生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg

1、酶 化 學(xué)張 金 國(guó)歡迎大家學(xué)習(xí)第二章2022/7/141生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg第二章 酶化學(xué) (6學(xué)時(shí))第一節(jié) 酶的基本特征第二節(jié) 酶的命名和分類構(gòu)第三節(jié) 酶的催化作用機(jī)制第四節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和影響因素第五節(jié) 酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制2022/7/142生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg酶(enzyme)是一類具有高效率、高度專一性、活性可調(diào)節(jié)的生物催化劑。新陳代謝是維持生物體生長(zhǎng)、繁殖、運(yùn)動(dòng)等生命活動(dòng)過(guò)程的化學(xué)變化的總稱。生物體同周圍環(huán)境不斷地進(jìn)行著物質(zhì)和能量的交換，它把吸收的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化成自身的組成部分，稱為同化過(guò)程；生物體也在不斷地將自身的組成物質(zhì)分解，這是異化過(guò)程。新陳代謝失調(diào)會(huì)引發(fā)疾病，新陳代謝停止則意

2、味著生命終結(jié)。體內(nèi)所有代謝反應(yīng)都是酶催化的，酶是研究生命活動(dòng)的關(guān)鍵。酶學(xué)概述2022/7/143生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg酶學(xué)研究簡(jiǎn)史早在8000多年前（禹時(shí)代），我國(guó)已有利用“ 酶 ”釀酒的記載。一百余年前，Pasteur認(rèn)為發(fā)酵是酵母細(xì)胞生命活動(dòng)的結(jié)果。1877年，威廉.屈內(nèi)（Kuhne）首次提出enzyme一詞。1897年，布赫納（Buchner）兄弟用不含細(xì)胞的酵母提取液進(jìn)行發(fā)酵，說(shuō)明了發(fā)酵與細(xì)胞無(wú)關(guān)，而是由細(xì)胞外的物質(zhì)引起的。1913年Michaelis和Menten提出酶促動(dòng)力學(xué)原理米氏方程1926年，Sumner首次從刀豆中提純出脲酶結(jié)晶。2022/7/144生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg一

3、、酶的化學(xué)本質(zhì)和組成（一）酶的化學(xué)本質(zhì)1、酶是蛋白質(zhì)1926年Sumner第一次從刀豆種子中提取了脲酶結(jié)晶，證明其具有蛋白質(zhì)性質(zhì)。30年代，Northrop又分離出結(jié)晶的胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶，證明酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)。第一節(jié) 酶的基本特征2022/7/145生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2、酶是蛋白質(zhì)的證據(jù)： （1）酶經(jīng)酸堿水解后的最終產(chǎn)物是氨基酸；元素分析，與蛋白質(zhì)的元素含量相似，可以用氨基酸人工合成，1969年人工合成了牛胰核糖核酸酶。（2）與蛋白質(zhì)的分子量相似，結(jié)構(gòu)相似，具有一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)。（3）凡使蛋白質(zhì)變性的因素也可使酶變性失活；酶能被蛋白酶水解而失活。（4）酶具有蛋白質(zhì)的

4、特性，如：兩性解離、膠體性質(zhì)、加熱使酶變性、顏色反應(yīng)等；不能通過(guò)半透膜。2022/7/146生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg但也發(fā)現(xiàn)：1982年，Cech首次發(fā)現(xiàn)RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。1995年，Jack W.Szostak（紹斯塔克）研究室首先報(bào)道了具有DNA連接酶活性DNA片段，稱為脫氧核酶(deoxyribozyme)。大多數(shù)酶的化學(xué)本質(zhì)是由蛋白質(zhì)組成的。Ribozyme的化學(xué)本質(zhì)是RNA2022/7/147生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg核酶的發(fā)現(xiàn)，改變了有關(guān)酶是蛋白質(zhì)的概念，即：“酶是具有催化功能的生物大分子（蛋白質(zhì)或RNA）”。 酶分兩大類： 主要由蛋白質(zhì)組成蛋

5、白類酶（P酶） 少數(shù)由核糖核酸組成核酸類酶（R酶）2022/7/148生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（二）酶的組成單純酶類(simple enzyme)：僅由蛋白質(zhì)組成脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等結(jié)合酶類（conjugated enzyme):全酶 = 酶蛋白+ 輔助因子（輔酶、輔基）超氧化物歧化酶Cu2+、Zn2+）、乳酸脫氫酶（NAD+）酶蛋白決定酶專一性，輔助因子決定酶促反應(yīng)的類型。2022/7/149生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg 酶的輔助因子主要有金屬離子和有機(jī)化合物有機(jī)化合物：NAD，NADP，F(xiàn)AD，生物素，卟啉等金屬離子：Fe2+、Fe3+ 、 Zn2+、 Cu+、Cu2+、 M

6、n2+、Mn3+、Mg2+ 、K+、 Na+ 、Mo6+ 、Co2+等。輔酶(coenzyme)：與酶蛋白以非共價(jià)鍵結(jié)合，較松，可透析除去。輔基(prosthetic group)：與酶蛋白以共價(jià)鍵結(jié)合，較緊，透析不能除去。2022/7/1410生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2022/7/1411生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2022/7/1412生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（三） 同工酶在同一個(gè)生物體內(nèi)，能催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但在酶的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生化特性（如Km值、電泳行為等）存在明顯差異的一組酶稱為同工酶（isoenzyme）。例如：哺乳動(dòng)物的乳酸脫氫酶（LDH，催化乳酸脫氫生成丙酮酸），有5種形式：

7、分子形式：LDHl，LDH2，LDH3，LDH4，LDH5； 亞基組成：H4，H3M，H2M2，HM3，M4。乳酸脫氫酶同工酶分子都是四聚體，但其亞基組成不同。不同組織含量不同，用于疾病診斷。2022/7/1413生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg 臨床意義 1LDH1和LDH2升高：見(jiàn)于急性心肌梗塞(LDH1LDH21)、病毒性心肌炎、風(fēng)濕性心肌炎和克山病。 2LDH5和LDH4升高： (1)急性肝炎：LDH5明顯升高，LDH4輕度增高； (2)急性肝萎縮：LDH5和LDH4都明顯升高； (3)慢性肝炎、肝硬化：LDH5輕度升高； (4)骨骼肌急性損傷、皮肌炎：LDH5和LDH4都升高； (5)前列腺癌

