團，受體蛋白質(zhì)的活性中心大都有極性區(qū)域，易與含極性基團的配基生成離子鍵和其他靜電作用就藥物而言，它和受體的最初作用通常是由于受體的活性中心極性基團對它的吸引所引起。許多藥理效應的關鍵作用步驟要求通過電荷中心的作用來實現(xiàn)離子鍵在生理條件下，一些氨基酸如精氨酸、賴氨酸可以形成正離子含有這些氨基酸的蛋白質(zhì)受體在體內(nèi)就可形成陽離子,可以與電性相反的配基或藥物分子以離子鍵形式相結(jié)合這種離子鍵可以解離，因此離子間的吸引力是可逆結(jié)合離子鍵作用力大小可用庫侖定律表示式中q1、q2為離子的電量，r為兩個離子間的距離，為介質(zhì)的介電常數(shù)，r0 為單位矢量相互作用

13、能為離子偶極相互作用 配基或藥物分子和受體分子中O、S、N或C原子的電負性均不相等這些原子形成的鍵由于電負性的差值可以產(chǎn)生偶極現(xiàn)象。這種偶極部分與持久電荷可以形成靜電作用 離子偶極相互作用相互作用能由下式表示式中 為偶極矩，為偶極方向與電荷至偶極中心連線的夾角，q為電荷電量，為介電常數(shù)，r為電荷與偶極中心的距離。離子偶極相互作用比離子鍵小得多，鍵能與距離的平方成反比。由于偶極矩是個向量，電荷與偶極的取向會影響藥物受體的作用強度，隨方向的變化而變化。偶極偶極相互作用 兩個原子的電負性不同，產(chǎn)生價鍵電子的極化作用，成為持久的偶極兩個偶極間的作用能由下式表示式中 x為偶極矩，為介電常數(shù)，r為偶極中心

14、的距離偶極偶極相互作用偶極偶極相互作用的大小，取決于偶極的大小、它們之間的距離和相互位置偶極偶極相互作用非常普遍，常發(fā)生在水溶液中。水分子是偶極分子，它可與帶有羰基或雜原子的藥物作用藥物也可與蛋白質(zhì)受體等生物大分子的極性基團作用偶極-偶極作用對配基受體相互作用的特異性和立體選擇性非常重要2. 氫鍵 氫鍵的形成: 氫鍵是由兩個負電性原子 (N, O, S等) 對氫原子的靜電引力所形成，是一種特殊的偶極-偶極鍵它是質(zhì)子給予體X-H和質(zhì)子接受體Y之間一種特殊類型的相互作用，是H原子和電負性很強的雜原子之間作用的鍵，即X-HYR在氫鍵中，最常見的質(zhì)子給予體有OH、NH，而SH是很弱的質(zhì)子給予體。質(zhì)子接

15、受體均有未成鍵的p電子或電子，通常有OH、OR、NH2、N（芳香氮）、NH-R、鹵素、SR、C=C、C=N等氫鍵在生物體系中，基本溶劑水以及蛋白質(zhì)、核酸等都含有大量能形成氫鍵的基團藥物進入生物體系以及構(gòu)成特殊狀態(tài)與受體分子間相互作用的過程中，氫鍵對分子的取向有非常重要的作用最常見的氫鍵在羥基和胺基之間形成生物體系中超分子的自組裝離不開氫鍵的參與，如DNA分子中的A:T及G:C殘基間的氫鍵作用氫鍵氫鍵的大小及方向: 氫鍵的大小通常由氫鍵的鍵能來描述，它是指發(fā)生下列過程所需要的能量 X-HYRX-H + Y-R氫鍵的鍵能比共價鍵弱，比范德華力強，在生物體系中通常為8.433.4kJ/mol (28

16、kcal/mol)。鍵長為0.250.32nm氫鍵氫鍵的方向用鍵角來表示，是指X-H與HY之間的夾角，一般為180125最強的氫鍵是X、H、Y均在一條直線上，即鍵角為180非直線型氫鍵比直線型弱，一般只有8.4kJ/mol （2kcal/mol）左右，比水分子氫鍵的特征值20.9kJ/mol (5kcal/mol) 弱得多，但許多這樣的弱作用的合力是很大的，對穩(wěn)定生物大分子的高級結(jié)構(gòu)起重要作用氫鍵的分類按氫鍵強弱進行分類。這種方法依據(jù)譜波學和晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進行分類分類OH(cm-1)r(OH) (nm)實例弱氫鍵32000.270H2O(冰、水合物）R-OH(醇、酚)中強氫鍵280031000.

17、2600.270R-COOH(羧酸)強氫鍵70027000.2400.260MH(RCOO)2(酸鹽)氫鍵的分類 兩種特殊形式的氫鍵:對稱氫鍵，即氫鍵質(zhì)子位于給體和受體原子間連線的中點，已知的實例有KHF2和二甲酸氫鈉等分叉氫鍵（或稱多中心氫鍵），即一個質(zhì)子給體X-H可與兩個或三個受體Y形成氫鍵。在一些生物小分子水合物晶體中，分叉氫鍵比普通氫鍵出現(xiàn)的機會更多一些3. 范德華力范德華力是一種普遍存在的作用力，是一個原子的原子核吸引另一個原子外圍電子所產(chǎn)生的作用力范德華力是一種比較弱的、非特異性的作用力范德華力非常依賴原子間的距離，當相互靠近到大約0.40.6nm（4-6）時，這種力表現(xiàn)出較大的集