8、：LDH5升高，LDH5LDH11。 3LDH的五種同工酶都升高：見(jiàn)于胃癌、結(jié)腸癌和胰腺癌。2022/7/1414生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（四）核酶核酶的發(fā)現(xiàn)，1982年，R.Cech（切赫河）等人發(fā)現(xiàn)四膜蟲(chóng)細(xì)胞的26s rRNA前體具有自我剪接功能，將這種具有催化活性的天然RNA稱為核酶Ribozyme。1983年， Altman等人發(fā)現(xiàn)核糖核酸酶P的RNA組分具有加工tRNA前體的催化功能。而RNase P中的蛋白組分沒(méi)有催化功能，只是起穩(wěn)定構(gòu)象的作用。核酶的發(fā)現(xiàn)，改變了有關(guān)酶是蛋白質(zhì)的概念，Cech和Altman獲得1989年諾貝爾獎(jiǎng)。2022/7/1415生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg核酶在阻斷

9、基因表達(dá)和抗病毒方面的應(yīng)用前景Ribozyme能特異性地切割靶RNA序列，核酶藥物選擇性地裂解癌細(xì)胞或病毒的RNA，從而阻斷它們合成蛋白質(zhì)。例如針對(duì)HIV病毒RNA序列和結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)出專門裂解HIV病毒的RNA的核酶，而這種核酶對(duì)正常細(xì)胞RKA則沒(méi)有影響。核酶藥物使用劑量較少，毒性也較小，并且病毒較難產(chǎn)生耐受性。具有廣闊的應(yīng)用前景和極大的臨床實(shí)用價(jià)值。2022/7/1416生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（五 ）模擬酶模擬酶（model enzyme ）用化學(xué)的方法合成具有催化功能的非蛋白質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子，來(lái)模擬酶的結(jié)構(gòu)、特性、作用原理以及酶在生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)過(guò)程。酶是一類有催化活性的蛋白質(zhì)，具有許多

10、優(yōu)點(diǎn)。但酶容易受到多種物理、化學(xué)因素的影響而失活，所以不能用酶廣泛取代工業(yè)催化劑。研究模擬酶是為了解決酶的以上缺點(diǎn)，是一個(gè)新的研究領(lǐng)域，是仿生高分子的一個(gè)重要的內(nèi)容。有以下幾方面：模擬酶的金屬輔基、模擬酶的活性功能基、模擬酶的高分子作用方式、模擬酶與底物的作用、模擬酶的性狀等。2022/7/1417生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（六）抗體酶 abzyme抗體酶是一種人工酶，本質(zhì)上是一種具有催化能力的抗體。而單純的抗體沒(méi)有催化能力。通過(guò)改變抗體中與抗原結(jié)合的微環(huán)境，并在適當(dāng)?shù)牟课灰胂鄳?yīng)的催化基團(tuán)，所產(chǎn)生的具有催化活性的抗體。獲得抗體酶的途徑：采用過(guò)渡態(tài)的底物類似物誘導(dǎo)；在現(xiàn)有的抗體基礎(chǔ)上，通過(guò)化學(xué)修飾

11、或通過(guò)蛋白質(zhì)工程向其配體結(jié)合部位導(dǎo)入催化基團(tuán)。拷貝法?？贵w酶的研究，為人們提供了一條合理途徑去設(shè)計(jì)適合于市場(chǎng)需要的蛋白質(zhì)，即人為地設(shè)計(jì)制作酶，設(shè)計(jì)針對(duì)性強(qiáng)、藥效高的藥物。 2022/7/1418生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg二、酶催化作用的特點(diǎn)問(wèn)題一：化學(xué)催化劑具有哪些特點(diǎn)？2022/7/1419生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg酶與非生物催化劑相比的幾點(diǎn)共性：參與反應(yīng)，反應(yīng)前后自身組成不變；能提高化學(xué)反應(yīng)速率，但不改變化學(xué)反應(yīng)平衡點(diǎn)；通過(guò)降低反應(yīng)活化能，加快反應(yīng)速度；只能催化熱力學(xué)允許的反應(yīng)。2022/7/1420生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg酶催化作用的特點(diǎn)：（1） 極高的催化效率；（2） 極高的催化專一性；（3）

12、可調(diào)節(jié)性 酶活性、酶量；（4） 反應(yīng)條件溫和 常溫、常壓，中性pH環(huán)境。2022/7/1421生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（一）酶催化作用的高效性1、催化效率酶催化反應(yīng)速度與加普通催化劑相比可提高1061012倍，是相應(yīng)的無(wú)催化反應(yīng)的108 1020倍。例如: 1mol馬肝過(guò)氧化氫酶在一定條件下可催化5106摩爾過(guò)氧化氫分解，在同樣條件下1mol鐵只能催化6104摩爾過(guò)氧化氫分解。因此，這個(gè)酶的催化效率是鐵的1010倍。也就是說(shuō)，用過(guò)氧化氫酶在1秒內(nèi)催化的反應(yīng)，同樣數(shù)量的鐵需要300年才能反應(yīng)完。2022/7/1422生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg酶促反應(yīng)的本質(zhì)降低反應(yīng)活化能例如：H2O2的分解，當(dāng)沒(méi)有催化

13、劑時(shí)活化能為75.24kJ/mol；用鈀作催化劑時(shí)活化能為48.9kJ/mol；而用過(guò)氧化氫酶作催化劑時(shí)，活化能下降為8.36kJ/mol以下。2、活化能與過(guò)渡態(tài)2022/7/1423生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg酶催化的反應(yīng)稱為酶促反應(yīng)。酶首先與底物（反應(yīng)物）結(jié)合，生成不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物ES （A）；然后分解為反應(yīng)產(chǎn)物而釋放出酶。2022/7/1424生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（二）酶催化作用的專一性1、概念及特點(diǎn)酶只催化某一類底物發(fā)生特定的反應(yīng)，產(chǎn)生一定的產(chǎn)物，這種特性稱為酶的專一性。酶都有極高的專一性，幾乎沒(méi)有副反應(yīng)發(fā)生。1）絕對(duì)專一性：有些酶只作用于一種底物，催化一個(gè)反應(yīng)， 而不作用于任何其它物質(zhì)。

14、如：脲酶只能催化尿素的分解，對(duì)甲基尿素?zé)o作用。再如：琥珀酸脫氫酶底物：琥珀酸2022/7/1425生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2）相對(duì)專一性：這類酶對(duì)結(jié)構(gòu)相近的一類底物都有作用。包括鍵專一性和基團(tuán)專一性。（1）鍵專一性如酯酶能水解不同脂肪酸形成的酯鍵2022/7/1426生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（2）族專一性不但要求底物具有一定化學(xué)鍵，而且對(duì)此化學(xué)鍵兩端連接的兩個(gè)原子基團(tuán)亦有一定的要求如：a -葡萄糖苷酶，要求底物必須是a-糖苷鍵形成的糖苷。麥芽糖、蔗糖2022/7/1427生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg3） 立體異構(gòu)專一性概念：酶除了對(duì)底物分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)有要求外，對(duì)其立體異構(gòu)也有一定的要求類別：旋光異構(gòu)專一

15、性和幾何異構(gòu)專一性（1）旋光異構(gòu)專一性酶只作用于旋光異構(gòu)體的一種。如L-精氨酸酶只對(duì)L-精氨酸起分解作用，而對(duì)D -精氨酸則無(wú)作用。2022/7/1428生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（2）幾何異構(gòu)專一性當(dāng)?shù)孜锞哂袔缀萎悩?gòu)體時(shí)，酶只作用其中的一種。例如，琥珀酸脫氫酶只能催化琥珀酸生成延胡索酸（反丁烯二酸），而不促成順丁烯二酸。酶催化作用專一性具有非常重要的意義2022/7/1429生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2、酶作用專一性假說(shuō)-酶與底物的結(jié)合（1）鎖鑰模型(lock-key hypothesis) Fisher 1894認(rèn)為：底物分子或其一部分像鑰匙一樣，專一地插入酶活性中心，通過(guò)多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合，形成

16、酶底物復(fù)合物。酶活性中心的催化基團(tuán)正好對(duì)準(zhǔn)底物的有關(guān)敏感鍵，進(jìn)行催化反應(yīng)。2022/7/1430生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2022/7/1431生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg鎖鑰模型將酶分子結(jié)構(gòu)看成是互補(bǔ)的、剛性的，較好地解釋了立體異構(gòu)專一性；但未能解釋可逆反應(yīng)，即許多酶可以同時(shí)催化正、負(fù)反應(yīng)，鎖鑰模型無(wú)法解釋當(dāng)酶與底物結(jié)合后，再與產(chǎn)物結(jié)合的事實(shí)。2022/7/1432生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（2）誘導(dǎo)楔合模型（induced-fit hypothesis） Koshland ， 1958認(rèn)為：酶活性部位的形狀與底物的形狀并非完全互補(bǔ)，當(dāng)酶分子與底物分子接近時(shí)，酶蛋白質(zhì)受底物分子誘導(dǎo)，構(gòu)象發(fā)生有利于與底物結(jié)

17、合的變化，酶與底物在此基礎(chǔ)上互補(bǔ)楔合，進(jìn)行反應(yīng)。認(rèn)為酶具有一定的柔性。2022/7/1433生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2022/7/1434生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg三、 酶活力測(cè)定（一） 酶活力的概念1、酶活力（enzyme activity） ：酶催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的能力，也稱酶活性。測(cè)定酶活力，實(shí)際上就是測(cè)定酶促反應(yīng)進(jìn)行的速度。酶促反應(yīng)速度越快，酶活力就越大；反之，速度越慢，酶活力就越小。 2022/7/1435生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg酶促反應(yīng)的初速度: 底物開(kāi)始反應(yīng)之后，很短一段時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)速度。反應(yīng)時(shí)間一般采用5-10min。 引起酶促反應(yīng)速度增加或下降的原因很多，如：底物濃度下降、產(chǎn)物對(duì)酶

18、的抑制、由于產(chǎn)物濃度增加而加速了逆反應(yīng)、酶變性等。因此，為了排除上述干擾，酶活力應(yīng)該用酶促反應(yīng)的初速度來(lái)表示。2022/7/1436生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2、酶活力單位（1）國(guó)際單位國(guó)際生物化學(xué)協(xié)會(huì)酶學(xué)委員會(huì)對(duì)酶活力單位作了下列規(guī)定：在25、最適pH、飽和底物濃度的反應(yīng)條件下，1min內(nèi)將1微摩爾(mol)的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量，定為一個(gè)國(guó)際單位， （1U1molmin ）。 如果底物分子有一個(gè)以上可被作用的化學(xué)鍵，則一個(gè)酶活力單位，便是 1min 使 1mol 有關(guān)基團(tuán)轉(zhuǎn)化所需要的酶量。2022/7/1437生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（2）Kat為了使酶活力單位與國(guó)際單位制中的反應(yīng)速度（m

19、ol /s ）相一致，1972 年國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)正式推薦用 Kat（Katal，催量）作為酶活力單位。 規(guī)定為：在最適條件下，每秒鐘內(nèi)能使 1mol 底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物所需要的酶量，定為一個(gè)Kat 單位（1Kat 1mo1s）。Kat 與國(guó)際單位 (IU ) 的互算關(guān)系如下： 1 Kat 6107 U 1 U 16.6710-9 Kat 16.67 nKat2022/7/1438生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（3）習(xí)慣酶活力單位在實(shí)際使用中，比較方便、直觀，規(guī)定的酶活力單位。不同酶有各自的規(guī)定，如：-淀粉酶活力單位：每小時(shí)分解1g可溶性淀粉的酶量為一個(gè)酶單位。糖化酶活力單位：在規(guī)定條件下，每小時(shí)轉(zhuǎn)化可溶性

20、淀粉產(chǎn)生1mg還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需的酶量為一個(gè)酶單位。蛋白酶：規(guī)定條件下，每分鐘分解底物酪蛋白產(chǎn)生1g酪氨酸所需的酶量。DNA限制性內(nèi)切酶：推薦反應(yīng)條件下，一小時(shí)內(nèi)可完全消化1g純化的DNA所需的酶量。2022/7/1439生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg酶的比活力每毫克酶蛋白（酶制劑）所含的酶活力單位數(shù)稱為酶的比活力，用 Umg 蛋白表示。酶的比活力是酶制劑的一個(gè)純度指標(biāo)。對(duì)同一種酶來(lái)說(shuō)，比活力愈高，表明酶純度愈高。2022/7/1440生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg酶活力的測(cè)定方法： 分光光度法、熒光分光光度法 、同位素標(biāo)記法、電化學(xué)法、紫外可見(jiàn)分光光度法、 酶偶聯(lián)法 等主要是測(cè)反應(yīng)初速度反應(yīng)時(shí)間一般采