18、合性質(zhì)范德華力包括引力和斥力，涉及四種作用力靜電力誘導力色散力排斥力范德華力按照量子力學的微擾方法所得到的能量分解，可將范德華力的能量表示為：E = E引+ E斥 = E靜+ E誘 + E色+ E斥式中E靜、E誘、E色、E斥分別是靜電力、誘導力、色散力、斥力所表示的能量。范德華力誘導力: 永久偶極矩將誘導鄰近分子使發(fā)生電荷位移，出現(xiàn)誘導偶極矩。永久偶極矩和誘導偶極矩之間存在吸收作用，此相互作用的能量稱為誘導能偶極矩為1的分子1與極化率為2的分子2之間的平均誘導能為：誘導力通常是較弱的，并且隨溫度升高而降低，這種作用力的大小隨偶極矩指向的不同而不同，是有方向性的 范德華力色散力: 非極性分子有瞬

19、間偶極矩。瞬間偶極矩將在鄰近分子中誘導出新的偶極矩。瞬間偶極矩與誘導偶極矩間的相互作用力就叫色散力，該相互作用的能量叫色散能London推出兩個分子之間色散能的近似表達式為：式中 I1 , I2為兩個相互作用分子的電離能1,2 分別為兩個分子的極化率范德華力在非極性分子之間只有色散力；在極性分子和非極性分子之間有誘導力，也有色散力；在極性分子之間，靜電力、誘導力和色散力都存在這些作用力不僅存在于不同的分子間，而且還存在于一分子內(nèi)的不同原子和基團之間實驗表明一般分子之間的這三種作用力，除個別極性很強的分子外，誘導力和靜電力一般較小，色散力是主要的色散力由分子的極化率決定，它反映分子中電子云是否容

20、易變形，當分子中電子數(shù)目增加，原子變大，外層電子離核較遠，增加，色散力增加；分子中有鍵，其電子云也較鍵容易變形，若有離域鍵，則一般都比較大，色散力增加，分子間作用力增強范德華力排斥力: 當分子間相距較遠時，表現(xiàn)為范德華引力；當分子靠得很近時，則會出現(xiàn)斥力。和吸引力相比，排斥力是短程力，其作用能可近似表達為：式中，A是個正值參數(shù)、n為912的數(shù)值 范德華力分子間相互作用的范德華力的總的勢能可表示為：A和B為常數(shù)，可通過實驗測定范德華力Lennard-Jones認為多數(shù)物質(zhì)n=12時符合較好，這樣分子間作用能可用Lennard-Jones 6-12關系式表達：根據(jù)該公式作E-r曲線時，曲線會出現(xiàn)最

21、低點，相應這點的距離為平衡距離，此時體系的能量最低，分子間保持一定的接觸距離。相鄰分子相互接觸的原子間的距離即為該兩原子的范德華半徑和范德華半徑比共價半徑大，其變動范圍也大。現(xiàn)在應用最廣泛的范德華半徑是由Pauling所給定的數(shù)值，而數(shù)據(jù)最全而又被一些人認為是最合適的范德華半徑是由Bondi所給定的數(shù)值。范德華力范德華力是瞬息間作用力，時間大約為10-8s，范德華引力與原子間距離的7次方成反比在分子間相互作用中，只有非常接近，而且有眾多原子或基團時，方能出現(xiàn)作用。換句話說，范德華力是非特異性的作用力，分子越復雜，原子或基團間接觸點越多，其引力總和越大根據(jù)熱力學計算，甾類化合物與受體結(jié)合能的主要

22、來源是范德華力與疏水作用4.疏水作用 疏水作用是有機分子在水溶液中，由于有機基團間的靜電力、氫鍵、范德華力的作用，使有機分子傾向于聚集在一起，因而產(chǎn)生排斥水分子的作用就配基和受體而言，它們的非極性部分在體液中均為水合狀態(tài)。當配基與受體接近到某一程度時，非極性部分周圍的水分子便被擠出，被置換出來的水分子成無序狀態(tài)因而體系的熵增加，焓變值減少，使兩個非極性區(qū)域間的接觸穩(wěn)定，這種締合就是疏水基團相互作用的結(jié)果1.3.2 受體與配基相互作用的立體結(jié)構(gòu)問題構(gòu)型(configuration)和構(gòu)象(conformation)構(gòu)型描述的是有機光學活性分子中，手性中心上相連接的各個原子和基團，相對位置不同所產(chǎn)

23、生的立體異構(gòu)現(xiàn)象構(gòu)象是指組成分子的各個原子和基團間的相對空間位置構(gòu)型的改變，分子中一定會有共價鍵的斷裂和新的共價鍵的生成；而構(gòu)象的改變不需要共價鍵的變換構(gòu)型概念僅涉及與手性中心相連的各個原子和基團的相對位置，沒有手性中心就不存在分子的構(gòu)型；而構(gòu)象概念涉及分子中所有原子和基團，由于分子中單鍵的旋轉(zhuǎn)，一些原子和基團的相對位置可有多種差異，因而一個分子可有多種構(gòu)象體 1.3.2 受體與配基相互作用的立體結(jié)構(gòu)問題結(jié)構(gòu)決定功能，受體與配基相互作用的強弱與受體的結(jié)構(gòu)，特別是與其空間結(jié)構(gòu)密切相關受體蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的研究，主要是對其構(gòu)象的研究。一條受體蛋白質(zhì)的多肽鏈只有通過折疊成特定的空間構(gòu)象，才有功能可言所謂受體的活性，實際上就是受體的活性構(gòu)象，對受體與配基相互作用的研究也是主要圍繞著受體的構(gòu)象展開的1.3.2 受體與配基相互作用的立體結(jié)構(gòu)問題 受體和配基的相互作用有著嚴格的立體化學要求。這一作用過程遵守兩個關鍵的原則:一是互補性原則（complementarity）。配基與受體的互補包括空間