21、用5-10min。只要測(cè)定方法足夠靈敏準(zhǔn)確，原則上，反應(yīng)時(shí)間愈短愈好。（二）酶活力的測(cè)定方法2022/7/1441生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg四、酶的分離和純化酶在生物細(xì)胞中的分布，分兩類（1）胞內(nèi)酶：在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，并在細(xì)胞內(nèi)起催化作用。疾病診斷指標(biāo)（2）胞外酶：在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用。大都是水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶。2022/7/1442生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg酶分離純化的原則：在整個(gè)分離純化過(guò)程中要始終保持酶的活性。防止變性失活！低溫、快速酶活性的測(cè)定應(yīng)始終貫穿于整個(gè)分離純化過(guò)程中，以便于監(jiān)測(cè)酶活性的變化、掌握酶的純化程度，選擇和確定酶的分離純化方法。2022/7/1443

22、生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg酶的提取、分離純化技術(shù)路線細(xì)胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液離心分離，過(guò)濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。2022/7/1444生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（一）材料選擇和預(yù)處理酶的分離純化在材料選擇、細(xì)胞破碎、粗制品的獲得以及分離純化方面與蛋白質(zhì)十分相似。2022/7/1445生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（二）細(xì)胞破碎許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。1）機(jī)械破碎2）物理破碎3）化學(xué)破碎4）酶解破碎JY92-II D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞破碎珠高壓細(xì)胞破碎機(jī)DY89-I型 電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)2022

23、/7/1446生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法 物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法 化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過(guò)各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理本章目錄2022/7/1447生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶?/p>

24、中的過(guò)程。也稱為酶的抽提。酶提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?、水提取法：酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷?、稀堿、稀鹽溶液等進(jìn)行提取，2、有機(jī)溶劑提取法：有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。 提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過(guò)程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。（三）酶的提取2022/7/1448生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（四）分離純化鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法、色譜法均可用于酶的分離純化，特別是親和層析法在酶的分離純化過(guò)程中占有重要地位。202

25、2/7/1449生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（五）酶的保存（1）干燥：干燥器（加干燥劑）（2）低溫：04冰箱、低溫冰箱-25-50、液氮-196（3）防腐劑和穩(wěn)定劑防腐劑：甲苯、氯仿、苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸、山梨酸鉀、丙酸鈣穩(wěn)定劑：硫酸銨、甘油、蔗糖或酶的底物輔基等2022/7/1450生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg第二節(jié) 酶的命名與分類目前已發(fā)現(xiàn)4000種酶。一、酶的命名1、習(xí)慣命名法（1）底物名稱， 脲酶、淀粉酶、蛋白酶（2）反應(yīng)性質(zhì)， 脫氫酶、加氧酶、轉(zhuǎn)氨酶（3）兩者結(jié)合， 琥珀酸脫氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（4）酶的來(lái)源， 胃蛋白酶、木瓜蛋白酶 混亂2022/7/1451生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2.國(guó)際系統(tǒng)命

26、名法基本原則：明確標(biāo)明酶的底物及催化反應(yīng)的性質(zhì)（底物為水時(shí)可略去不寫）。底物1：底物2 反應(yīng)類型 如：琥珀酸：FAD氧化還原酶2022/7/1452生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg3、 國(guó)際系統(tǒng)分類法及編號(hào)（EC編號(hào)）（1）按反應(yīng)性質(zhì)分六大類，用1、2、3、4、5、6表示。（2）根據(jù)底物中被作用的基團(tuán)或鍵的特點(diǎn)，將每一大類分為若干個(gè)亞類，編號(hào)用1、2、3 等。（3）每個(gè)亞類又可分為若干個(gè)亞一亞類，用編號(hào)1、2、3等表示。每一個(gè)酶的編號(hào)由4個(gè)數(shù)字組成，中間以“”隔開(kāi)。第一個(gè)數(shù)字表示大類，第二個(gè)數(shù)字表示亞類，第三個(gè)表示亞-亞類，第四個(gè)數(shù)字表示在亞-亞中的編號(hào)?？梢陨暇W(wǎng)（/enzyme/）查到酶的系統(tǒng)名稱和E

27、C編號(hào)。2022/7/1453生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg例如：乙醇脫氫酶EC ，乳酸脫氫酶EC7 ， 蘋果酸脫氫酶EC7第一個(gè)數(shù)字表示大類： 氧化還原第二個(gè)數(shù)字表示反應(yīng)基團(tuán)：醇基第三個(gè)數(shù)字表示電子受體：NAD+或NADP+第四個(gè)數(shù)字表示此酶底物：乙醇，乳酸，蘋果酸。 2022/7/1454生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（一）根據(jù)酶蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分類可分為：?jiǎn)误w酶、寡聚酶、多酶復(fù)合體（1）單體酶由一條多肽鏈組成的酶分子，通常為水解酶。相對(duì)分子量1.31043.5104如：溶菌酶、羧肽酶等 牛胰RNase 124aa 單鏈 雞卵清溶菌酶 129aa 單鏈二、酶的分類與常見(jiàn)酶實(shí)例2022/7/1455生物化學(xué)2酶

28、化學(xué)zjg2022/7/1456生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（2） 寡聚酶含多條肽鏈、多個(gè)亞基。相對(duì)分子量3.5104。 含相同亞基的寡聚酶：蘋果脫胱氫酶（鼠肝），2個(gè)相同的亞基含不同亞基的寡聚酶：琥珀酸脫氫酶（牛心），、2個(gè)亞基寡聚酶中亞基的聚合，有的與酶的專一性有關(guān)，有的與酶活性中心形成有關(guān)，有的與酶的調(diào)節(jié)性能有關(guān)。大多數(shù)寡聚酶是胞內(nèi)酶，而胞外酶一般是單體酶。2022/7/1457生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2022/7/1458生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（3） 多酶復(fù)合體（多酶體系）由兩個(gè)或兩個(gè)以上的酶，相互組織而成，其中每一個(gè)酶催化一個(gè)反應(yīng)，所有反應(yīng)依次進(jìn)行，構(gòu)成一個(gè)代謝途徑或代謝途徑的一部分。例如：

29、大腸桿菌丙酮酸脫氫酶復(fù)合體由三種酶組成丙酮酸脫氫酶（E1） ， 以二聚體存在 29600硫辛酸轉(zhuǎn)乙?；福‥2） 70000二氫硫辛酸脫氫酶（E3） ， 以二聚體存在 256000 12個(gè)E1 二聚體 2496000 24個(gè)E2 單體 2470000 6個(gè)E3 二聚體 1256000 總分子量：560萬(wàn)2022/7/1459生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg第二節(jié) 酶的分類和命名（二）按照催化反應(yīng)的類型分類國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)制定的“國(guó)際系統(tǒng)分類法”將酶分為六大類:1.氧化還原酶: 催化氧化還原反應(yīng)的酶。如，乳酸脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)2022/7/1460生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2.轉(zhuǎn)移酶：催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即

30、將一個(gè)底物分子上的基團(tuán)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)底物的分子上。例如，谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)：2022/7/1461生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg3.水解酶：催化底物的加水分解反應(yīng)。包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶催化的脂的水解反應(yīng)：2022/7/1462生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg4.裂解酶（裂合酶）：催化從底物上移去某些基團(tuán)而形成雙鍵的（非水解性）反應(yīng)或其逆反應(yīng)的酶。主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。 例如：醛縮酶裂解 1, 6-二磷酸果糖，生成磷酸二羥丙酮和3-磷酸甘油醛2022/7/1463生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg5.異構(gòu)酶：催化同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)變，即底物分子內(nèi)基團(tuán)或原子的重排過(guò)程的酶。例如，

31、6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。2022/7/1464生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg6.合成酶：又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 鍵的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。 A + B + ATP + H-O-H =AB + ADP +Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸2022/7/1465生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2022/7/1466生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg一、酶的活性部位（一）酶的活性中心酶分子量很大，直接與底物接觸和起催化作用的只是很小部分，占酶總體積的1%2%。酶活性中心：酶分子中結(jié)合底物并起催化作用的部位。包括底物結(jié)合部位、催化部

32、位。活性中心出現(xiàn)頻率最高的氨基酸殘基：Ser、His、Cys、Tyr（酪）、Asp、Glu、Lys。第三節(jié) 酶的催化機(jī)理2022/7/1467生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2022/7/1468生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg酶的必需基團(tuán)與非必需基團(tuán)表現(xiàn)酶催化活力所必需的部分稱為必需基團(tuán)。必需基團(tuán)包括活性中心和維持酶分子高級(jí)結(jié)構(gòu)所需的基團(tuán)。酶分子分為4類殘基：（1）接觸殘基：（2）輔助殘基：（3）結(jié)構(gòu)殘基：（4）非貢獻(xiàn)殘基：2022/7/1469生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（1）接觸殘基：結(jié)合基團(tuán)，催化基團(tuán)，負(fù)責(zé)底物的結(jié)合與催化。（2）輔助殘基：不與底物接觸，輔助酶與底物結(jié)合，協(xié)助接觸殘基。上述兩類殘基構(gòu)成酶活性中心

33、。（3）結(jié)構(gòu)殘基：維持酶分子三維構(gòu)象，與酶活性相關(guān)，但不在酶活性中心范圍內(nèi)，屬于酶活性中心以外的必需殘基上述三類殘基統(tǒng)稱酶的必需基團(tuán)（4）非貢獻(xiàn)殘基（非必需基團(tuán)）：與酶活性無(wú)關(guān)，可能對(duì)酶的免疫、活性調(diào)節(jié)、運(yùn)輸、壽命、防止降解等方面起作用。 2022/7/1470生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2022/7/1471生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg接觸殘基：R1、R2、R6、R8、R9、R163輔助殘基：R3、R4、R5、R164、R165結(jié)構(gòu)殘基：R10、R162、R169非貢獻(xiàn)殘基：其它2022/7/1472生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（二）研究酶活性中心的方法酶活性中心的測(cè)定1）切除法2）化學(xué)修飾法：此方法是研究最

34、早，應(yīng)用最廣泛的方法。原則上講，酶分子側(cè)鏈上的各種基團(tuán)，如羧基、羥基、巰基和咪唑基等均可由特定的化學(xué)試劑進(jìn)行共價(jià)修飾。當(dāng)它被某一化學(xué)試劑修飾后，若酶活性顯著下降或喪失，則可初步推斷該基團(tuán)為酶的必需基團(tuán)。 2022/7/1473生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2022/7/1474生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg3）X射線衍射法 采用X射線衍射法在研究酶活性中心空間構(gòu)象時(shí)，通常是將酶與底物類似物或?qū)Ｒ恍砸种苿┬纬蓮?fù)合物，而后作X射線衍射分析，從而得到有關(guān)酶活性中心構(gòu)象、酶與底物的接觸狀況以及催化機(jī)理的信息。2022/7/1475生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg二、影響酶催化效率的有關(guān)因素（一）底物和酶的鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng)變分

35、子間反應(yīng)為分子內(nèi)反應(yīng)鄰近效應(yīng)：酶與底物形成中間復(fù)合物后使底物之間、酶的催化基團(tuán)與底物之間相互靠近，提高了反應(yīng)基團(tuán)的有效濃度。定向效應(yīng)：由于酶的構(gòu)象作用，底物的反應(yīng)基團(tuán)之間、酶與底物的反應(yīng)基團(tuán)之間正確取向的效應(yīng)酶把底物分子從溶液中富集出來(lái)，使它們固定在活性中心附近，反應(yīng)基團(tuán)相互鄰近，同時(shí)使反應(yīng)基團(tuán)的分子軌道以正確方位相互交疊，反應(yīng)易于發(fā)生。2022/7/1476生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2022/7/1477生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng)對(duì)反應(yīng)速度的影響：使底物濃度在活性中心附近很高酶對(duì)底物分子的電子軌道具有導(dǎo)向作用酶使分子間反應(yīng)轉(zhuǎn)變成分子內(nèi)反應(yīng)鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)對(duì)底物起固定作用 2022

36、/7/1478生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（二）底物的形變和誘導(dǎo)契合 酶中某些基團(tuán)可使底物分子的敏感鍵中某些基團(tuán)的電子云密度變化，產(chǎn)生電子張力，降低了底物的活化能酶從低活性形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚孕问?，利于催化。底物形變，利于形成ES復(fù)合物。底物構(gòu)象變化，過(guò)度態(tài)結(jié)構(gòu)，大大降低活化能。2022/7/1479生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（三） 酸堿催化酶分子的一些功能基團(tuán)起瞬時(shí)質(zhì)子供體或質(zhì)子受體的作用。如：Asp、Glu、His、Lys、Ser、Arg等影響酸堿催化反應(yīng)速度的兩個(gè)因素（1）酸堿強(qiáng)度(pK值）。組氨酸咪唑基的解離常數(shù)為6，在pH6附近給出質(zhì)子和結(jié)合質(zhì)子能力相同，是最活潑的催化基團(tuán)。（2）給出質(zhì)子或結(jié)合質(zhì)

37、子的速度。咪唑基最快，半壽期小于10-10秒2022/7/1480生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（四） 共價(jià)催化酶作為親核基團(tuán)或親電基團(tuán)，與底物形成一個(gè)反應(yīng)活性很高的共價(jià)中間物ES 。 下頁(yè)表列出能形成共價(jià)ES復(fù)合物的某些酶酶親核基團(tuán)：Ser-OH、Cys-SH、His-N：底物親電中心：磷酰基（-P=O）、酰基（-C=O）、糖基（Glu-C-OH）2022/7/1481生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2022/7/1482生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（五） 活性中心的微環(huán)境效應(yīng)（1）疏水環(huán)境介電常數(shù)低，加強(qiáng)極性基團(tuán)間的作用。（2）電荷環(huán)境在酶活性中心附近，往往有一電荷離子，可穩(wěn)定過(guò)渡態(tài)的離子 2022/7/1483

38、生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg第四節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和影響因素酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：研究酶促反應(yīng)的速度以及影響酶促反應(yīng)速度的各種因素。影響酶促反應(yīng)速度的因素：底物濃度、酶濃度、pH、溫度、激活劑與抑制劑等。2022/7/1484生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg一、酶反應(yīng)速率反應(yīng)速率是以單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)物或生成物濃度的改變來(lái)表示。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)物逐漸消耗，分子碰撞的機(jī)會(huì)也逐漸漸小，因此反應(yīng)速率也隨著減慢因?yàn)槊恳凰查g的反應(yīng)速率都不相同，所以用瞬時(shí)速率表示反應(yīng)速率。2022/7/1485生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg反應(yīng)分子數(shù)和反應(yīng)級(jí)數(shù)1.反應(yīng)分子數(shù)2.反應(yīng)級(jí)數(shù)反應(yīng)分子數(shù)是在反應(yīng)中真正相互作用的分子數(shù)目。有一個(gè)反應(yīng)的分子參加的

39、反應(yīng)為單分子反應(yīng)。有兩個(gè)反應(yīng)的分子參加的反應(yīng)為雙分子反應(yīng)。3個(gè)分子同時(shí)反應(yīng)的幾率很小。總反應(yīng)速率與濃度的關(guān)系能以單分子反應(yīng)的速率方程式表示，為一級(jí)反應(yīng)。以雙分子反應(yīng)的速率方程式表示，為二級(jí)反應(yīng)。2022/7/1486生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg各級(jí)反應(yīng)的特征（一）一級(jí)反應(yīng) 反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度呈正比。一級(jí)反應(yīng)的半衰期與反應(yīng)的速率常數(shù)k成反比，而與反應(yīng)物的起始濃度無(wú)關(guān)。對(duì)于一個(gè)給定的反應(yīng)，根據(jù)t12可判斷一個(gè)反應(yīng)是否是一級(jí)反應(yīng)。反應(yīng)物反應(yīng)到一半的時(shí)間是個(gè)常數(shù)，稱為半衰期t1/22022/7/1487生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（二）二級(jí)反應(yīng) 反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度的二次方（兩種底物濃度的乘積）成正比。二級(jí)反應(yīng)

40、 的半衰期不僅與反應(yīng)速率常數(shù)有關(guān)，而且與初始反應(yīng)物濃度有關(guān)。2022/7/1488生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（三）零級(jí)反應(yīng) 反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度無(wú)關(guān)。零級(jí)反應(yīng)的半衰期與底物初始濃度成正比，與反應(yīng)速率常數(shù)成反比。2022/7/1489生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（四）反應(yīng)速率、平衡常數(shù)與活化能之間的關(guān)系反應(yīng)平衡常數(shù)與活化能成反比，平衡常數(shù)越大越利于平衡。反應(yīng)速率與活化能成反比，活化能越低，反應(yīng)速率越高。2022/7/1490生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg二、酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)影響酶促反應(yīng)速度的各種因素，包括：底物濃度、酶濃度、pH、溫度、 激活劑與抑制劑等。底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響1902年，Brown等在研究-呋

41、喃糖苷酶水解蔗糖時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蔗糖濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度時(shí)，反應(yīng)速率與蔗糖濃度無(wú)關(guān)，即零級(jí)反應(yīng)。2022/7/1491生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg酶的中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)Brown（1902）和Henri（1903）提出：酶的高效催化效率是由于酶（E）首先與底物（S）結(jié)合，生成不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物ES ；然后分解為反應(yīng)產(chǎn)物（P）而釋放出酶。式中：E：酶 S：底物 P：產(chǎn)物 ES：中間產(chǎn)物 K1、K2、K3： 分別代表反應(yīng)速度常數(shù)2022/7/1492生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg酶的中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)的直接證據(jù)：胰凝乳蛋白酶（又稱糜蛋白酶）催化對(duì)硝基苯乙酸酯的水解，得到中間產(chǎn)物（在PH3時(shí)）乙酰凝乳蛋白酶。2022/7/1493生物

42、化學(xué)2酶化學(xué)zjg底物濃度與反應(yīng)速度的關(guān)系曲線： 20世紀(jì)初由實(shí)驗(yàn)觀察到，底物對(duì)酶促反應(yīng)的飽和現(xiàn)象：在酶濃度不變時(shí)，不同的底物濃度與反應(yīng)速度的關(guān)系曲線。 （1）即當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，反應(yīng)速度的增加與底物濃度的增加成正比（一級(jí)反應(yīng)）；（2）隨底物濃度的增加，反應(yīng)速度的增加量逐漸減少（混合級(jí)反應(yīng)、正變）；（3）當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥揭欢繒r(shí)，反應(yīng)速度達(dá)到一最大值，不再隨底物濃度的增加而增加（零級(jí)反應(yīng)）。2022/7/1494生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2022/7/1495生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（一） 米氏方程的提出Michaelis和Menten 1913年式中：v為反應(yīng)速率； Vmax為最大反應(yīng)速率； S為

43、底物濃度； Km為底物解離常數(shù)（米氏常數(shù)）。2022/7/1496生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg米式方程很好地解釋了v和S的關(guān)系曲線（矩形雙曲線）當(dāng) S Km時(shí)， v與S 成正比；當(dāng) S 繼續(xù)增加， v與S 正變；當(dāng) S Km時(shí)， vVmax，與S 無(wú)關(guān)；2022/7/1497生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（二）米氏常數(shù)的意義1、Km的實(shí)際意義是：當(dāng)反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)底物的濃度。即當(dāng)反應(yīng)速度v=1/2 Vmax時(shí)， Km = S，單位：molL-1或mmolL-1下表列出 一些酶的Km值。2022/7/1498生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2022/7/1499生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2022/7/1410

44、0生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2、 Km可以用來(lái)判斷酶促反應(yīng)的級(jí)數(shù)。如果KmS, 反應(yīng)速率與底物濃度無(wú)關(guān)，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。如果Km S,反應(yīng)速率與底物濃度成正比，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)。3、Km是酶的特征常數(shù)之一。 對(duì)固定的底物、溫度、pH，Km值是唯一的。4、Km可以近似地表示酶對(duì)底物親和力的大小。 Km值小，表明親和力大；Km值大，表明親合力小5、Km可以判斷達(dá)到最大催化效率時(shí)需要的底物濃度。2022/7/14101生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg6、 Km可以用來(lái)確定天然底物。同一種酶有幾種底物就有幾個(gè)Km ，Km最小的底物稱該酶的最適底物或天然底物。7、kcat/ Km可以用來(lái)比較酶催化的效率，常常將kcat

45、和 Km一起用于酶動(dòng)力學(xué)研究。Kcat酶的催化常數(shù)或酶的轉(zhuǎn)換數(shù)，等于每個(gè)酶分子（或是每個(gè)活性部位）每秒鐘轉(zhuǎn)換底物（轉(zhuǎn)換成產(chǎn)物）的最大分子數(shù)，在數(shù)值上kcat等于Vmax除以總酶濃度。2022/7/14102生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（三）米氏方程的適用范圍雙底物反應(yīng)米氏方程是根據(jù)單底物推導(dǎo)出來(lái)的，但也適用于雙底物反應(yīng)。較為常見(jiàn)的是雙底物雙產(chǎn)物反應(yīng)，稱為bibi反應(yīng)： A+BP+Q雙底物反應(yīng)按動(dòng)力學(xué)機(jī)制可分為：順序序列反應(yīng)、隨機(jī)序列反應(yīng)、乒乓反應(yīng)。2022/7/14103生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg1、順序序列反應(yīng)（依次反應(yīng)）機(jī)理如：需要NAD+或NADP+的脫氫酶的反應(yīng)就屬于這種類型。輔酶作為底物A先與

46、酶生成EA，再與底物B生成三元復(fù)合物EAB，脫氫后生成產(chǎn)物P，最后放出還原型輔酶NADH或NADPH。2022/7/14104生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2、隨機(jī)序列反應(yīng)底物的加入和產(chǎn)物的放出都是隨機(jī)的，無(wú)固定順序。如肌酸激酶(CK)催化的反應(yīng)：2022/7/14105生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg3.乒乓反應(yīng)底物和產(chǎn)物是交替地與酶結(jié)合或從酶釋放，好像打乒乓球一樣，故稱乒乓反應(yīng)。如己糖激酶（HK）催化的反應(yīng)：2022/7/14106生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（四） Km和Vmax的求解方法Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法2022/7/14107生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg三、 抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響變

47、性作用(denaturation)：抑制作用(inhibiton)：（在酶不變性情況下），使酶的活性降低或喪失的現(xiàn)象，稱為酶的抑制作用。能夠引起酶的抑制作用的物質(zhì)稱為抑制劑。 2022/7/14108生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg研究抑制劑對(duì)酶的作用有重大的意義：（1）藥物作用機(jī)理和抑制劑型藥物的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)（2）了解生物體的代謝途徑，進(jìn)行人為調(diào)控或代謝控制發(fā)酵（3）通過(guò)抑制劑試驗(yàn)，研究酶活性中心的構(gòu)象及其化學(xué)功能基團(tuán)，不僅可以設(shè)計(jì)藥物，而且也是酶工程和化學(xué)修飾酶、酶工業(yè)的基礎(chǔ)2022/7/14109生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（一）抑制作用的類型根據(jù)抑制劑與酶的作用方式以及抑制作用是否可逆，分為兩種類型：可

48、逆抑制作用、不可逆抑制作用。（二）可逆的抑制作用 抑制劑與酶蛋白非共價(jià)鍵結(jié)合，可以用透折、超濾等物理方法除去抑制劑而使酶復(fù)活?？煞譃椋喝N類型競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。2022/7/14110生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg1、競(jìng)爭(zhēng)性抑制（Competitive inhibition）抑制劑（I）具有與底物類似的結(jié)構(gòu)，競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心，并與酶形成可逆的EI復(fù)合物，阻止底物與酶結(jié)合。例如：丙二酸、戊二酸對(duì)琥珀酸脫氫酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制2022/7/14111生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的米氏方程：2022/7/14112生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg交于y軸Vmax不變Km變大，而且隨I濃度

49、的增大而增大2022/7/14113生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用特點(diǎn)：（1）抑制劑與底物結(jié)構(gòu)相似；（2）I一定，增加S，可減少抑制程度；（3）酶的Vmax不變，Km變大。2022/7/14114生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制底物和抑制劑可以同時(shí)與酶結(jié)合，但是，中間的三元復(fù)合物ESI不能進(jìn)一步分解為產(chǎn)物，因此，酶的活性降低。抑制劑與酶活性中的以外的基團(tuán)結(jié)合，其結(jié)構(gòu)可能與底物無(wú)關(guān)。2022/7/14115生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg不能通過(guò)增加底物的濃度的辦法來(lái)消除非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用某些重金屬離子對(duì)酶的抑制屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制：Cu2+、Hg2+、Pb2+。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的米氏方程：2022

50、/7/14116生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg交于x軸 特點(diǎn)：Km不變，Vmax下降 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制較為復(fù)雜， 上圖KI=KI,；教材p81圖2-15 KIKI。2022/7/14117生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2022/7/14118生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg3、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制抑制劑不能與游離酶結(jié)合，只與ES復(fù)合物結(jié)合形成ESI，形成的ESI不能轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。常見(jiàn)于多底物的酶促反應(yīng)中。2022/7/14119生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg特點(diǎn)：Km減小，Vmax減小2022/7/14120生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2022/7/14121生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg4、常見(jiàn)的可逆抑制劑（1）磺胺類藥物磺胺類藥物是競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，如對(duì)

51、氨基苯磺胺。它與對(duì)氨基苯甲酸相似，可抑制細(xì)菌二氫葉酸合成酶，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。如復(fù)方新諾明(復(fù)方磺胺甲基異噁唑、CoSMZ)。人體可利用食物中的葉酸，而細(xì)菌不能利用外源的葉酸，所以對(duì)此類藥物敏感。抗菌增效劑TMP可增強(qiáng)磺胺的藥效，因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)與二氫葉酸類似，可抑制細(xì)菌二氫葉酸還原酶，但很少抑制人體二氫葉酸還原酶。2022/7/14122生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2022/7/14123生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（2）膽堿酯酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑植物中的某些生物堿如蕈(xun)毒堿、毒扁豆堿是膽堿酯酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，含季銨基團(tuán)，與乙酰膽堿類似，能抑制膽堿酯酶活力。（3）抗癌藥物：5-氟尿嘧啶、氨基葉酸也是競(jìng)

52、爭(zhēng)性抑制劑2022/7/14124生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（三） 不可逆抑制抑制劑與酶反應(yīng)中心的活性基團(tuán)以比較牢固的共價(jià)鍵和酶結(jié)合，引起酶的永久性失活。不能用透析的方法除去。按照不可逆抑作用的選擇性不同,又可分為專一性不可逆抑制和非專一性不可逆抑制兩類。專一性不可逆抑制只能與活性部位的基團(tuán)反應(yīng)，非專一性不可逆抑制可與多種基團(tuán)反應(yīng)。如對(duì)活性部位基團(tuán)的親和力比對(duì)其他基團(tuán)大三個(gè)數(shù)量級(jí)，即為專一性抑制劑。有時(shí)因作用對(duì)象及條件不同，某些非專一性抑制劑會(huì)轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生專一性抑制作用。2022/7/14125生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg常見(jiàn)的不可逆抑制劑（1）有機(jī)磷化合物 可與酶中與酶活力直接相關(guān)的絲氨酸上的羥基牢固結(jié)

53、合，從而抑制某些蛋白酶及酯酶，是專一性抑制劑。此類化合物強(qiáng)烈抑制膽堿酯酶，使乙酰膽堿堆積，引起一系列神經(jīng)中毒癥狀，又稱為神經(jīng)毒劑。二戰(zhàn)中使用過(guò)的DFP（二異丙基氟磷酸 ）及有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑都屬于此類。當(dāng)有大量底物存在時(shí)，底物先與酶的活性部位結(jié)合，抑制作用就會(huì)減弱，稱為底物保護(hù)作用。有機(jī)磷與酶結(jié)合后雖不解離，但有時(shí)可用肟化物（含-CH=NOH基）或羥肟酸把酶上的磷酸根除去，使酶恢復(fù)活性。臨床上用的解磷定(PAM)就是此類化合物。2022/7/14126生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（2）有機(jī)砷、汞化合物 此類物質(zhì)與巰基作用，抑制含巰基的酶。如對(duì)氯汞苯甲酸，可用過(guò)量巰基化合物如半胱氨酸或還原型谷胱甘肽解除。砷

54、化物可破壞硫辛酸輔酶，從而抑制丙酮酸氧化酶系統(tǒng)。路易斯毒氣(CHCl=CHAsCl2)能抑制幾乎所有的巰基酶。砷化物的毒性不能用單巰基化合物解除，可用過(guò)量雙巰基化合物解除，如二巰基丙醇等，是臨床上重要的砷化物及重金屬中毒的解毒劑。2022/7/14127生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg（3）氰化物 與含鐵卟啉的酶（如細(xì)胞色素氧化酶）中的Fe2+結(jié)合，使酶失活而抑制細(xì)胞呼吸。（4）重金屬 銀、銅、鉛、汞等鹽類能使大多數(shù)酶失活，可用螯合劑如EDTA解除。可能是與酶分子中的巰基發(fā)生反應(yīng)，或置換酶中的金屬離子。（5）烷化劑 主要是含鹵素的化合物，如碘乙酸、碘乙酰胺、鹵乙酰苯等，是一種非專一性抑制劑，可以烷化巰基

55、，使酶失活。常用于鑒定酶中巰基。 2022/7/14128生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg四、 溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響最適溫度及影響因素 溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響有兩個(gè)方面： 提高溫度，加快反應(yīng)速度；提高溫度，酶變性失活。溫度系數(shù)Q10：溫度升高10，反應(yīng)速度與原來(lái)的反應(yīng)速度之比，大多數(shù)酶的Q10一般為12。溫血?jiǎng)游锏拿?，最適溫度3540，植物酶最適溫度4050，細(xì)菌Taq DNA聚合酶70。2022/7/14129生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2022/7/14130生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2022/7/14131生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg最適溫度是使酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大時(shí)的溫度。最適溫度不是酶的特征常數(shù)，它與底

56、物種類、作用時(shí)間、pH、離子強(qiáng)度 等因素有關(guān)。酶的保存：酶濃度高、有底物、抑制劑和保護(hù)劑會(huì)使穩(wěn)定。液體酶制劑可以利用上述因素，低溫短暫保存。凍干粉可在在低溫冰箱中較長(zhǎng)期保存。2022/7/14132生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg五、 pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響1. pH影響酶活力的因素影響酶蛋白構(gòu)象，過(guò)酸或過(guò)堿會(huì)使酶變性。影響酶和底物分子解離狀態(tài)，尤其是酶活性中心的解離狀態(tài)，最終影響ES形成。影響酶和底物分子中另外一些基團(tuán)解離，這些基團(tuán)的離子化狀態(tài)影響酶的專一性及活性中心構(gòu)象。 2022/7/14133生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg2酶的最適pH和穩(wěn)定性pH最適pH：使酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大時(shí)介質(zhì)的pH。2022

57、/7/14134生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg最適pH與底物種類、濃度及緩沖液成分有關(guān)。雖然大部分酶的pH酶活曲線是鐘形，但也有半鐘形甚至直線形。2022/7/14135生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg六、 激活劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響凡是能提高酶活性的物質(zhì)，都稱為激活劑。1、無(wú)機(jī)離子如Mg2+、K+、Mn2+、Co2+、Cl-等2、簡(jiǎn)單有機(jī)化合物對(duì)酶的激活3、蛋白質(zhì)對(duì)酶原的激活2022/7/14136生物化學(xué)2酶化學(xué)zjg1、 無(wú)機(jī)離子的激活作用（1）金屬離子：K+ 、Na+、Mg2+ 、Zn2+、Fe 2+ 、Ca2+（2）陰離子：cl-、Br -、PO43-（3）氫離子不同的離子激活不同的酶。不同離子之間有拮抗作用和可替代作用，如Na+與K+、Mg2+與Ca2+之間常常拮抗，但Mg2+與Zn2+?？商娲?。